Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Introduction

Paciente xenotransplantes derivados são cada vez mais populares modelos experimentais utilizadas para a investigação do cancro. Eles podem ser usados ​​para a caracterização de biomarcadores e vias biológicas, avaliação pré-clínica da eficácia do medicamento, e criação de avatares para terapias de câncer personalizado ^1,2. Previamente, outros grupos de pesquisa têm desenvolvido modelos PDX quer por implantação ou injecção de suspensões de células tumorais únicas ou explantes de tumores em ratinhos inteiro ¹ imunocomprometidos. Estes PDX modelos exige a recolha cirúrgica do tumor sólido fresco, ascite maligna ou derrame pleural de um paciente submetido a um procedimento cirúrgico que é caro e expõe o paciente a um risco aumentado de morbidade iatrogênica.

Um desenvolvimento recente importante na investigação do cancro tem sido a detecção, isolamento e caracterização de células tumorais circulantes. Estas células tumorais escapar da massa do tumor primário e entra na circulaçãoonde eles desempenham um papel crítico na metástase e recidiva, a causa mais comum de cancro relacionados com a mortalidade ^3. A avaliação e caracterização dos CTC a partir de vários tipos de tumores sólidos forneceram informação clínica para o diagnóstico, prognóstico e monitorização da doença residual ^3. Uma variedade de abordagens actualmente usados ​​dependem tanto nas propriedades físicas, à expressão dos biomarcadores ou as características funcionais do CTC pode ser utilizado para isolar CTC ⁴ eficientemente. Métodos existentes macroescala isolamento CTC incluem centrifugação em gradiente de densidade, de filtração com poros de filtro física e separação contra moléculas da superfície. As metodologias de isolamento mais amplamente utilizados baseiam-se no CTC captura à base de anticorpo da CTC. Tanto a selecção positiva e negativa de marcadores de superfície celular podem ser empregues para isolar CTC partir de sangue periférico. A selecção positiva para a CTC na circulação periférica geralmente usa marcadores epiteliais (por exemplo, que um EpCAM)está expressa em células CTC mas não hematopoiéticas. A desvantagem deste método é que CTC com potencial metastático têm muitas vezes sido submetidos epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), que regula negativamente a marcadores de superfície epitelial ^3. A fim de isolar CTC com potencial metastático, uma metodologia de selecção negativa que utiliza o marcador de superfície hematopoiéticas, CD45, para esgotar a população de células normais de leucócitos pode ser utilizado ^5.

O câncer de próstata é o câncer mais comumente diagnosticado e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em homens ^6. Os mecanismos de progressão tumoral e agressividade não são completamente compreendidos e, por conseguinte, a geração e caracterização de modelos experimentais que recapitulam a heterogeneidade molecular de cancro da próstata são de interesse significativo. PDX modelos de câncer de próstata têm sido gerado anteriormente pelo enxerto de células cancerosas humanas da próstata em immunocomcamundongos prometidos ^7,8. No entanto, a geração de tais modelos tem sido dificultada pela baixa taxa de enxerto de cancro da próstata em ratinhos imunocomprometidos, a qual é atribuída principalmente à natureza indolente da doença. Recentemente, CTC foram usadas para gerar o cancro da mama ^9, cancro do pulmão e cancro da próstata ^{10 11 modelos} PDX. Estes estudos de prova de conceito introduzido a possibilidade de gerar modelos PDX independente da necessidade de recolha de amostra cirúrgica. Neste artigo vamos descrever em detalhes um método para a geração deste modelo experimental romance.

Protocol

Este protocolo foi realizado em nossa instituição com a aprovação do conselho de ética em pesquisa da instituição e está em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano.

1. Recolha de Sangue Periférico de pacientes com câncer de próstata avançado

Nota: Selecione os pacientes com câncer de próstata metastático. Obter o consentimento escrito do paciente e registrar características clínicas dos pacientes, incluindo idade em isolamento e quimioterapia anterior e tratamentos hormonais. Os doentes com doença metastática potencialmente terão maior concentração de CTC no sangue periférico.

1. Recolha de amostras de sangue, após consentimento informado e no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional apropriado protocolo aprovado. Usar luvas de látex e uma bata de laboratório durante todo o procedimento.
2. Conecte-25 G borboleta agulha e tubos para suporte de agulha. Use um algodão embebido em álcool para limpar a área deveia antecubital entre bíceps e antebraço, em seguida, aplicar torniquete a parte superior do braço do paciente.
3. Insira a agulha na veia antecubital borboleta e empurre tubo de coleta de sangue para suporte de agulha para começar a coleção. Recolha cerca de 10 ml de sangue em tubos de recolha que contêm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para impedir a coagulação.
4. Remova a agulha borboleta do paciente e aplicar pressão com gaze esterilizada sobre o local da punção da veia por 1 min. Local Cubra com uma gaze esterilizada.

