Abstract
Энцефалопатия недоношенных (НКП) это термин, который охватывает центральную нервную систему (ЦНС) Аномалии, связанные с преждевременными родами. Для лучших целей заранее поступательных и раскрыть новые терапевтические стратегии для черепно-мозговой травмой, связанной с преждевременными родами, доклинические модели НКП должен включать аналогичные механизмы пренатальной глобальной травмы наблюдается у людей и включать несколько компонентов материнской плаценты и плода системы. В идеале, должна производить модели аналогичный спектр функционального дефицита в взрослого животного и воспроизводят многие аспекты патофизиологии. Для имитации человеческих плацентарных системные дефекты перфузии, плацентарный underperfusion и / или хориоамнионит, связанные с патогеном-индуцированной воспалением в начале преждевременных родов, мы разработали модель пренатальной переходного системного гипоксии-ишемии (TSHI) в сочетании с интраамниальной липополисахарида (ЛПС). В крыс Спрэг Dawley, TSHI помощью матки окклюзии артерии Oп эмбриональных день 18 (E18) индуцирует дифференцированного плацентарный дефект, связанный underperfusion с увеличением поражение ЦНС у плода. В сочетании с интраамниальной инъекций ЛПС, плацентарная воспаление увеличивается, и поражение ЦНС усугубляется с соответствующими белого вещества, походки и обработки изображений аномалий. Пренатальная TSHI и TSHI + ЛПС пренатальная оскорбления встретиться несколько критериев модели Eop включая обобщал внутриутробное оскорбление, вызывая потерю нейронов, олигодендроцитов и аксонов, потери плите, и функциональных дефицитов у взрослых животных, которые имитируют те, наблюдается у детей, родившихся крайне преждевременные. Кроме того, эта модель позволяет для вскрытия воспаления, вызванного расходящихся видов травм.
Introduction
С более чем 12% детей, рожденных в Соединенных Штатах до 37 недель гестационного возраста оценивается 1, перинатальная травма головного мозга (PBI) из недоношенных является существенной причиной постоянной инвалидности. PBI от недоношенности, также называемый энцефалопатии недоношенных (EOP), влияет на всю центральную нервную систему (ЦНС). Травмы ЦНС часто начинается в период внутриутробного развития, и усугубляется дородовой процессов, включая хориоамнионита и послеродовых осложнений, таких как гипоксия и сепсис. PBI от системных оскорбления изменяет развитие нервной системы и приводит к церебральным параличом, эпилепсией, задержкой когнитивного и многочисленные нервно-психических расстройств влияющих эмоциональное регулирование, память и исполнительные функции 1,2. Хотя значительный прогресс был достигнут, ограниченное понимание остается, как клеточные и молекулярные последствия ЦНС травмы от преждевременных родов перевести на множестве неврологических осложнений у детей, которые родились недоношенными. Это отсутствие задних знанийERS в режиме реального времени диагноз тяжести травмы ЦНС и сообщил дозирование развивающихся вмешательств. Кроме того, соответствующие возрасту терапевтические стратегии для этой уязвимой группы населения пациента остаются неизвестными.
