Abstract
אנצפלופתיה של פגות (EOP) היא מונח המקיף את מערכת העצבים המרכזית (CNS) מומים הקשורים ללידה מוקדמת. למטרות translational מראש הטובות ביותר ולחשוף אסטרטגיות טיפוליות חדשות לפגיעה במוח הקשורים ללידה מוקדמת, מודלים פרה של EOP חייבים לכלול מנגנונים דומים פציעה העולמית לפני הלידה נצפה בבני אדם וכרוך במספר רכיבים של המערכת האימהית-שליה-העוברית. באופן אידיאלי, צריכים לייצר מודלים ספקטרום דומה של ליקויים תפקודיים בבעלי החיים הבוגרים ולשחזר היבטים רבים של הפתופיזיולוגיה. לחקות פגמים אנושיים מערכתי שליה זלוף, underperfusion שליה ו / או chorioamnionitis קשורים לדלקת נגרם לפתוגן בלידה מוקדמת מוקדם, פיתחנו מודל של היפוקסיה-איסכמיה לפני הלידה החולפת המערכתית (תשי"ב) בשילוב עם lipopolysaccharide תוך מי שפיר (LPS). בחולדות ספראג Dawley הריון, תשי"ב באמצעות o חסימת עורק הרחםn יום עוברי 18 (E18) גורם פגם underperfusion שליה מדורג קשור עם העלייה בניזק במערכת העצבים המרכזית בעובר. בשילוב עם זריקות LPS פנים-השפיר, דלקת שליה היא גדלה ונזק במערכת העצבים המרכזית הוא מורכב עם חריגות עניין, הליכה והדמיה לבנה קשורות. העלבונות טרום לידה הקורס הכנה ללידה תשי"ב ותשי"ב + LPS לפגוש כמה מהקריטריונים של מודל EOP כולל משחזר את העלבון תוך רחמי, גורמים לאובדן של תאי עצב, oligodendrocytes ואקסונים, אובדן subplate, וליקויים תפקודיים בבעלי חיים מבוגרים המחקים אלו שנצפו בילדים שנולדו מאוד פגים. יתר על כן, מודל זה מאפשר לנתיחה של דלקת נגרמת על ידי סוגים מסתעפים פציעה.
Introduction
עם מעל 12% מתינוקות שנולדו בארצות הברית לפני גיל הריון מוערך 37 שבועות 1, פגיעה מוחית סביב הלידה (PBI) מפגות היא גורם משמעותי לנכות קבועה. PBI מפגות, אנצפלופתיה מכונה גם של פגות (EOP), משפיעה על כל מערכת העצבים המרכזית (CNS). פגיעה במערכת העצבים המרכזית לעתים קרובות מתחילה ברחם, ומחריפה על ידי תהליכים טרום-לידתי כולל chorioamnionitis וסיבוכים לאחר לידה כגון היפוקסיה ואלח דם. PBI מעלבונות מערכתיים משנה התפתחות נוירולוגית ומוביל לשיתוק מוחין, אפילפסיה, עיכוב קוגניטיבי והפרעות נוירו-פסיכיאטריות רבות המשפיעים על ויסות רגשית, זיכרון ותפקוד ביצועי 1,2. למרות התקדמות רבה נעשתה, הבנה מוגבלת שרידים איך ההשלכות התאיות ומולקולריות של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מלידה מוקדמת לתרגם למספר רב של השלכות נוירולוגיות בילדים שנולדו פגים. זה חוסר ידע האחוריERS אבחון בזמן אמת של חומרת פציעה של מערכת העצבים המרכזית ומינון הודיע התערבויות המתעוררות. בנוסף, אסטרטגיות טיפוליות מתאים לגיל לאוכלוסיית חולים זו פגיעה להישאר חמקמקות.
דלקת תוך רחמי היא מאוד נפוצה בפגות קיצוניות וכרוך מפל דלקתי עוברי-אימהי-שליה מורכבת 3. הזיהום תוך רחמי הוא לעתים קרובות תת-קליני. ממצאי שליה ספציפיים בקנה אחד עם דלקת חריפה, או chorioamnionitis היסטולוגית, הם גורמים עיקריים לתגובה הדלקתית העוברית והם ביחד עם פגיעה מוחית הקשורים לידה מוקדמת 3-5. ואכן, יש התגובה הדלקתית העוברית השלכות קליניות מובהקות לתוצאות ארוכת טווח מלידה מוקדמת. תינוקות שהם קטנים לגיל הריון (SGA) או שחווים זיהום פגיעים במיוחד ל3,4 גירעונות נוירולוגיות. Chorioamnionitis היא לידה מוקדמת אבחנה פתולוגית טיפוסית הבאה
לחקות פגמים אנושיים מערכתיים זלוף השליה וchorioamnionitis קשורים לדלקת נגרם לפתוגן, פיתחנו מודל של היפוקסיה-איסכמיה לפני הלידה החולפת המערכתית (תשי"ב) בשילוב עם lipopolysaccharide תוך מי שפיר (LPS) בחולדות. המטרה שלנו הייתה להתאים המודל של תשי"ב לבד בחולדות 12-16 לכלול דלקת תוך רחמי,כדי להקל על מודלים פרה-קליניים של פגיעה במערכת העצבים המרכזית הקשורים ללידה מוקדמת. תשי"ב לבד חשף אובדן מתמשך של תאי שושלת oligodendroglial, תאי עצב בקליפת המוח, גדל מוות של תאים, ורמות גבוהות ציטוקינים פרו-דלקתיות, עם מרווחי איסכמי מתקדמים המובילים לדפוס מדורג של פגיעה בקנה אחד עם פגיעה המוחית לפני הלידה 16. גם שינויים במרכיבי איסכמי של מודל זה הוכיחו גירעונות בקידוד זיכרון, קצר וזיכרון לטווח ארוך ושינויים קלים בשרירים ושלד חולדות כשהם מזדקנים 17-19. ואכן, יש לנו הפגנו בעבר כי השילוב של תשי"ב + LPS משחזר סימני ההיכר של pathophysiological EOP, כוללים oligodendrocyte ואובדן עצבי, פגיעת axonal, דלקת סלולרית והפרעות תפקודיות 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מוסדי טיפול ושימוש בועדות בבית החולים לילדים בבוסטון וגם באוניברסיטת ניו מקסיקו למדעי בריאות המרכז אישרו את כל הפרוצדורות.
הערה: לפני תחילת ההליך, החותם, לעקר וחיטוי כל מכשירי הניתוח ווילאות כירורגי. בנוסף, להכין תרופות לאחר ניתוח בבקבוקונים סטריליים כולל bipivucaine 0.125% ו 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות. גם להכין את פתרון lipopolysaccharide (LPS) סטרילי: 0.04 מ"ג / מיליליטר LPS (0111: B4) בתמיסת מלח סטרילית מכילה לדלל צבע הכחול של אוון.
1. הרדמה
- לגרום הרדמה בחולדת ספראג Dawley עוברית יום 18 (E18) בהריון בתערובת של 3% חנקן isoflurane מאוזן 70% וחמצן 30%.
- הסר עכברוש מתא האינדוקציה ולמקם את פרקדן החולדה על שמיכת מים במחזור עטופה כירורגית נקבעה על 37 מעלות צלזיוס. העבר את ההרדמה לחרטום ולהפחית isofluraרמת ne עד 2%.
- בעדינות להחיל משחת עיניים לכל עין כדי למנוע התייבשות של קרנית. במהלך ההליך לפקח ללא הרף טמפרטורה, קצב נשימה וקצב לב של החיה. הפיסיולוגיה של האם צריכה להישאר יציבה לאורך כל ההליך.
2. הכנת כירורגי וליטוש
- קוצץ חיה קטן באמצעות להסיר את כל השיער באזור הבטן התחתון. לגלח בתבנית מלבנית בזהירות כדי למנוע שסחבו את הפטמות או יצירת פריחה גילוח שיכול להיות מעצבן לסיעוד בעתיד של גורים שנולדו בשידור חי.
- הכן את עור בטן לסירוגין יישום של לשפשף אתנול povidone- יוד ו -70% עם צמר גפן סטרילי. חזור על השיחים כך שpovidone- יוד ו -70% אתנול הוא כל מיושם 3x לסירוגין אופנה. בואו יבש.
- לאשר עומק ההרדמה באמצעות היעדר רפלקס הבוהן קמצוץ. בהיעדר רפלקס וגירויים כאב, להפחית את רמת isoflurane עד 1%.
- שימוש במגבות ניתוח סטרילי,לעטוף את החיה. דואג למקם את הווילאות בזווית מתאימה כזה שהם למקסם את כמות השקיה הנוזל הם סופגים, ואינם חוסמים את זרימת דם לקרני הרחם.
3. הבטן laparotomy
- באמצעות אזמל לעשות חתך קו האמצע 3 סנטימטר בעור הבטן מוכן. בבוטות לנתח את שכבת העור מfascia הבטן עם מספריים. בעזרת מלקחיים ומספריים כירורגיות, לרומם את שכבת fascial הבטן ולעשות חתך של alba Linea avascular כדי לקבל גישה לחלל הצפק.
- מניחים תחבושות על הצד החיצוני של החתך ולהרטיב עם תמיסת מלח סטרילית. בעזרת מלקחיים בוטים ולחץ חיצוני על הבטן, להסיר בעדינות את קרן הרחם מחלל הצפק ולארגן בגזה הלחה.
- להימנע מהסתבכות בזהירות וקשר עם מעיים. לארגן עוברים באמצעות מלקחיים על ידי יצירת קשר רקמת השריר רק בין שקים מי שפיר הבודדים.לחשוף ולבודד את עורקי רחם 4 באמצעות נתיחה בוטה.
יש להקפיד לנתח את עורקי רחם: הערה. רקמה וכלי מקיף את עצמם מאוד עדינים. נזק לכלי אימהיים יכול לגרום לדימום, ובמקרים חמורים, מוות עוברי ואימהי.
4. מיקום של קליפים מפרצת
- הנח קליפ פרצה G עכברוש 30 בכל עורק רחם. להבטיח הפסקת זרימת דם, כוללים הפרוקסימלי וקטניות דיסטלי, ומחשיך של כלי הרחם כולל שליות נפרדות. לכסות את הקרניים חשופות ותחום כירורגית כל עם גזה ולהשקות עם תמיסת מלח סטרילית. דואג לשמור על השדה לח עם השקיה בערך כל 10 דקות.
- לאחר 60 דקות, להסיר את הגזה ולהשקות את השדה. ודא שקרן הרחם והכולים טבולה במידה מספקת להסרת סרטון מוצלחת. הוצא בעדינות כל קליפ פרצה באמצעות מלקחיים. יש להיזהר שלא לגרום לטראומה לכלי השיט, ושימורשלמות רקמות עין במהלך ההסרה.
- ביסודיות להשקות את קרן הרחם ושדה, דואג להסיר כל אשכולות תועים של גזה מהצ'קים מי השפיר.
5. הזרקה של lipopolysaccharide לשפיר Sacs
- בבסיסו של כל שק מי שפיר בודד, רק קדמי לצלחת השליה, להזריק של LPS (4 מיקרוגרם / שק) עם הצבע הכחול של אוון בדילול 100 μl למי שפיר. שימוש במלקחיים בוטים לייצב ולסובב כל שק מי שפיר למיקום אופטימלי להזרקה. הצבע הכחול של לדלל אוון הוא חומר ניגוד שהוא מועיל במאשר מיקום מזרק מתאים והזרקה.
הערה: שימוש במזרק רק 0.3 מיליליטר אינסולין אולטרה דק עם מחט G 8 מ"מ 31 מצורפים לזריקות תוך-השפיר. שימוש במחטי מד גדולים יותר תגרום לאובדן כרוני מי שפיר, מוות עוברי וספיגה של ההריון. כמויות קטנות של דליפה מי שפירה עם הסרת המזרק יכולות להיות mitigated על ידי לחץ ישיר לשק מי השפיר. עוברי עכברים מסוימים עשויים לסבול מידת המיעוט מי שפיר. עם זאת, אובדן חריף מי שפיר מלנקב עם מחטים גדולות מד, או לנקב מקרי וכתוצאה מכך דליפת נוזל כרונית, תוצאות באובדן של העובר ובמקרים חמורים, אובדן ההריונות שכנים. - להשקות את רחם קרנות 3x עם תמיסת מלח סטרילית.
6. סגירת laparotomy
- בעזרת מלקחיים, לחזור בזהירות את קרן הרחם לחלל הצפק. הבטחת מרחב מספיק בין שקים מי השפיר וחתך קו האמצע, מחדש משוער קצות שכבת musculofascial באמצעות תפר 3-0 משי ריצה. להיות מודע למיקום של שקים מי השפיר בזמן סגירת חתך השריר. היזהר שלא לתפור לאו באמצעות שק.
- -משוער מחדש את שכבת העור, באמצעות תפר 3-0 משי ריצה, סגירת שכבת העור.
הערה: laparotomy צריך להיות סגור בשתי שכבות של תפרים רציפים כדי לאפשרלעור והרחבת שרירים עם הגדלת הריון. תפרים רציפים מאפשרים למתח פצע מופץ באופן שווה. תפרים בהפרעה הם פחות רצויים כקשרים מרובים הם מעצבן וניתן לעסו בקלות על ידי החולדה על מתאושש מהרדמה. סיכות כירורגי אינן רצויים. זנבות של הקשרים כירורגית יש לחתוך (<3 מ"מ) קצר מאוד. - הזרק 1 מיליליטר של קצוות סביב פצע 0.125% מתחת לעור bupivacaine באמצעות מחט 26 G. לנהל מנה אחת של 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות תת עורי בעורף.
- כבה את isoflurane ועכברוש יבש מגבת לפי צורך. מניחים בכלוב בבית נקי ולעקוב אחר התאוששות מן ההרדמה. ודא עכברוש לא יהפוך היפותרמיה.
7. לאחר ניתוח שחזור וטיפוח
- צג העכברוש כל שעות 8-12 במשך 72 שעות ולאחר מכן מדי יום עד גורים נולדים (כ E22 או E23). לנהל מינונים נוספים של שעות / 72 שעות q8-12 עצירות או PRN כפי שהוכתב על ידי IACUC.
- צג חולדות לסימנים של כאב, אי נוחות, דימום מנרתיק או דימום מהאתר כירורגית. בדוק את התפרים וחתך ודואג להבטיח חולדה לא לעיסה או הסרת התפרים שלהם בטרם עת. למרות שנדיר במיוחד, חולדות שתתפשרנה התפרים שלהם נמצאות בסיכון לבקיעת פצע.
הערה: לפעמים חולדות עשויות להבלע כמויות עודפות של פריטי מצעים או שאינו מזון, מכונה פיקה, כתופעת לוואי של ממשל עצירות. למרות שמאוד נדיר, חולדות חייבות להיות במעקב לפיקה וחסימת מעי לאחר פוטנציאלית.
8. עיבוד רקמות וCryosectioning
- כדי להתכונן לHematoxylin וEosin (H & E) מכתים של המוח לאחר הלידה, להסיר גורים מהכלוב בביתם ביום שלאחר לידה 2 (P2). בעזרת מספריים כירורגיות לערוף גורי חולדה ובעדינות להסיר את המוח מהגולגולת.
- זרוק מוח תיקון בצינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל 7 מיליליטר של paraformaldehyde 4% בופר פוספט(PBS). מניחים מוח על 4 מעלות צלזיוס ולתקן במשך 72 שעות.
- לאחר 72 שעות, להעביר את המוח לפתרון PBS סטרילי המכיל 30% סוכרוז (w / v) ולחזור ל4 מעלות צלזיוס.
הערה: ברגע שהמוח של הירידה בתמיסת סוכרוז הם מוכנים להיות מחולקים על cryostat. - במהירות להקפיא את המוח ולעלות על העלי cryostat לרכישת חלקי העטרה קפוא. חותך 20 מיקרומטר סעיפי העטרה קפוא והר בשקופיות. סעיפים להבטיח נאספים באופן סדרתי.
- לאפשר שקופיות לייבוש בטמפרטורת חדר למשך הלילה. חנות שקופיות ב -20 ° C.
9. Hematoxylin וEosin מכתים
- קח שקופיות רכובים סעיפים קפוא וחמות לטמפרטורת חדר.
הערה: הכן את כל הפתרונות טריים. - מגלשות מקום בשקופית סט חם עד 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
- העברת שקופיות למדף מכתים. טובלים שקופיות 10x במים מזוקקים כפולים deionized (DDH 2 O).
- דגירה שקופיות בhematoxylin 100% במשך 5 דקות. סִישלי בhematoxylin יכולות להיות מותאם תלות בדרגה של מכתים סגול.
- טובלים שקופיות 4x ברז H 2 O, ולתת לעמוד בH רז הנקי 2 O דקות 1.
- טובלים שקופיות 15x באלכוהול חומצה (250 מיליליטר אתנול 70% + 1 מיליליטר חומצה הידרוכלורית מרוכז).
- טובלים שקופיות 4x ברז H 2 O, ולתת לעמוד בH רז הנקי 2 O דקות 1.
- דגירה ב 1% ליתיום קרבונט למשך 2 דקות.
- טובלים שקופיות 4x ברז H 2 O, ולתת לעמוד בH רז הנקי 2 O דקות 1.
- דגירה ב -95% אתנול דקות 1.
- טובלים שקופיות 7x ב100% Eosin. מספר מטבלים בEosin יכול להיות שונה בהתאם למידת צביעה הוורודה.
- טובלים שקופיות 5x באתנול 95%.
- 5x שקופיות לטבול בשינוי טרי של 95% אתנול.
- דגירה שקופיות ב 100% אתנול 1 דקות.
- דגירה שקופיות בשינוי טרי של 100% אתנול 1 דקות.
- דגירה שקופיות בקסילן 100% במשך 15 דקות.
הערה: צעדי קסילן וcoverslipping צריך להתרחש במנדף. - דגירה שקופיות בשינויים טריים של קסילן במשך 15 דקות.
- Coverslip עם Permount ולתת יבש במנדף.
- תמונת שקופיות עם מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות תשי"ב + LPS בE18, hematoxylin והכתים eosin חושפים ליקויים משמעותיים ההיסטופתולוגיים בשתי השליה (איור 1) ובמוח (איור 2). שליות נבדקו על E19 וE21 הן גס בצקים עם מיקרו-דימום, ונמק בכל decidua והמבוך. חודר לתוך דלקתי משמעותי וכלי דם מוגברים הוא ציינו גם. המוח נבדק על P2 לחשוף ventriculomegaly, כמו גם חומר לבן ואובדן תא עצב subplate לעומת שמס. בעבר, דיווחנו כי תשי"ב + LPS גורם דלקת ומניב חומר לבן מתמשך ומומי axonal במקביל לירידת ערך משמעותי במנוע הצעירים 20. תשי"ב + LPS גם מקטין באופן משמעותי את שיתוף טרנספורטר אשלגן כלורי 2 (KCC2) ביטוי חלבון, שיתוף טרנספורטר כלוריד מרכזי להתפתחות של חומצת γ-aminobutyric (GABA) עיכוב ergic, בקליפה בP15 (איור 3 strong>, * P <0.05). נתונים אלה עולים בקנה אחד עם גברת ביטוי התפתחותי לקויה של KCC2 בתקופה שלאחר לידה קריטית של התבגרות מעגל וממצאים אלה עולים בקנה אחד עם הדיווחים הקודמים שלנו מההשפעות של תשי"ב לבד בהיפוקמפוס CA3 13.
איור 1:. תשי"ב + LPS גורם מומים היסטולוגית משמעותיים בשליה ברחם בעקבות חולף היפוקסיה-איסכמיה וממשל LPS פנים-השפיר ביום עוברי 18 (E18), שליות מעוברי E19 תשי"ב + LPS (B) הן גס בצקים עם דימום (חיצים), נמק ולחדור מוגברים דלקתי לעומת דמה (, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s = "jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2:. תשי"ב + LPS גורם מומים היסטולוגית משמעותיים במוח בעקבות חולף ברחם היפוקסיה-איסכמיה וממשל LPS פנים-השפיר ביום עוברי 18 (E18), ventriculomegaly לאחר הלידה, נוירון subplate ואובדן חומר לבן הוא ציין בגורים נתון ל תשי"ב הכפול + LPS (ב ') בהשוואה לדמה () בחריפות בP2. (בר סולם = 100 מיקרומטר; Sp = subplate; WM = חומר לבן; LV = חדר לרוחב) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תשי"ב + LPS מפחית ביטוי KCC2 כתמים מערביים ביצעו מממ.הכנות Brane של רקמת קליפת המוח-גזור מיקרו, תכנית ברחם היפוקסיה-איסכמיה החולפת המערכתית וממשל LPS פנים-השפיר ביום עוברי 18 (E18) מפחית באופן משמעותי ביטוי של KCC2, שיתוף טרנספורטר אשלגן כלורי נוירון הספציפי מרכזי לפיתוח מעגלים משולבים מוחי ועיכוב, ביום 15. לאחר הלידה (n = 6-10, ממוצע ± SEM, מבחן t, * P <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנצפלופתיה של פגות קשה לדגמן בבעלי חיים בגלל האינטראקציה המורכבת של אטיולוגיה, כמובן זמן התפתחות נוירולוגית, מורכבות של מערך רשת מוחי אנושי, חופפות מנגנונים של פגיעה, ופנוטיפים השונים של מערכת העצבים המרכזית מעליב באו לידי ביטוי בפגים אנושיים. EOP קשור נקודות תורפה ספציפיות תאים מסוג (כלומר oligodendrocytes לא מפותח) 21, כמו גם מסלולים התפתחותית-מוסדרים מגוונים (כלומר subplate, מובילי קרום ויחידות משנת קולט) 12,13,22. עם זאת, התקדמות משמעותית יכולה להתבצע כאשר מודלים של בעלי החיים לשכפל את מצבו של האדם, ככל שניתן. כאן, פיתחנו מודל עלבון לפני לידה המשלב את ההטרוגניות של מנגנונים של פגיעה במערכת העצבים המרכזית שנצפו בפגים, המאפשר להערכה הבאה של שני נזק חומר אפור ולבן והתאוששות. בבני אדם, זיהומים חיידקיים עולים להחליש את amnion וprecipitaקרע מוקדם של קרומי te. בנוסף, פגמי זלוף שליה מדגישים את ממשק השליה ולשבש הומאוסטזיס שליה. לפיכך, underperfusion השליה תרכובות פגיעה במערכת העצבים המרכזית מזיהום תוך רחמי. ללא ספק, זה מאתגר למודל התרחיש הקליני הנפוץ של זיהומים חיידקיים עולה שקדמו chorioamnionitis במכרסמים כיש להם רחם דו-צדדי. לכל קרן רחם צוואר הרחם שלה, והריונות מרובים מתבצעים בפעם אחת. למרות האתגרים הללו, מודלים פרה הותאמו לערב רכיבים מרובים של היחידה האימהית-שליה-העוברית ולשלב בדלקת הרחם לדרגות שונות. אמנם אין מודל פרה אדם הוא אידיאלי לבחון כל השערה ספציפית, המודל שתואר במסמך זה כולל את החריגות התאיות ומולקולריות, ירידת ערך התנהגותיות ותפקודית, מערכת אימהית-שליה-עוברית, וזיהום תוך רחמי ומרכיב דלקת שליה משותף לכל כך מאפגים ניו יורק לידות 20,23.
הבחירה של מינים משמשת מודל השפעות EOP הפרשנות של נתונים ניסיוניים בהקשר של המגבלות מובנות שמציבות המינים. במונחים הפשוטים, לידה אינה שווה לנקודות דומות של פיתוח מערכת העצבים המרכזית בכל בעלי החיים 24. המודל שתואר כאן יכול להתבצע בשני עכברים וחולדות בהריון, למרות שהישרדות גור בעכברים היא ירד באופן משמעותי בסכרים חסרי ניסיון או לחוץ. עולה בקנה אחד עם הדיווחים שלנו לפני, אובדן של העובר בחולדות בלידה (P0) הוא גדל בבעלי החיים תשי"ב + LPS (כ -40%) בהשוואה לזיוף, LPS ותשי"ב לבד, אבל גורים ששרדו אינם מציגים הבדלים משמעותיים במשקל באמצעות P28 20. בדומה להבדלים בין מינים, העיתוי של פגיעה במהלך ההריון יש תפקיד מכריע בהתפתחות נוירולוגית המסלול של הצאצאים. הרגולציה spatiotemporal של שלבי התפתחות תא העצבי של התפשטות, הגירה וdifferentiation שונה בין יונקים שונים 24-26. תוכניות התפתחותיות תא ספציפי אלה משפיעות על הפגיעות לפציעה. לדוגמא, החפיפה של עיתוי שושלת oligodendrocyte ופיתוח עצבי GABAergic עם התזמון של לידה מוקדמת גורמת לתאים אלה רגישים במיוחד לעלבונות סביב הלידה 27-29. לפיכך, מודל זה פותח בחולדות E18 (והצלחה תורגם לעכברי E17 על רקע C57BL / 6) כעיתוי זה תואם את העלבון טרום לידה הגלובלית תוך רחמי המתרחש בתינוקות אנושיים לידה לפני מאוד פגים בהריון שבועות 23-25 20 . הראינו בעבר oligodendrocytes בוגר O4-immunoreactive המושפעים ביותר בשלב זה של פיתוח 16. הפסד שלהם בקורלציה עם הישרדות והתבגרות 14 ירד, עם הירידה הבולטת ביותר בO4 + ושלבי O1 + של השושלת 16, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים על ידי חוקרים אחרים 30. יתר על כך, יש לנו הפגנו אובדן מוקדם של subplate, ביטוי KCC2 מופחת, סף התקף נמוך והליכה לקויה 12,13,15 בקנה אחד עם GABAergic dysregulated איתות בפגים 31.
המודל שתואר כאן מציע יתרונות רבים על פני דגמים קודמים במכרסמים המשמשים ללמוד פגיעה מוחית סביב הלידה מלידה מוקדמת 23. היא משלבת את מערכת אימהית-שליה-עוברית כולו וגורמת לשניהם מוח ופגיעת שליה. יש לנו שפורסמו בעבר השוואות בין הזיוף, תשי"ב לבד, LPS לבד ותשי"ב + LPS והבדלים בתוצאות תפקודיות וביוכימיה 20, והבדלים עם תשי"ב המדורג 16. בעוד החקירות קודמות של קשירת הצוואר חד-צדדית והיפוקסיה מערכתית בחולדות בילוד שפכו תובנה מכניסטית לתהליכי pathophysiological רבים (כלומר הרגישות של oligodendrocytes לא בוגר לאיסכמיה), translational הישיר וreleva הקליניNCE למודלים כאלה הוא פחות חזק. בנוסף ליישומים שתוארו, המודל שתואר כאן יכול להיות כלי אינפורמטיבי לחקירה של מערכות אחרות איבר מושפע פגות, כוללים דלקת מעי נמקית (NEC), לב, ריאות, כליות ובעיות בתפקוד ציר ההיפותלמוס, יותרת המוח. בשל המורכבות של פרמקולוגיה LPS וההבדלים בפרמקודינמיקה האימהית והעוברית, זריקות LPS intraperitoneal בסכרים נוטים פחות לייצר את אותה תגובה דלקתית עוברית המוצגת כאן. יתר על כן, LPS אינו חוצה את השליה באופן מהימן 20,32. בעבר, ניסינו יישום ישיר של צוואר רחם LPS והזרקה תוך רחמי דומות למה שמתואר במודלים של עכברים אחרים 33. עם זאת, מצאנו כי תמותה וחוסר עקביות של פגיעה במערכת העצבים המרכזית הוגדלו באופן משמעותי בקרב גורים באותה ההמלטה. כאן, במינון של 4 מיקרוגרם / שק היה מותאם באמצעות ניסויי מנה-תגובה. הגדלת מינון של LPS מנוהל לAmnתוצאות תא iotic בתמותה עוברית מוגברת. יש LPS היתרון על פני זיהום ישיר עם חיידקי גרם שלילי תוך רחמי אופייניים בכך שהוא מפעיל איתות דלקתית דרך קולטן חיוג כמו 4 מבלי לגרום לזיהום חיידקים פעיל והסיכון הכרוך בפתוגן התפשטות. עם זאת, מודל זה יכול להיות שונה כדי לכלול פתוגנים נפוצים ואורגניזמים מבודדים משליות אדם, כוללים ארוחת הבוקר סטרפטוקוקוס קבוצה, מה שגורם להפרעות בשליה ונוירו, והתנהגות כמו אוטיסטים בחולדות 34. באופן דומה, אנטיגן התאגדו מרובה ליפופרוטאין Ureaplasma יכול לדמות זיהום מיני Ureaplasma. מאז Ureaplasma הוא הגורם השכיח ביותר של אדם chorioamnionitis 35, זה יכול להיות גם שדרה לחקירה בעתיד. כסוכנים יותר מומתים-מדבקים הפכו זמינים, זה יהיה אינפורמטיבי כדי לקבוע כיצד הם משפיעים על התפתחות נוירולוגית באופן דיפרנציאלי והיעילות של התערבויות נוירו-מתקן.
מגבלות של מודל זה כוללים אובדן מי שפיר מהזריקות תוך-השפיר. למרות שאין כל השפעה יצוין בזריקות תוך-השפיר של תמיסת מלח סטרילית, מד של המחט המשמשת לביצוע הזריקות הוא אלמנט טכני חיוני. יש להקפיד לא להשתמש במחטים גדולות יותר מאשר 31 סיבוכי כירורגי ג 'בחולדה אמא הקשורים לlaparotomy הם נדירים ביותר, כוללים בקיעת פצע, חסימת מעי, דלקת הצפק ואובדן ההריון מלא, עם תמותה אימהית פחות מ -5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לדן Firl, כריס קורבט וג'סי Denson, PhD. מימון ניתן על ידי NIH NINDS R01 NS060765 לSR, P30 Cobre תכנית הפיילוט לLJ ותכנית חתימת בריאות הילד לLJ באוניברסיטת ניו מקסיקו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
- Blencowe, H., et al. Preterm birth associated neurodevelopmental impairment estimates at regional and global levels for 2010. Pediatr Res. 74, Suppl 1. 17-34 (2013).
- Mwaniki, M. K., Atieno, M., Lawn, J. E., Newton, C. R. Long term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults a systematic review. Lancet. 379, 445-452 (2012).
- Dammann, O., Leviton, A. Intermittent or sustained systemic inflammation and the preterm brain. Pediatr Res. 75, 376-380 (2014).
- Leviton, A., et al. Microbiologic and histologic characteristics of the extremely preterm infant's placenta predict white matter damage and later cerebral palsy. the ELGAN study Pediatr Res. 67, 95-101 (2010).
- Redline, R. W. Inflammatory responses in the placenta and umbilical cord. Semin Fetal Neonatal Med. 11, 296-301 (2006).
- Lee, J., et al. Chronic chorioamnionitis is the most common placental lesion in late preterm birth. Placenta. 34, 681-689 (2013).
- Lee, S. M., et al. Acute histologic chorioamnionitis is a risk factor for adverse neonatal outcome in late preterm birth after preterm premature rupture of membranes. PloS one. 8, e79941 (2013).
- Pappas, A., et al. Chorioamnionitis and early childhood outcomes among extremely low gestational age neonates. JAMA Peds. 168, 137-147 (2014).
- Gaillard, R., Arends, L. R., Steegers, E. A., Hofman, A., Jaddoe, V. W. Second and third trimester placental hemodynamics and the risks of pregnancy complications the Generation R Study. Am J Epidemiol. 177, 743-754 (2013).
- Trivedi, S., et al. Fetal placental inflammation but not adrenal activation is associated with extreme preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 206, 236 (2012).
- Yanowitz, T. D., et al. Hemodynamic disturbances in premature infants born after chorioamnionitis association with cord blood cytokine concentrations. Pediatr Res. 51, 310-316 (2002).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia Ischemia. Cereb Cortex. , (2014).
- Jantzie, L. L., et al. Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co transporters following prenatal brain injury. Mol Cell Neurosci. 61, 152-162 (2014).
- Jantzie, L. L., Miller, R. H., Robinson, S. Erythropoietin signaling promotes oligodendrocyte development following prenatal systemic hypoxic ischemic brain injury. Pediatric Res. 74, 658-667 (2013).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic ischemic injury. J Neurosurg Peds. 6, 206-221 (2010).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18, 568-581 (2005).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22, 1-16 (2012).
- Delcour, M., et al. Impact of prenatal ischemia on behavior cognitive abilities and neuroanatomy in adult rats with white matter damage. Behav Brain Res. 232, 233-244 (2012).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Intl J Devel Neurosci. 29, 593-607 (2011).
- Jantzie, L. L., et al. Complex pattern of interaction between in utero hypoxia ischemia and intra amniotic inflammation disrupts brain development and motor function. J Neuroinflam. 11, 131 (2014).
- Back, S., et al. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia ischemia. J Neurosci. 22, 455-463 (2002).
- Jantzie, L. L., et al. Developmental Expression of N Methyl d Aspartate (NMDA) Receptor Subunits in Human White and Gray Matter Potential Mechanism of Increased Vulnerability in the Immature Brain. Cereb Cortex. 25, 482-495 (2015).
- Jantzie, L. L., Robinson, S. Preclinical Models of Encephalopathy of Prematurity. Devel Neurosci. , (2015).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33, 7368-7383 (2013).
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exper Neurol. 190, S8-S21 (2004).
- Kelsom, C., Lu, W. Development and specification of GABAergic cortical interneurons. Cell Biosci. 3, 19 (2013).
- Kinney, H., Back, S. Human oligodendroglial development Relationship to periventricualr leukomalacia. Semin Pediatr Neuro. 5, 180-189 (1998).
- Robinson, S., Li, Q., DeChant, A., Cohen, M. Neonatal loss of gamma amino butyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg Peds. 104, 396-408 (2006).
- Xu, G., et al. Late development of the GABAergic system in the human cerebral cortex and white matter. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 841-858 (2011).
- Segovia, K. N., et al. Arrested oligodendrocyte lineage maturation in chronic perinatal white matter injury. Ann Neurol. 63, 520-530 (2008).
- Robinson, S., Li, Q., Dechant, A., Cohen, M. L. Neonatal loss of gamma aminobutyric acid pathway expression after human perinatal brain injury. J Neurosurg. 104, 396-408 (2006).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24, 881-897 (2010).
- Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis unraveling causes of adverse neurological outcomes. Repro Sci. 18, 900-907 (2011).
- Bergeron, J. D., et al. White matter injury and autistic like behavior predominantly affecting male rat offspring exposed to group B streptococcal maternal inflammation. Devel Neurosci. 35, 504-515 (2013).
- Uchida, K., et al. Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice. J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.