2. Isolamento de Células Mononucleares

Nota: O sangue recolhido a partir do passo 1 conterá células mononucleares do sangue periférico (PBMC) (por exemplo, linfócitos e monócitos), para além dos CTC mononucleares.

1. Pipeta todo o sangue em tubo de poliestireno de 50 mL cónico, com uma pipeta de 5 mL e adicionar serológica Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) em uma proporção de 1: 1. Suavemente mistura pipeta para homogeneizar.
2. Adicionar 15 ml de uma solução preparada comercialmente (Ficoll-Paque) para separar componentes de sangue por gradiente de densidade baixa velocidade de centrifugação para um tubo cónico de 50 ml de poliestireno vazio.
3. Pipeta suavemente sangue total e mistura HBSS, a partir do passo 2.1, para dentro do tubo de poliestireno a partir do passo 2.2, para formar a camada superior distinta. Set pipeta a configuração mais baixa para minimizar a mistura de soluções, o que irá garantir a separação eficiente.
4. Centrifuga-se a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente (25 ° C). Definir desaceleração a configuração mais baixa para evitar a mistura de soluções após a separação. A aceleração pode ser ajustado para qualquer velocidade.
5. Após centrifugação, a banda branca identificar-cinza fina camada de PBMC e CTC ensanduichada entre o plasma em solução de topo e de separação no fundo do tubo.
6. Recolher as células a partir da faixa branca-acinzentada no passo 2.5 para um tubo de 50 mL de poliestireno, usando uma pipeta de transferência de plástico.
7. Adicionar HBSS a 50 ml de poliestireno tubo cónico com PBMCs e CTC e Centrifuge novamente a 400 xg durante 10 min temperatura ambiente para lavar.
8. Decantar sedimento líquido e ressuspender em 50 ml de HBSS e centrifugar novamente a 400 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente para lavar.
9. Descartar o sobrenadante, o sedimento restante ressuspender com 5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar a solução durante 5 min à TA.
10. Remover o tampão de lise de glóbulos vermelhos por centrifugação a 400 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
11. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS 1x suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) para bloquear antes da coloração do anticorpo.

3. As células mononucleares com coloração CD45-FITC de anticorpos para fluorescência celular ativado (FACS)

1. Quantificar o número de células viáveis ​​(Trypan Blue-negativa) (do passo 2.11), utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Prepara-se uma ⁶ x 10 células / suspensão de 1 ml (em PBS 1x com 10% de FBS) e colocá-lo em gelo durante 1 hr.
2. Distribua o quantificadosuspensão de células a partir do passo anterior em dois tubos. Tubos de etiquetas de controle e coloração CD45.
3. No tubo de controlo, adicionar IgG1K-FITC (2,5 ug / ml), a uma diluição de 1: 250. No tubo de coloração CD45, CD45 adicionar FITC (2,5 ug / mL) conjugada com o anticorpo primário a uma diluição de 1: 250 e incuba-se as suspensões de células sobre gelo durante 30 min. Rotulagem antigénio CD45 é utilizado para excluir células hematopoiéticas.
4. Centrifugar as células a 400 xg durante 3 min a 4 ° C, e desprezar o sobrenadante.
5. Lavar as células duas vezes, suspendendo cada pellet estéril com 1 x PBS suplementado com FBS a 10%, seguido por centrifugação a 400 xg durante 3 min a 4 ° C.
6. Ressuspender as células numa solução de PBS contendo 1 x 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) a uma concentração de 10 ug / ml 1 ml.
7. Filtrar a solução final através de tampas de filtro 35 um em 12 milímetros tubos de poliestireno x 75 mm.

4. Isolamento de próstata por CTCFACS

Nota: Utilize um citômetro de fluxo para coletar ao vivo CTCs negativos CD45.

1. Defina controles de compensação usando células do tubo rotulado, "Control".
2. Criar portões que excluem detritos e aglomerados de células usando parâmetros para a frente-de dispersão e side-de dispersão apropriados.
3. Estabelecer as portas FITC utilizando as suspensões de células a partir do tubo rotulado, "CD45-FITC."
4. Portão células viáveis ​​(DAPI-negativos) usando o Pacífico azul-A do canal.
5. Recolhe população negativa para CD45 num tubo cónico de 15 ml de poliestireno estéril, contendo 2 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado com FBS a 10%.
6. Centrifugar a suspensão de células de tumor da próstata classificados a 400 xg durante 3 min, em seguida, voltar a suspender as pelotas em 200 - 500 ul de meio RPMI suplementado com FBS a 10%.