Внутриматочная воспаление очень часто в экстремальных недоношенных и включает в себя сложный плода-материнской плаценты воспалительный каскад 3. Внутриматочная инфекция часто субклинический. Конкретные выводы плацентарные согласующиеся с острым воспалением, или гистологического хориоамнионита, являются основными факторами, определяющими плода воспалительной реакции и совпадают с черепно-мозговой травмой, связанной с преждевременными родами 3-5. Действительно, плода воспалительная реакция имеет различные клинические последствия для долгосрочных результатов от преждевременных родов. Младенцы, которые мало для гестационного возраста (SGA) или кто испытывает инфекции являются исключительно уязвимыми к неврологическим дефицитом 3,4. Хориоамнионит является типовой патологический диагноз после преждевременных родов
Для имитации человеческих системные дефекты плаценты перфузии и хориоамнионит, связанные с патогеном-индуцированной воспалением, мы разработали модель пренатальной переходного системного гипоксии-ишемии (TSHI) в сочетании с интраамниальной липополисахарида (LPS) у крыс. Наша цель в том, чтобы адаптировать нашу модель TSHI одна у крыс 12-16 включать внутриутробного воспаления,для облегчения доклинические моделирование ЦНС травмы, связанной с преждевременными родами. TSHI одна выявил постоянные потери олигодендроглиальным клона клеток, нейронов коры, увеличение гибели клеток, и повышенные провоспалительных цитокинов уровни, с прогрессивными ишемических интервалами, ведущих к градуированной структуре травмы в соответствии с травмой головного мозга пренатального 16. Изменения в ишемических компонентов этой модели также продемонстрировали дефицит в кодировке памяти, короткий и долговременной памяти и мягких опорно-двигательного аппарата изменений у крыс, как они стареют 17-19. В самом деле, мы уже показали, что сочетание TSHI + ЛПС повторяет патофизиологические признаки конца проекта, в том числе и олигодендроцитов потери нейронов, аксонов травмы, воспаления и клеточной функциональных нарушений 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональная Уход и использование комитетов в больнице Бостонском детском и Университет Нью-Мексико здравоохранения наук Центр одобрил все экспериментальные процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процедуры уплотнения, стерилизовать в автоклаве и все хирургические инструменты и хирургические простыни. Кроме того, подготовить послеоперационные лекарства в стерильные флаконы в том числе 0,125% bipivucaine и 0,1 мг / кг бупренорфина. Также подготовить липополисахарида (ЛПС) решение стерильно: 0.04 мг / мл ЛПС (0111: b4) в стерильном физиологическом растворе, содержащем разбавить синий краситель Эвана.
1. Анестезия
- Индуцировать анестезию в эмбриональный день 18 (E18) беременной крысы Sprague Dawley со смесью 3% изофлуран сбалансированного 70% азота и 30% кислорода.
- Удалить крысу от индукции камеры и поместите крысы на спине на драпированные хирургического циркулирующей воды одеяло при 37 ° C. Перевести анестезию носового конуса и уменьшить isofluraУровень пе до 2%.
- Осторожно применять глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить роговицы сушки. Во время процедуры постоянно отслеживать температуру, частоту дыхания и частоту сердечных сокращений животного. Материнская физиологии должны оставаться стабильными в течение всей процедуры.
2. Хирургическое Подготовка и скраб
- Использование малых стрижки животных удалить все волосы в нижней области живота. Бритье по прямоугольной схеме с осторожностью, чтобы избежать уменьшение поперечного сечения соски или генерации бритвы сыпь, которая может вызвать раздражение в будущем выхаживания родившихся щенков живых.
- Подготовка кожи живота, чередуя применение повидон-йода и 70% этанола скраба с стерильным ватным тампоном. Повторите скраб, таких, что повидон-йод и 70% этанола, каждый применяться 3x в чередующихся моды. Дайте высохнуть.
- Подтвердите глубины анестезии с помощью отсутствии ног-пинча рефлекс. В отсутствие рефлекса и стимулов к боли, уменьшить уровень ИФ до 1%.
- Использование стерильных хирургических полотенца,драпировать животное. Позаботьтесь, чтобы разместить шторы под соответствующим углом, так что они максимально количество ирригационной жидкости они поглощают время не препятствует притоку крови к рогах матки.
3. Брюшной Лапаротомию
- Использование скальпеля сделать 3 см срединный разрез в подготовленную кожу живота. Тупо рассекают слой кожи от брюшной фасции с ножницами. Использование щипцов и хирургические ножницы, поднять брюшной фасциальное слой и сделать надрез в аваскулярный белой линии, чтобы получить доступ к брюшной полости.
- Поместите хирургического марли на внешней разрез и смочить стерильным физиологическим раствором. Использование тупых щипцы и внешнее давление на живот, мягко удалить рога матки из брюшной полости и организовать на увлажненную марлю.
- Тщательно избежать запутывания и связаться с кишечника. Упорядочить плодов с помощью щипцов, связавшись только мышечную ткань в отдельных амниотической между мешками.Expose и изолировать маточных артерий с помощью 4 тупым.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы препарировать маточных артерий. Окружающая ткань и сосуды сами чрезвычайно деликатный. Повреждение сосудов материнской может вызвать кровотечение, а в тяжелых случаях, матери и плода смерти.
4. Размещение аневризмы клипы
- Поставьте крысы 30 G аневризмы клип на каждой маточной артерии. Убедитесь, прекращение кровотока, в том числе проксимальных и дистальных импульсов, и потемнение сосудов матки в том числе индивидуальных плаценты. Обложка оголенные рога и весь операционного поля марлей и орошения стерильным физиологическим раствором. Позаботьтесь, чтобы сохранить поле влажная с орошением примерно каждые 10 мин.
- Через 60 мин, снять марлю и орошать поля. Убедитесь, что рога матки и сосудов адекватно увлажнена для успешного удаления клипа. Аккуратно удалите каждый аневризмы клипа с помощью щипцов. Старайтесь не вызывать травму судна, и Мейнтцелостность тканей, основной, во время удаления.
- Тщательно орошения рога матки и поле, заботясь, чтобы удалить любые беспризорные темы марли из амниотической мешков.
5. Введение липополисахарида, чтобы амниотической Sacs
- В основании каждого отдельного амниотической, только впереди плацентарный пластины, вводят 100 мкл LPS (4 мкг / САК) с синим красителем Эванса разбавляют и амниотической жидкости. Используйте пинцет, чтобы тупые стабилизации и поверните каждый амниотической мешка, чтобы оптимальное положение для инъекций. Синий краситель Эвана разбавленных является контрастное вещество, что является полезным для подтверждения правильного размещения шприца и инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только ультра-тонкий 0,3 мл инсулина шприц с прикрепленной 8 мм 31 G иглой для интраамниальной инъекций. Использование больших иглами приведет к хронической потере амниотической жидкости, гибели плода и реабсорбции беременности. Небольшие количества амниотической утечки жидкости после удалени шприца может быть mitigованные прямым давлением на амниотической. Некоторые крысы плодов может терпеть степень маловодие. Однако, острый амниотической жидкости из потеря пункции с большими иглами, или случайного прокола в результате хронической утечки жидкости, приводит к потере плода и в тяжелых случаях, потерю соседних беременности. - Промывать рога матки 3x стерильным физиологическим раствором.
6. Закрытие лапаротомии
- Использование щипцов, тщательно возвращают рога матки к брюшной полости. Обеспечение достаточного пространства между амниотической мешков и срединный разрез, повторно приблизить musculofascial края слоя, используя работает 3-0 шелковый шов. Будьте в курсе размещения амниотической мешков при закрытии мышц разрез. Будьте осторожны, чтобы не накладывать швы в или через мешка.
- Re-аппроксимации слой кожи, используя работает 3-0 шелковой нити, закрывая слой кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: лапаротомия должны быть закрыты в два слоя непрерывных швов, чтобы позволитьдля кожи и мышечной расширения с увеличением беременности. Непрерывные швы позволяют равномерно распределенной раны напряженности. Узловыми швами менее желательно в несколько узлы раздражает и может быть легко жевать крысы при анестезии восстанавливается. Хирургические скобы не требуется. Хвосты хирургических узлов должны быть сокращены очень короткие (<3 мм). - Вводите 1 мл 0,125% бупивакаина подкожно вокруг краев раны с помощью иглы 26 G. Администрирование одной дозы 0,1 мг / кг подкожно бупренорфин в задней части шеи.
- Выключите изофлуран и полотенце сухой крысу, как это необходимо. Место в чистой клетку и контролировать восстановление после анестезии. Убедитесь, крыса не станет гипотермия.
7. Послеоперационный уход Восстановление и
- Монитор крыса каждый час 8-12 в течение 72 ч, а затем ежедневно до щенки не рождаются (примерно E22 или E23). Администрирование дополнительных доз бупренорфин q8-12 ч / 72 ч или PRN как это диктуется IACUC.
- Монитор крыс на наличие признаков боли, дискомфорт, вагинальные кровотечения или кровотечения из хирургической сайте. Осмотрите швы и разрез и принять меры для обеспечения крыса не разжевывая или удаления их швы преждевременно. Несмотря на то, исключительно редки, крысы, что компромисс свои швы подвержены риску раны расхождение краев раны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда крысы могут глотать чрезмерное количество постельных принадлежностей или непродовольственных товаров, называется пику, в качестве побочного эффекта введения бупренорфина. Хотя очень редко, крысы должны быть проверены для пику и потенциальной последующей обструкцией кишечника.
8. Ткань Обработка и Cryosectioning
- Чтобы подготовиться к Гематоксилин и эозином (H & E) окрашиванием послеродовой мозга, удалить щенков из своего дома клетке на послеродовой день 2 (P2). Использование хирургических ножниц обезглавить крысят и осторожно извлечь мозг из черепа.
- Падение исправить мозг в 15 мл коническую пробирку, содержащую 7 мл 4% параформальдегида в фосфатном буферном растворе(PBS). Поместите мозг при 4 ° С и исправить в течение 72 ч.
- После 72 ч, передачи мозги стерильного раствора PBS, содержащего 30% сахарозы (масса / объем) и вернуться к 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как мозг падение в растворе сахарозы они готовы к срезы на криостате. - Быстро заморозить мозг и смонтировать на криостата пестиком для приобретения замороженных корональных разделах. Вырезать 20 мкм замороженные корональные разделы и смонтировать на слайдах. Обеспечить разделы собраны последовательно.
- Разрешить слайды высохнуть при комнатной температуре в течение ночи. Магазин слайды при температуре -20 ° C.
9. Гематоксилин & эозином
- Возьмите слайд установленный замороженных срезов и нагреться до комнатной температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка все решения свежим. - Место слайды на слайде теплее, равным 50 ° С в течение 2 ч.
- Передача слайды в окрашивания стойки. Дип слайды 10x в бидистиллированной деионизированной воды (DDH 2 O).
- Инкубируйте слайды в 100% гематоксилином в течение 5 мин. Tiмне в гематоксилином могут быть оптимизированы в зависимости от степени фиолетовым окрашиванием.
- Dip слайды 4x в водопроводной H 2 O, и дать постоять в чистой водопроводной H 2 O в течение 1 мин.
- Dip слайды 15x в кислой спирта (250 мл 70% этанола + 1 мл концентрированной соляной кислоты).
- Dip слайды 4x в водопроводной H 2 O, и дать постоять в чистой водопроводной H 2 O в течение 1 мин.
- Инкубируют в 1% карбонат лития в течение 2 мин.
- Dip слайды 4x в водопроводной H 2 O, и дать постоять в чистой водопроводной H 2 O в течение 1 мин.
- Инкубируйте в 95% этаноле в течение 1 мин.
- Dip слайды 7x в 100% эозином. Количество провалов в эозином может быть изменена в зависимости от степени розовой окраски.
- Dip слайды 5x в 95% этанола.
- 5x Дип слайд в свежем изменения 95% этанола.
- Инкубируйте слайды в 100% этаноле в течение 1 мин.
- Инкубируйте слайды в свежем изменения 100% этанола в течение 1 мин.
- Инкубируйте слайды в 100% ксилола в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ксилол шаги иcoverslipping должно происходить в вытяжном шкафу. - Инкубируйте слайды в свежих изменений ксилола в течение 15 мин.
- Покровное с предметный столик Permount и дайте высохнуть в вытяжном шкафу.
- Изображение слайды с помощью оптического микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После TSHI + ЛПС на E18, гематоксилином и эозином показывает значительные отклонения в гистологической как плаценты (рисунок 1) и в головном мозге (рисунок 2). Плаценты, рассмотренные на E19 и E21 являются грубо отечна с микро-кровоизлияния и некрозы всей децидуальной и лабиринт. Также наблюдается значительный воспалительный инфильтрат и увеличение венозность. Мозги рассмотрены на Р2 выявить вентрикуломегалия, а также белое вещество и потеря плите нейрон по сравнению с Шамс. Ранее мы сообщали, что TSHI + ЛПС вызывает воспаление и дает стойкий белого вещества и аксонов аномалии сопутствующих со значительным нарушением двигательной в молодых взрослых 20. TSHI + ЛПС также значительно уменьшается хлористого калия CO-Перевозчик 2 (KCC2) экспрессию белка, хлористого сотрудничество транспортер центральное место в развитии гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) ергических торможения, в коре головного мозга на P15 (рисунок 3 13.
Рисунок 1:. TSHI + ЛПС вызывает значительные гистологические отклонения в плаценте После переходного процесса в матке гипоксии-ишемии и интраамниальной введения ЛПС на эмбриональный день 18 (E18), плаценты от E19 TSHI + ЛПС плодов (б) грубо отечна с кровотечением (стрелки), некроз и увеличение воспалительного инфильтрата по сравнению с обманом (А, масштаб бар = 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. TSHI + ЛПС вызывает значительные гистологические аномалии в мозге После переходного процесса в матке гипоксии-ишемии и интраамниальной введения ЛПС на эмбриональный день 18 (E18), послеродовой вентрикуломегалия плите нейрона и белого потери вещества наблюдается в щенков, подверженных двойной TSHI + ЛПС (В) по сравнению с обманом (A) остро на Р2. (Масштаб бар = 100 мкм; Sp = плите; WM = белое вещество; Л.В. = бокового желудочка) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: TSHI + ЛПС уменьшает выраженность KCC2 западных помарки, выполняемые из мем.бранные препараты микро-расчлененный корковой ткани, шоу в маточно переходного системного гипоксии-ишемии и интраамниальной введения ЛПС на эмбриональный день 18 (E18) значительно снижает экспрессию KCC2, нейрон-специфический хлорида калия сотрудничества транспортера центральное место в развитии интегрированные мозговые схемы и торможение, в послеродовом 15 день (п = 6-10, среднее ± SEM, т-тест Стьюдента, * Р <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Энцефалопатия недоношенных трудно моделировать у животных из-за сложного взаимодействия этиологии, развития нервной системы, времени, конечно сложность формирования головного мозга человека, сети перекрывающихся механизмы травмы, и различные фенотипы ЦНС оскорбляет проявляется у недоношенных младенцев человека. НКП ассоциируется с конкретными уязвимостей камерного типа (т.е. незрелые олигодендроциты) 21, а также разнообразные развитием-регулируемые пути (т.е. на плите, мембранные транспортеры и субъединиц рецептора) 12,13,22. Тем не менее, значительный прогресс может быть сделано, когда модели на животных повторить состояние человека, насколько это возможно. Здесь мы разработали модель дородовой оскорбление, которое включает гетерогенность механизмов повреждения ЦНС наблюдается в недоношенного ребенка, что позволяет последующей оценки сером и белом ущерба и восстановления материи. У человека, восходящие бактериальные инфекции ослабляют амнион и precipitaте преждевременный разрыв плодных оболочек. Кроме того, плацентарные дефекты перфузии подчеркнуть интерфейс плацентарный и нарушить плацентарного гомеостаза. Таким образом, плацентарная underperfusion соединений травм ЦНС от внутриутробной инфекции. Безусловно, это сложно смоделировать общую клиническую сценарий возрастанию бактериальных инфекций, которые предшествуют хориоамнионит грызунов, поскольку они имеют двустороннюю матку. Каждый рог матки имеет свой собственный шейки матки, и многократные беременности осуществляется сразу. Несмотря на эти проблемы, доклинические модели были адаптированы к включать несколько компонентов устройства материнской плаценты и плода, и включить в матке воспаление в разной степени. В то время как ни один человек доклинические модель не является идеальным, чтобы проверить каждой конкретной гипотезы, модель, описанные здесь включает клеточные и молекулярные аномалии, поведенческие и функциональные нарушения, системные материнской плаценты и плода, а внутриутробная инфекция и воспаление плаценты компонентов общих для так маНью-Йорк преждевременных родов 20,23.
Выбор вида используются для моделирования Eop влияет на интерпретацию экспериментальных данных в контексте ограничений, присущих, связанных с вида. В простейших терминах, рождение не следует приравнивать к аналогичным точкам развития ЦНС во всех животных 24. Модель, описанный здесь может быть выполнена в обоих беременных мышей и крыс, хотя щенок выживания мышей значительно уменьшается в неопытных или стресс плотин. В соответствии с нашими предыдущих докладах, потери плода у крыс при рождении (P0) увеличивается в TSHI + ЛПС животных (около 40%) по сравнению с мнимым, ЛПС и TSHI только, но выжившие щенки не проявляют значительные различия веса с помощью Р28 20. Подобно различий между видами, сроки травмы во время беременности играет решающую роль в развития нервной траектории потомства. Пространственно-временной регуляции нервных клеток стадиях развития пролиферации, миграции и раrentiation отличается среди различных млекопитающих 24-26. Эти программы соты развития влияют на уязвимость к травмам. Например, перекрытие сроков олигодендроцитов линии и ГАМКергической развития нейронов со сроками преждевременных родов, делает эти клетки особенно чувствительны к оскорблениям перинатальных 27-29. Таким образом, эта модель была разработана в E18 крыс (и успешно переведены на E17 мышей на C57BL / 6 фоне), так как это соответствует времени внутриутробного глобальной пренатальной оскорбление, что происходит в человеческих младенцев до чрезвычайно преждевременных родов на 23-25 неделе беременности 20 , Мы ранее показали, O4-иммунореактивного незрелые олигодендроциты наиболее пострадавших на данном этапе развития 16. Их потеря коррелирует со снижением выживаемости и созревания 14, с самых заметных сокращений O4 + и + O1 этапах линии 16, в соответствии с предыдущими докладами другими исследователями 30. более того, Мы показали, преждевременное выпадение в плите, приведенное выражение KCC2, низкий порог судорожной и нарушение походки 12,13,15 соответствии с дизрегуляции ГАМК сигнализации у недоношенных детей 31.
Описанная модель здесь предлагает многочисленные преимущества по сравнению с предыдущими моделями у грызунов, используемых для изучения перинатальной травмы головного мозга от преждевременных родов 23. Она включает в себя всю систему мать-плацента-плод и вызывает как мозг и плацентарной травмы. Ранее мы опубликовали сравнение между обман, TSHI одна, одна и LPS TSHI + ЛПС и различия в функциональных результатов и биохимии 20, и различия с градуированной TSHI 16. В то время как предыдущие исследования односторонних сонных перевязку и системной гипоксии у новорожденных крыс пролили механистической понимание многочисленных патофизиологических процессах (то есть восприимчивости незрелых олигодендроцитов ишемии), прямой поступательных и клинических relevaсть для таких моделей является менее надежной. В дополнение к приложениям, описанных, модель, описанная здесь, может быть информативным инструментом для исследования других органов и систем пострадавших от недоношенности, в том числе некротизирующего энтероколита (NEC), сердца, легких, почек и гипоталамо-гипофизарной дисфункции оси. Благодаря сложности LPS фармакологии и различия в матери и плода фармакодинамики, внутрибрюшинные инъекции LPS в дамбах, менее вероятно, чтобы произвести тот же плода воспалительную реакцию, показанную здесь. Кроме того, ЛПС не проникают через плаценту надежно 20,32. Ранее мы попытались прямой шейки применение ЛПС и внутриматочное введение подобное тому, что было описано в других мышиных моделях 33. Тем не менее, мы обнаружили, что смертность и непоследовательность повреждения ЦНС была значительно увеличена среди щенков в одном помете. Здесь доза 4 мкг / мешка был оптимизирован с помощью экспериментов доза-ответ. Увеличение дозы ЛПС вводили атпiotic результаты отсек в повышенной смертности плода. ЛПС имеет преимущество по сравнению с непосредственным инфекции типичных внутриматочных грамотрицательных бактерий в том, что он активирует воспалительную сигналов через Толл-подобные рецепторы 4, не вызывая активное бактериальной инфекции и связанного с ним риска распространения патогенов. Тем не менее, эта модель может быть изменен, чтобы включить общие патогены и микроорганизмы, выделенные из плаценты человека, в том числе B стрептококк группы, которая вызывает плацентарных и нейропатологические аномалии, и аутизмом-как поведение у крыс 34. Точно так же, уреаплазма липопротеинов несколько диапазонов антиген может имитировать инфекции Ureaplasma видов. Так уреаплазма является наиболее распространенной причиной человеческой хориоамнионита 35, это также может быть путь для дальнейших исследований. Чем больше инактивированные-инфекционных агентов становятся доступными, то это будет информативно определить, как они влияют на развитие нервной системы дифференциально и эффективность нервно-репаративной вмешательств.
Ограничения этой модели включают амниотической жидкости из потери интраамниальной инъекций. Хотя эффект не с интраамниальной инъекций стерильного физиологического раствора отметил, датчик иглы, используемой для выполнения инъекций является решающим технический элемент. Уход должны быть приняты, чтобы не использовать иглы больше, чем 31 G. Хирургические осложнения на родном крысы, связанной с лапаротомии крайне редко, в том числе ран зияние, кишечной непроходимости, перитонита и полной потере беременности, с материнской смертности менее чем на 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарны Дэн Firl, Крис Корбетт и Джесси Denson, PhD. Финансирование было предоставлено NIH NINDS R01 NS060765 для SR, то P30-Кобре Пилотная программа ЖЖ и Программа Подпись Здоровье ребенка к ЖЖ в университете Нью-Мексико.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
- Blencowe, H., et al. Preterm birth associated neurodevelopmental impairment estimates at regional and global levels for 2010. Pediatr Res. 74, Suppl 1. 17-34 (2013).
- Mwaniki, M. K., Atieno, M., Lawn, J. E., Newton, C. R. Long term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults a systematic review. Lancet. 379, 445-452 (2012).
- Dammann, O., Leviton, A. Intermittent or sustained systemic inflammation and the preterm brain. Pediatr Res. 75, 376-380 (2014).
- Leviton, A., et al. Microbiologic and histologic characteristics of the extremely preterm infant's placenta predict white matter damage and later cerebral palsy. the ELGAN study Pediatr Res. 67, 95-101 (2010).
- Redline, R. W. Inflammatory responses in the placenta and umbilical cord. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 296-301 (2006).
- Lee, J., et al. Chronic chorioamnionitis is the most common placental lesion in late preterm birth. Placenta. 34, 681-689 (2013).
- Lee, S. M., et al. Acute histologic chorioamnionitis is a risk factor for adverse neonatal outcome in late preterm birth after preterm premature rupture of membranes. PloS one. 8, e79941 (2013).
- Pappas, A., et al. Chorioamnionitis and early childhood outcomes among extremely low gestational age neonates. JAMA Peds. 168, 137-147 (2014).
- Gaillard, R., Arends, L. R., Steegers, E. A., Hofman, A., Jaddoe, V. W. Second and third trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications the Generation R Study. Am J Epidemiol. 177, 743-754 (2013).
- Trivedi, S., et al. Fetal placental inflammation but not adrenal activation is associated with extreme preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 206, 236 (2012).
- Yanowitz, T. D., et al. Hemodynamic disturbances in premature infants born after chorioamnionitis association with cord blood cytokine concentrations. Pediatr Res. 51, 310-316 (2002).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia Ischemia. Cereb Cortex. , (2014).
- Jantzie, L. L., et al. Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co transporters following prenatal brain injury. Mol Cell Neurosci. 61, 152-162 (2014).
- Jantzie, L. L., Miller, R. H., Robinson, S. Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic ischemic brain injury. Pediatric Res. 74, 658-667 (2013).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic ischemic injury. J Neurosurg Peds. 6, 206-221 (2010).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18, 568-581 (2005).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22, 1-16 (2012).
- Delcour, M., et al. Impact of prenatal ischemia on behavior cognitive abilities and neuroanatomy in adult rats with white matter damage. Behav Brain Res. 232, 233-244 (2012).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Intl J Devel Neurosci. 29, 593-607 (2011).
- Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia ischemia and intra amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflam. 11, 131 (2014).
- Back, S., et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia ischemia. J Neurosci. 22, 455-463 (2002).
- Jantzie, L. L., et al. Developmental Expression of N Methyl d Aspartate (NMDA) Receptor Subunits in Human White and Gray Matter Potential Mechanism of Increased Vulnerability in the Immature Brain. Cereb Cortex. 25, 482-495 (2015).
- Jantzie, L. L., Robinson, S. Preclinical Models of Encephalopathy of Prematurity. Devel Neurosci. , (2015).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exper Neurol. 190, S8-S21 (2004).
- Kelsom, C., Lu, W. Development and specification of GABAergic cortical interneurons. Cell Biosci. 3, 19 (2013).
- Kinney, H., Back, S. Human oligodendroglial development Relationship to periventricualr leukomalacia. Semin Pediatr Neuro. 5, 180-189 (1998).
- Robinson, S., Li, Q., DeChant, A., Cohen, M. Neonatal loss of gamma amino butyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg Peds. 104, 396-408 (2006).
- Xu, G., et al. Late development of the GABAergic system in the human cerebral cortex and white matter. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 841-858 (2011).
- Segovia, K. N., et al. Arrested oligodendrocyte lineage maturation in chronic perinatal white matter injury. Ann Neurol. 63, 520-530 (2008).
- Robinson, S., Li, Q., Dechant, A., Cohen, M. L. Neonatal loss of gamma aminobutyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg. 104, 396-408 (2006).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24, 881-897 (2010).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis unraveling causes of adverse neurological outcomes. Repro Sci. 18, 900-907 (2011).
- Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).
- Uchida, K., et al. Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice. J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.
