Abstract
Encéphalopathie de prématurité (EOP) est un terme qui englobe le système nerveux central (SNC) anomalies associées à la prématurité. Pour meilleurs objectifs avance de translation et de découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les lésions cérébrales associées à la prématurité, des modèles précliniques de EoP doit inclure des mécanismes similaires de blessure mondiale prénatale observée chez les humains et d'impliquer plusieurs composants du système maternelle-placentaire et fœtale. Idéalement, les modèles devraient produire un spectre similaire de déficits fonctionnels chez l'animal mature et récapituler les multiples aspects de la physiopathologie. Pour imiter systémiques défauts humains placentaires de perfusion, underperfusion placentaire et / ou chorioamniotite associées à l'inflammation induite par un agent pathogène au début de la prématurité, nous avons développé un modèle de prénatale transitoire systémique hypoxie-ischémie (TSHI) combinée avec un lipopolysaccharide intra-amniotique (LPS). Dans rats Sprague-Dawley enceintes, via TSHI utérine occlusion de l'artère on jour embryonnaire 18 (E18) induit un défaut de underperfusion placentaire graduée associée à une augmentation des dommages du système nerveux central chez le fœtus. Lorsqu'il est combiné avec des injections de LPS intra-amniotique, l'inflammation placentaire est augmentée et les dommages du système nerveux central est mélangé avec de la substance blanche, la démarche et d'imagerie des anomalies associées. Prénatale tshi et TSHI + LPS insultes prénatales répondre à plusieurs des critères d'un modèle EoP y compris récapitulant l'insulte intra-utérine, provoquant la perte de neurones, les oligodendrocytes et les axones, la perte d'embase, et les déficits fonctionnels chez les animaux adultes qui imitent ceux observés chez les enfants nés extrêmement prématuré. En outre, ce modèle permet la dissection de l'inflammation induite par types de blessures divergentes.
Introduction
Avec plus de 12% des enfants nés aux États-Unis avant 37 semaines de gestation estimée 1 âge, périnatale lésion cérébrale (PBI) à partir de la prématurité est une cause importante d'invalidité permanente. PBI de prématurité, encéphalopathie également appelé de la prématurité (EOP), affecte l'ensemble du système nerveux central (SNC). Lésion du SNC commence souvent in utero, et est aggravée par les processus de soins prénatals, y compris les complications postnatales et chorioamniotite tels que l'hypoxie et la septicémie. PBI des insultes systémiques altère le développement neurologique et conduit à la paralysie cérébrale, l'épilepsie, retard cognitif et de nombreux troubles neuropsychiatriques touchant la régulation émotionnelle, la mémoire et les fonctions exécutives 1,2. Bien que beaucoup de progrès ont été réalisés, une compréhension limitée reste la façon dont les conséquences cellulaires et moléculaires de lésion du SNC de naissance prématurée se traduisent par la multitude de séquelles neurologiques chez les enfants qui sont nés avant terme. Ce manque de biche connaissancesERS diagnostic en temps réel des CNS gravité des blessures et le dosage informé de nouvelles interventions. En outre, les stratégies thérapeutiques adaptées à l'âge de cette population de patients vulnérables demeurent insaisissables.
L'inflammation intra-utérine est très commun dans l'extrême prématurité et implique une cascade inflammatoire materno-fœtale-placentaire complexe 3. Infection intra-utérine est souvent subclinique. Conclusions placentaires spécifiques compatibles avec une inflammation aiguë ou chorioamniotite histologique, sont des déterminants majeurs de la réponse inflammatoire du fœtus et coïncident avec les blessures du cerveau associée à la prématurité 3-5. En effet, la réponse inflammatoire du fœtus a des implications cliniques distinctes pour les résultats à long terme de la prématurité. Les nourrissons qui sont petits pour l'âge gestationnel (SGA) ou qui éprouvent infection sont extrêmement vulnérables aux déficits neurologiques 3,4. Chorioamniotite est une naissance prématurée diagnostic pathologique typique suivante
Pour imiter les défauts systémiques de perfusion placentaire humaines et chorioamniotite associées à l'inflammation induite par un agent pathogène, nous avons développé un modèle de prénatale transitoire systémique hypoxie ischémie (TSHI) combinée avec un lipopolysaccharide intra-amniotique (LPS) chez le rat. Notre objectif était d'adapter notre modèle de TSHI seul rats 12-16 pour inclure une inflammation intra-utérine,pour faciliter la modélisation préclinique de lésion du SNC associée à la prématurité. Seul TSHI a révélé la perte persistante de cellules de la lignée oligodendrogliales, les neurones corticaux, l'augmentation de la mort cellulaire, et des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires, avec des intervalles ischémiques progressives conduisant à un modèle gradué de blessures compatibles avec lésion cérébrale prénatale 16. Les modifications des composants ischémiques de ce modèle ont également démontré des déficits de codage de la mémoire, et la mémoire à court terme et à long altérations musculo-squelettiques chez le rat doux car ils vieillissent 17-19. En effet, nous avons déjà démontré que la combinaison de TSHI + LPS récapitule les caractéristiques physiopathologiques de EoP, y compris les oligodendrocytes et la perte neuronale, lésions axonales, l'inflammation cellulaire et des anomalies fonctionnelles 20.
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Protocol
Soins en établissement et à utiliser des comités à l'hôpital de deux enfants de Boston et de l'Université du Nouveau-Mexique Health Sciences Center ont approuvé toutes les procédures expérimentales.
REMARQUE: Avant de commencer la procédure, joint, stériliser et autoclave tous les instruments chirurgicaux et des draps chirurgicaux. En outre, de préparer les médicaments post-opératoires dans des flacons stériles, y compris 0,125% bipivucaine et 0,1 mg / kg de buprénorphine. Aussi préparer la solution lipopolysaccharide (LPS) stérilement: 0,04 mg / ml de LPS (0111: B4) dans une solution saline stérile contenant diluer colorant bleu d'Evan.
1. Anesthésie
- Induire une anesthésie dans un jour embryonnaire 18 (E18) enceinte rat Sprague Dawley avec un mélange de 3% d'isoflurane équilibrée 70% d'azote et 30% d'oxygène.
- Retirer rat de la chambre d'induction et placer le décubitus dorsal de rat sur drapé couverture de circulation d'eau chirurgicale réglé à 37 ° C. Transfert anesthésie pour cône de nez et de réduire isofluraNE niveau à 2%.
- Appliquer doucement pommade ophtalmique à chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée. Au cours de la procédure surveiller en permanence la température, le taux de respiration et le rythme de l'animal de coeur. La physiologie maternelle devrait rester stable tout au long de la procédure.
2. Préparation chirurgicale et Gommage
- Utilisation tondeuse pour petits animaux supprimer tous les poils dans la région inférieure de l'abdomen. Raser dans un motif rectangulaire avec soin pour éviter de couper les mamelons ou générer rasoir éruption cutanée qui peut être irritant pour les soins infirmiers avenir de chiots nés vivants.
- Préparer la peau abdominale par l'application de l'éthanol gommage povidone-iode et 70% en alternance avec des tampons de coton stériles. Répétez le gommage de telle sorte que la povidone-iode et 70% d'éthanol sont chacun 3x appliqué de manière alternée. Laisser sécher.
- Confirmez profondeur de l'anesthésie par l'absence de pincement pincée réflexe. En l'absence de réflexe et de stimuli à la douleur, réduire le niveau de l'isoflurane à 1%.
- En utilisant des serviettes chirurgicales stériles,draper l'animal. Prenez soin de placer les rideaux à un angle approprié de telle sorte qu'ils maximisent la quantité de liquide d'irrigation, ils absorbent tout en ne gênant pas la circulation sanguine vers les cornes utérines.
3. abdominale laparotomie
- L'utilisation d'un scalpel faire une incision médiane de 3 cm dans la peau abdominale préparé. Carrément disséquer la couche de la peau de l'aponévrose abdominale avec des ciseaux. En utilisant des pinces et ciseaux chirurgicaux, élever le fascia abdominal et faire une incision de l'alba avasculaire linea pour accéder à la cavité péritonéale.
- Placer gaze chirurgicale à l'extérieur de l'incision et humidifier avec une solution saline stérile. En utilisant le forceps émoussé et une pression externe sur l'abdomen, retirer délicatement les cornes utérines de la cavité péritonéale et les disposer sur la gaze humidifiée.
- Soigneusement éviter l'enchevêtrement et le contact avec les intestins. Organiser foetus en utilisant une pince en communiquant avec seulement le tissu musculaire entre les deux sacs amniotiques individuels.Exposer et isoler les artères utérines 4 utilisant dissection.
NOTE: Il faut prendre soin de disséquer les artères utérines. Tissus environnants et les navires eux-mêmes sont extrêmement délicates. Les dommages aux vaisseaux maternels peut provoquer des saignements, et dans les cas graves, la mort fœtale et maternelle.
4. Placement d'anévrisme Clips
- Placez un anévrisme G pince rat 30 sur chaque artère utérine. D'assurer la cessation de la circulation sanguine, y compris proximale et distale impulsions, et l'assombrissement des vaisseaux utérins dont placentas individuels. Couvrir les cornes exposées et tout le champ opératoire avec de la gaze et irriguer avec une solution saline stérile. Prenez soin de garder le terrain humide avec l'irrigation d'environ toutes les 10 min.
- Après 60 min, retirer la gaze et irriguer le champ. Veiller à ce que les cornes utérines et les vaisseaux sont suffisamment humidifiées pour le retrait du clip de succès. Retirez délicatement chaque clip d'anévrisme en utilisant une pince. Prenez soin de ne pas causer un traumatisme à la cuve, et maintl'intégrité des tissus Ain lors de l'enlèvement.
- Rincer soigneusement les cornes utérines et terrain, en prenant soin d'enlever toutes les discussions errants de gaze des sacs amniotiques.
5. L'injection de lipopolysaccharide pour amniotique Sacs
- A la base de chaque sac amniotique individuelle, juste en avant de la plaque placentaire, injecter 100 ml de LPS (4 ug / sac) avec un colorant bleu de Evan diluée dans le liquide amniotique. Utilisez pince émoussée à stabiliser et à faire tourner chaque sac amniotique dans une position optimale pour l'injection. Colorant bleu de Diluer Evan est un agent de contraste qui est utile pour confirmer le placement de la seringue et l'injection correcte.
REMARQUE: Utilisez uniquement un ultra-fine seringue 0,3 ml à l'insuline avec joint 8 mm 31 G aiguille pour les injections intra-amniotique. Utilisation de grandes aiguilles de calibre se traduira par la perte de liquide amniotique chronique, mort fœtale et la réabsorption de la grossesse. De petites quantités de liquide amniotique fuite lors du retrait de la seringue peuvent être mitigATED par une pression directe sur le sac amniotique. Certains fœtus de rat peuvent tolérer un degré de oligohydramnios. Toutefois, la perte de liquide amniotique aiguë de ponction avec de grandes aiguilles de calibre, ou perforation accidentelle entraînant une fuite chronique de liquide, les résultats dans la perte du fœtus et dans les cas graves, la perte de grossesses voisins. - Irriguer l'utérus cornes 3x avec une solution saline stérile.
6. Fermeture de la laparotomie
- En utilisant des pinces, retourner soigneusement les cornes utérines à la cavité péritonéale. Assurer un espace suffisant entre les sacs amniotiques et l'incision médiane, re-rapprocher les bords de la couche musculofascial utilisant une course suture de soie 3-0. Soyez conscient de l'emplacement des sacs amniotiques lors de la fermeture de l'incision musculaire. Soyez prudent de ne pas suturer dans ou à travers un sac.
- Re-approximation de la couche de peau, en utilisant une suture 3-0 fonctionnement de la soie, la fermeture de la couche de peau.
NOTE: La laparotomie doit être fermé dans deux couches de sutures continues pour permettrepour la peau et de dilatation musculaire avec l'augmentation de la gestation. Sutures continues permettent de tension de la plaie uniformément répartie. Sutures interrompues sont moins désiraient que plusieurs noeuds sont irritants et peuvent être facilement mâchés par le rat sur la récupération de l'anesthésie. Agrafes chirurgicales ne sont pas souhaitées. Tails de noeuds chirurgicaux doivent être coupés très court (<3 mm). - Injecter 1 ml de 0,125% bupivacaïne voie sous-cutanée bords autour de la plaie à l'aide d'une aiguille 26 G. Administrer une dose de 0,1 mg / kg par voie sous cutanée à la buprénorphine nuque.
- Éteignez l'isoflurane et serviette rat sèche que possible. Placez dans un endroit propre cage de la maison et surveiller le rétablissement de l'anesthésie. Assurer rat ne devient pas d'hypothermie.
7. postopératoire Récupération et soins
- Surveiller le rat tous les 8-12 h pour 72 h, puis tous les jours jusqu'à chiots sont nés (environ E22 ou E23). Administrer des doses supplémentaires de buprénorphine q8-12 h / 72 h ou prn comme dicté par le IACUC.
- Surveiller les rats pour des signes de douleur, l'inconfort, des saignements vaginaux ou des saignements du site chirurgical. Inspectez les sutures et incision et veiller à ce rat est pas mâcher ou de retirer leurs sutures prématurément. Bien exceptionnellement rare, les rats qui compromettent leurs sutures sont à risque de déhiscence de la plaie.
NOTE: Parfois rats peuvent ingérer des quantités excessives de literie ou des articles non alimentaires, appelé pica, comme un effet secondaire de l'administration de la buprénorphine. Bien que très rare, les rats doivent être surveillés pour pica et l'obstruction de l'intestin potentiel ultérieur.
8. Traitement des tissus et Cryosectioning
- Pour se préparer à l'hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration du cerveau postnatal, enlever les chiots de leur cage sur postnatale jour 2 (P2). Avec des ciseaux chirurgicaux décapitent les ratons et retirez délicatement le cerveau du crâne.
- Déposer correctif cerveau dans un tube conique de 15 ml contenant 7 ml de paraformaldehyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate(PBS). Placez cerveau à 4 ° C et fixer pendant 72 heures.
- Après 72 heures, transférer cerveaux à une solution PBS stérile contenant 30% de saccharose (p / v) et revenir à 4 ° C.
NOTE: Une fois que les cerveaux tombent dans la solution de saccharose ils sont prêts à être sectionnée sur un cryostat. - Geler rapidement les cerveaux et monter sur un pilon cryostat pour l'acquisition de coupes coronales congelées. Couper 20 um coupes coronales congelées et monter sur des lames. Assurer sections sont recueillis en série.
- Laisser les lames sécher à la température ambiante pendant la nuit. Magasin glisse à -20 ° C.
9. hématoxyline & éosine
- Prenez coulisseau monté coupes congelées et chaud à la température ambiante.
NOTE: Préparer toutes les solutions fraîches. - Placer les lames sur une lame de jeu plus chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
- Transfert glisse à un support de coloration. Tremper les lames 10x dans de l'eau distillée deux déminéralisée (ddH 2 O).
- Incuber les lames à 100% hématoxyline pendant 5 min. Timoi dans hématoxyline peut être optimisée en fonction de degré de coloration pourpre.
- Tremper les lames 4x prise H 2 O, et laisser reposer dans un endroit propre robinet H 2 O pendant 1 min.
- Tremper les lames 15x dans l'alcool de l'acide (250 ml éthanol à 70% + 1 ml d'acide chlorhydrique concentré).
- Tremper les lames 4x prise H 2 O, et laisser reposer dans un endroit propre robinet H 2 O pendant 1 min.
- Incuber dans du carbonate de lithium à 1% pendant 2 min.
- Tremper les lames 4x prise H 2 O, et laisser reposer dans un endroit propre robinet H 2 O pendant 1 min.
- Incuber à 95% d'éthanol pendant 1 min.
- Tremper les lames 7X 100% éosine. Nombre de creux dans l'éosine peut être modifié selon le degré de coloration rose.
- Tremper les lames 5x dans 95% d'éthanol.
- 5x Dip de diapositives dans un nouveau changement de 95% d'éthanol.
- Incuber les lames dans de l'éthanol à 100% pendant 1 min.
- Incuber les lames dans un nouveau changement de 100% d'éthanol pendant 1 min.
- Incuber les lames dans du xylene à 100% pendant 15 min.
REMARQUE: étapes xylène etlamelles devrait se produire dans une hotte. - Incuber les lames dans de nouveaux changements de xylene pendant 15 minutes.
- Lamelle avec Permount et laisser sécher dans une hotte.
- Image glisse avec un microscope optique.
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Representative Results
Après TSHI + LPS au E18, hématoxyline et éosine révèle des anomalies significatives histopathologiques dans le placenta (Figure 1) et dans le cerveau (Figure 2). Placentas examinés sur E19 et E21 sont grossièrement oedémateux avec des micro-hémorragies, et une nécrose au long de la caduque et labyrinthe. Infiltrat inflammatoire importante et augmentation de la vascularisation est également observée. Brains examinés sur P2 révèlent ventriculomégalie, ainsi que la matière blanche et la perte des neurones embase par rapport à Shams. Auparavant, nous avons signalé que TSHI + LPS induit l'inflammation et donne matière blanche persistante et les anomalies axonales concomitantes avec déficience motrice importante chez les jeunes adultes de 20. TSHI LPS + diminue également de manière significative le chlorure de potassium co-transporteur 2 (KCC2) expression de la protéine, un chlorure co-transporteur central pour le développement de l'acide γ-aminobutyrique (GABA) inhibition ergiques, dans le cortex à P15 (Figure 3 13.
Figure 1:. TSHI + LPS induit des anomalies histologiques significatives dans le placenta Après transitoire in utero hypoxie-ischémie et de l'administration de LPS intra-amniotique le jour embryonnaire 18 (E18), les placentas provenant de foetus E19 TSHI + LPS (B) sont grossièrement oedémateux avec l'hémorragie (flèches), la nécrose et infiltrat inflammatoire accrue par rapport à imposture (A, barre d'échelle = 100 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. TSHI + LPS induit des anomalies histologiques significatives dans le cerveau Après transitoire in utero hypoxie-ischémie et de l'administration de LPS intra-amniotique le jour embryonnaire 18 (E18), ventriculomégalie postnatale, embase neurone et blanc perte de matière est observée chez les petits soumis à double TSHI + LPS (B) par rapport à imposture (A) aiguë en P2. (Barre d'échelle = 100 um; Sp = embase; WM = substance blanche; LV = ventricule latéral) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: TSHI + LPS réduit l'expression de KCC2 transferts de Western effectuées à partir mem.préparations branes de micro-disséqués tissu cortical, spectacle in utero transitoire hypoxie-ischémie systémique et l'administration de LPS intra-amniotique le jour embryonnaire 18 (E18) réduit considérablement l'expression de KCC2, un chlorure de potassium co-transporteur spécifique des neurones au centre du développement de circuits intégrés et l'inhibition cérébrale, le jour postnatal 15. (n = 6-10, moyenne ± SEM, le test t de Student, * P <0,05).
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Discussion
Encéphalopathie de prématurité est difficile de modéliser des animaux en raison de l'interaction complexe des étiologies, évolution dans le temps du développement neurologique, la complexité de la formation du réseau cérébral humain, les mécanismes de blessures qui se chevauchent, et les divers phénotypes de SNC insulte manifeste chez les prématurés humaines. EoP est associé à des vulnérabilités spécifiques de type cellulaire (c.-à-oligodendrocytes immatures) 21, ainsi que les voies de développement réglementés divers (c.-à-sous-plaque, transporteurs membranaires et unités des récepteurs) 12,13,22. Toutefois, des progrès significatifs peuvent être réalisés lorsque des modèles animaux répliquer le plus fidèlement la condition humaine que possible. Ici, nous avons développé un modèle d'une insulte prénatale qui intègre l'hétérogénéité des mécanismes de lésion du SNC observées chez le nourrisson prématuré, permettant l'évaluation ultérieure des deux dommages de matière grise et blanche et la récupération. Chez l'homme, les infections bactériennes croissant affaiblissent l'amnios et precipitala rupture prématurée des membranes te. En outre, des défauts de perfusion placentaire soulignent l'interface placenta et perturbent l'homéostasie placentaire. Ainsi, underperfusion placentaire composés lésion du SNC d'une infection intra-utérine. Indéniablement, il est difficile de modéliser le scénario clinique courant de monter les infections bactériennes qui précéderont chorioamniotite chez les rongeurs car ils ont un utérus en duplex. Chaque corne utérine a son propre col, et les grossesses multiples sont effectuées à la fois. Malgré ces défis, les modèles précliniques ont été adaptés pour impliquer de multiples composants de l'unité materno-placentaire-fœtale et incorporer dans l'inflammation in utero à des degrés divers. Bien qu'aucun modèle préclinique individu est idéal pour tester toute hypothèse spécifique, le modèle décrit ici incorpore les anomalies cellulaires et moléculaires, dépréciation comportementale et fonctionnelle, système maternelle-placentaire et fœtale, et l'infection intra-utérine et de composants de l'inflammation placentaire commun à tant MAny prématurité 20,23.
Le choix des espèces utilisées pour modéliser les impacts EoP l'interprétation des données expérimentales dans le cadre des limites inhérentes posés par les espèces. En termes simples, la naissance ne correspond pas à des points similaires de développement du SNC à travers tous les animaux 24. Le modèle décrit ici peut être effectuée dans les deux souris enceintes et les rats, bien que la survie des petits chez la souris est significativement diminuée dans les barrages inexpérimentés ou stressés. Conformément à nos rapports antérieurs, des pertes foetales chez les rats à la naissance (P0) est augmentée chez les animaux TSHI + LPS (environ 40%) par rapport à faux, LPS et TSHI seuls, mais chez les survivants ne présentent pas de différences de poids significatives par P28 20. Similaires aux différences entre les espèces, le moment de la blessure pendant la gestation a un rôle crucial dans la trajectoire du développement neurologique de la progéniture. Le règlement spatio-temporelle des cellules neurales stades de développement de la prolifération, la migration et différenciation diffère entre les divers mammifères 24-26. Ces programmes de développement spécifiques des cellules influencent la vulnérabilité aux blessures. Par exemple, le chevauchement du calendrier des oligodendrocytes lignée et le développement neuronal GABAergique avec le calendrier des naissances prématurées qui rend ces cellules particulièrement sensibles aux insultes périnatales 27-29. Ainsi, ce modèle a été développé chez les rats E18 (et traduit avec succès à des souris E17 sur un fond C57BL / 6) que ce calendrier correspond à l'insulte prénatale globale intra-utérine qui survient chez les nourrissons humains naissance avant extrêmement prématuré à 23-25 semaines de gestation 20 . Nous avons montré précédemment O4-immunoréactive oligodendrocytes immatures sont les plus touchés à ce stade de développement 16. Leur perte est en corrélation avec diminution de la survie et de la maturation 14, avec des réductions les plus notables dans O4 + et stades O1 + de la lignée 16, compatible avec les rapports précédents par d'autres enquêteurs 30. de plus, Nous avons démontré la perte prématurée de l'embase, l'expression de KCC2 réduite, abaissent le seuil convulsif et une altération de la démarche 12,13,15 compatible avec dérégulée GABAergique signalisation chez les prématurés 31.
Le modèle décrit ici offre de nombreux avantages par rapport aux modèles précédents chez les rongeurs utilisés pour étudier une lésion cérébrale périnatale de naissance prématurée 23. Il intègre l'ensemble du système maternelle-placentaire-fœtale et provoque à la fois des traumatismes crâniens et placentaire. Nous avons comparaisons entre imposture déjà publié, TSHI seul, LPS seul et TSHI + LPS et des différences dans les résultats fonctionnels et biochimie 20, et les différences avec graduée TSHI 16. Alors que les enquêtes antérieures de ligatures carotides unilatérales et hypoxie systémique chez les rats nouveau-nés ont versé une approche mécanistique dans de nombreux processus physiopathologiques (c.-à-la susceptibilité des oligodendrocytes immatures à une ischémie), translation directe et releva cliniquence pour ces modèles est moins robuste. En plus des applications décrites, le modèle décrit ici peut être un outil d'information pour les enquêtes sur d'autres systèmes d'organes touchés par la prématurité, y compris l'entérocolite nécrosante (NEC), cœur, poumon, rein et le dysfonctionnement de l'axe hypothalamo-hypophysaire. En raison de la complexité de la pharmacologie LPS et des différences dans la pharmacodynamie maternels et fœtaux, les injections de LPS intrapéritonéale dans les barrages sont moins susceptibles de produire la même réponse inflammatoire foetal montré ici. En outre, le LPS ne traverse pas la barrière placentaire fiable 20,32. Auparavant, nous avons tenté l'application directe du col de l'utérus et de l'injection intra-utérine LPS similaire à ce qui a été décrit dans d'autres modèles de souris 33. Cependant, nous avons constaté que la mortalité et l'incohérence de lésion du SNC a été significativement augmenté chez les chiots au sein de la même portée. Ici, la dose de 4 mg / sac a été optimisé en utilisant des expériences dose-réponse. Des doses croissantes de LPS administré à la amnRésultats du compartiment iotic de la mortalité fœtale accrue. LPS a l'avantage sur l'infection directe avec gram négatif intra-utérins typiques qu'il active la signalisation inflammatoire par le biais de récepteurs toll-like 4 sans causer d'infection bactérienne active et le risque associé de la propagation des pathogènes. Toutefois, ce modèle pourrait être modifié pour inclure les agents pathogènes et les organismes communs isolés à partir de placentas humains, y compris les streptocoques du groupe B, ce qui provoque des anomalies placentaires et neuropathologiques, et le comportement autistique chez les rats 34. De même, Ureaplasma lipoprotéines de multiples antigènes-bandes peut simuler une infection des espèces de Ureaplasma. Depuis Ureaplasma est la cause la plus fréquente de chorioamniotite humaine 35, cela pourrait aussi être une avenue pour les recherches à venir. Comme agents infectieux inactivés plus deviennent disponibles, il sera instructif de déterminer leur impact sur le développement neurologique différentielle et l'efficacité des interventions neuro-réparatrice.
Limitations de ce modèle comprennent la perte de liquide amniotique des injections intra-amniotique. Bien qu'aucun effet est noté avec des injections intra-amniotique de solution saline stérile, le calibre de l'aiguille utilisée pour effectuer les injections est un élément technique essentiel. Il faut prendre soin de ne pas utiliser les aiguilles de 31 G. complications chirurgicales chez le rat maternelle liée à la laparotomie sont extrêmement rares, y compris déhiscence de la plaie, l'occlusion intestinale, une péritonite et une perte complète de la grossesse, à la mortalité maternelle à moins de 5%.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à Dan Firl, Chris Corbett et Jesse Denson, PhD. Le financement a été fourni par le NIH NINDS R01 NS060765 à SR, le P30 Programme pilote Cobre à LJ et le Programme de santé de l'enfant Signature à LJ à l'Université du Nouveau-Mexique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
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