5. Injeção de CTCs em ratos e Monitoramento de Crescimento Xenoenxerto

Nota:Realizar todos os procedimentos de animais em conformidade com os protocolos aprovados pelo comitê de cuidados com os animais institucional. Este protocolo foi realizado em nossa instituição no âmbito de um protocolo específico ao Uso de Animais aprovado pelo nosso Comitê Animal Care em conformidade e cumprimento de todas as agências regulatórias e institucionais, regulamentos e orientações relevantes.

1. Misture a suspensão de células de tumor da próstata classificados com matriz extracelular em uma proporção de 1: 1 e o local em gelo.
2. Anestesiar rato antes da implantação subcutânea em uma câmara de fornecimento de 5% (v / v) de isoflurano inalado em 1 L / min de oxigénio. Certifique-se anestesia adequada verificando a perda do reflexo corneal e dedo do pé no mouse.
3. Usando uma agulha G 25 e uma seringa de 1 ml, injectar 250 ul de células de tumor da próstata e na matriz extracelular de células subcutaneamente suspensão em ambos os flancos superiores de um 8-10 semanas de idade do sexo masculino murganho imunodeficiente. Injectar 250 ul, independentemente da concentração de tetracloreto de carbono como o volume de injecção é o ivalor mportant. Administração máxima SQ no rato não é mais do que 1 ml.  
4. Monitorar ratos através da realização de palpação semanal de locais de injecção do mouse para o crescimento de densidades nodulares subcutâneas e medindo os ratos de peso duas vezes por semana.
5. Euthanize ratos por asfixia dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical e colheita subcutâneos xenoenxertos de cancro da próstata humano, quando o tamanho do tumor é mais do que 0,5 cm e menos de 1 cm de maior diâmetro para assegurar tecido tumoral suficiente para análises moleculares e passagem serial. Euthanize camundongos com sinais de sofrimento ou perda de peso, de 15%, apesar de nenhum tumor é palpável.

Representative Results

Este protocolo conduz à geração de modelos de PDX isolados CD45 CTC cancro da próstata negativo. Com base no método de selecção negativa utilizada no nosso protocolo é necessário para excluir as células mortas utilizando DAPI mancha. A percentagem de células CD45 negativas detectada por citometria de fluxo é variável e depende do peso do tumor do paciente (Figura 1A). Coloração de imunofluorescência de células não triados usando CD45 e DAPI (para identificar os núcleos celulares) revela células negativas para CD45, tal como indicado pelas setas brancas (Figura 1B). Na Figura 1C, as densidades nodulares subcutâneos pode ser visto de ambos os flancos do rato. Cada densidade nodular representa crescimento de xenoenxerto e pode ser apreciado como distinto de tecido saudável como sobressai da musculatura dorsal do rato e é mais firme de textura. O intervalo de tempo entre a implantação eo desenvolvimento de xenotransplante pode variar muito, dependendo da carga CTC do patieNT amostra, o número de células implantadas e a agressividade biológica do CTC. Gerado a partir da próstata PDX CTC recapitular tumor da próstata humano, como visto por hematoxilina e eosina, e por imuno-histoquímica para próstata específica marcadores celulares, tais como o receptor de androgénio (AR) e antigénio específico da próstata membrana (PSMA) (Figura 1D).

Figura 1. Geração de cancro da próstata PDX Modelos de Prostate Cancer Humano CTCs. (A) A citometria de fluxo que ilustra a parcela de populações de células específicas de CD45 coloração do sangue periférico de um paciente com cancro da próstata. . As células com DAPI mancha positiva estão mortos e excluídos por gating para garantir que apenas as células viáveis ​​são isolados coloração (B) imunofluorescência CD45 da população não triados confirma presença de CD45 ^-. Células (setas brancas) (C) in vivo e após a colheita tumor (D) Análise de modelos PDX CTC utilizando de Hematoxilina e Eosina e convencional dos marcadores específicos da próstata.; receptor de andrógeno (AR) e antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este manuscrito descreve um método para a geração de modelos de cancro da próstata a partir de PDX CTC. O uso do CTC para a geração de PDX modelos tem várias vantagens potenciais importantes quando comparado com métodos existentes. Em primeiro lugar, de recolha acessível CTC partir de sangue periférico permite a geração de modelos experimentais a partir do mesmo paciente em diferentes estádios da doença. Em segundo lugar, a colheita de sangue representa um método barato e mais seguro para o isolamento das células tumorais quando comparada com as metodologias existentes que requerem procedimentos cirúrgicos para a recolha de células tumorais.

Vários métodos de enriquecimento CTC foram descritos porém muitos não são acessíveis a todos os laboratórios devido a limitações de financiamento e de recursos. Buscou-se desenvolver um ensaio no nosso laboratório que pode capitalizar na utilização de FACS, uma metodologia conveniente, acessível e disponível para muitos laboratórios. Uma limitação potencial desta metodologia éa sensibilidade inadequada para a detecção de células raras, que pode limitar a utilização deste protocolo a pacientes com elevada carga tumoral. Várias tecnologias adicionais que empregam propriedades físicas ou biológicas das células epiteliais pode ser usado para mais de mitigar esta limitação e aumentar a detecção e isolamento desta população de células raras ^4. O método para CTC enriquecimento descrito neste protocolo emprega seleção negativa; CD45 ⁺ leucócitos são descartados e CD45 ^- CTC são retidos. É importante remover contaminantes potencialmente CD45 ^- elementos das suspensões de células, quando a classificação por citometria de fluxo (por exemplo, as células não viáveis.). Em particular, a utilização de tampão de lise de glóbulos vermelhos e a omissão de células não viáveis ​​por coloração com DAPI são considerações importantes. Embora essas medidas não podem garantir que os elementos não-CTC não contaminar o CD45 ^- população, nossos estudos anteriores sugerem que a célula p desejadoOPULAÇÃO está suficientemente enriquecida com estes métodos ^11. É possível que a pureza da população CTC pode ser melhorada através de selecção positiva usando anticorpos contra marcadores de superfície celular de células únicas de cancro da próstata ^3. Além disso, a heterogeneidade do CTC e do número de células epiteliais presentes na amostra pode ser testada usando EpCAM ou outros corantes apropriados. No entanto o processamento adicional da amostra de sangue periférico, em última instância pode aumentar a pureza ao diminuir o rendimento global.

Neste protocolo, realizada injeção subcutânea de CTCs isolados que permite uma fácil implantação e acompanhamento do tumor em desenvolvimento. No entanto, os modelos subcutâneos têm abastecimento de nutrição inadequada que pode comprometer o enxerto do tumor e perda de subpopulações de células de tumor. Locais de injecção alternativos, tais como a próstata do rato (ortotrópicos), que promove um microambiente da próstata, e a injecção da cápsula subrenal, o que aumenta succengraftment essful e preserva a heterogeneidade do tumor, pode ser realizada com base na preferência investigador ^1,2. Optimamente, NOD / SCID / null IL2λ-receptor (NSG) modelos de ratos deve ser utilizado para aumentar a taxa de xenoenxerto de enxerto ^12, no entanto, outras estirpes de ratinhos imunocomprometidos (NOD / SCID ou, nu, SCID / bege) também têm sido utilizados com sucesso na geração de modelos de tumor sólido derivado PDX ^1. PDX modelos gerados podem ser passados ​​em série e estabilidade das características do tumor originais monitorizados usando métodos genéticos estabelecidos ^9-11,13.

A recuperação de um número elevado de câncer de próstata viável CTCs é dependente de estágio da doença. A geração bem sucedida de modelos PDX é melhor assegurado quando CTC são isolados a partir de sangue de pacientes com elevada carga metastática. Nós têm gerado com êxito modelos PDX de amostras de sangue com uma gama de 100 a 10.000 CTC. Em nossa experiência, é necessário para o trabalho bem-treinadosAtory pessoal para executar o protocolo com frequência, a fim de garantir o isolamento bem sucedido de CTC da próstata a partir de amostras de sangue. Recomendamos que o pessoal do laboratório ser inicialmente treinados neste protocolo usando amostras de sangue de indivíduos saudáveis ​​normais enriquecida com células de linhagens de células tumorais. A ausência ou baixo número de CTC em cancro da próstata primário pode limitar a aplicação desta metodologia para o cancro da próstata metastático.

O método para a geração de modelos de PDX CTC derivado descritos no presente protocolo podem ser subsequentemente empregues em muitas aplicações de pesquisa, incluindo a caracterização molecular do cancro da próstata, rastreio de droga, monitorização da resposta terapia, desenvolvimento biomarcador, e outros avanços nas terapias de cancro personalizados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe