Abstract
Encefalopatia di prematurità (EOP) è un termine che comprende il sistema nervoso centrale (SNC) anomalie associate alla nascita pretermine. Per migliori obiettivi anticipo traslazionali e scoprire nuove strategie terapeutiche per le lesioni del cervello associata alla nascita pretermine, modelli preclinici di EoP devono includere meccanismi simili di lesioni globale prenatale osservato negli esseri umani e coinvolgere più componenti del sistema materno-placentare-fetale. Idealmente, i modelli dovrebbero produrre un simile spettro di deficit funzionali nell'animale maturo e ricapitolare molteplici aspetti della fisiopatologia. Per simulare difetti umani sistemici placentari perfusione placentare, ipoperfusione e / o corioamnionite associate a infiammazione patogeno-indotta nei primi mesi del parto pretermine, abbiamo sviluppato un modello di prenatale transitorio sistemica ipossia-ischemia (TSHI) in combinazione con lipopolisaccaride intra-amniotico (LPS). In gravidanza ratti Sprague Dawley, TSHI via uterina occlusione dell'arteria on giorno embrionale 18 (E18) induce un difetto ipoperfusione placentare graduata associata con l'aumento danno del sistema nervoso centrale del feto. Se combinato con iniezioni intra-LPS amniotico, infiammazione placentare è aumentata e il danno del sistema nervoso centrale è aggravato con associati materia, andatura e di imaging anomalie bianchi. Prenatale TSHI e TSHI + LPS insulti prenatali incontrano molti dei criteri di un modello EoP compreso ricapitolando l'insulto intrauterina, causando la perdita di neuroni, oligodendrociti e degli assoni, la perdita di piastra e deficit funzionali in animali adulti che imitano quelli osservati nei bambini nati estremamente pretermine. Inoltre, questo modello consente la dissezione di infiammazione indotta da tipi di lesioni divergenti.
Introduction
Con oltre il 12% dei bambini nati negli Stati Uniti prima di 37 settimane di età gestazionale stimata 1, danno cerebrale perinatale (PBI) da prematurità è una causa importante di invalidità permanente. PBI da prematurità, encefalopatia anche chiamato di prematurità (EOP), colpisce tutto il sistema nervoso centrale (SNC). Lesioni del sistema nervoso centrale spesso inizia in utero, ed è aggravata da processi prenatali tra cui corionamnionite e le complicanze post-natali, quali ipossia e sepsi. PBI da insulti sistemici altera neurosviluppo e porta alla paralisi cerebrale, epilessia, ritardo cognitivo e numerosi disturbi neuropsichiatrici che interessano la regolazione emotiva, la memoria e la funzione esecutiva 1,2. Anche se sono stati fatti molti progressi, una comprensione limitata rimane di come le conseguenze cellulari e molecolari delle lesioni del sistema nervoso centrale da parto pretermine traducono alla moltitudine di sequele neurologiche nei bambini che sono nati pretermine. Questa mancanza di conoscenze posterioriERS diagnosi in tempo reale del sistema nervoso centrale la gravità delle lesioni e il dosaggio informato degli interventi emergenti. Inoltre, adeguate all'età strategie terapeutiche per questa popolazione di pazienti vulnerabili rimangono elusivi.
Infiammazione intrauterina è molto comune in estrema prematurità e coinvolge una cascata infiammatoria materno-fetale-placentare complesso 3. Infezione intrauterina è spesso subclinica. Risultati placentari specifiche coerenti con infiammazione acuta, o corionamnionite istologico, sono i principali determinanti della risposta infiammatoria fetale e sono coincidenti con lesioni cerebrali associati alla nascita pretermine 3-5. In effetti, la risposta infiammatoria fetale ha implicazioni cliniche distinte per i risultati a lungo termine da parto pretermine. I bambini che sono piccoli per l'età gestazionale (SGA) o che sperimentano infezione sono particolarmente vulnerabili alle deficit neurologico 3,4. Corionamnionite è una diagnosi patologica tipica dopo la nascita pretermine
Per simulare difetti umani placentare perfusione sistemici e corionamnionite associati con l'infiammazione patogeno-indotta, abbiamo sviluppato un modello di prenatale transitorio sistemica ipossia-ischemia (TSHI) in combinazione con lipopolisaccaride intra-amniotico (LPS) nei ratti. Il nostro obiettivo era quello di adattare il nostro modello di TSHI solo nei ratti 12-16 per includere infiammazione intrauterina,per facilitare la modellazione preclinico di lesioni del sistema nervoso centrale associato a nascita pretermine. TSHI solo ha rivelato la perdita persistente di cellule lignaggio oligodendrogliali, neuroni corticali, aumento della morte cellulare, e elevati livelli di citochine pro-infiammatorie, con intervalli ischemici progressivi che portano a un modello graduato di lesioni compatibili con lesioni cerebrali prenatale 16. Le modifiche ai componenti ischemiche di questo modello hanno anche dimostrato deficit nella codifica della memoria, a breve e memoria a lungo termine e le alterazioni muscolo-scheletriche lievi nei ratti come 17-19 invecchiano. In effetti, abbiamo precedentemente dimostrato che la combinazione di TSHI + LPS ricapitola le caratteristiche fisiopatologiche della EoP, tra cui oligodendrociti e perdita neuronale, danno assonale, infiammazione cellulare e anomalie funzionali 20.
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Protocol
Cura istituzionale e Usa Comitati all'ospedale sia dei bambini di Boston e l'Università del New Mexico Health Sciences Center hanno approvato tutte le procedure sperimentali.
NOTA: Prima di iniziare la procedura, sigillo, sterilizzare in autoclave e tutti gli strumenti chirurgici e teli chirurgici. Inoltre, preparare i farmaci post-operatorie in fiale sterili, tra cui 0,125% bipivucaine e 0,1 mg / kg di buprenorfina. Preparare anche la soluzione lipopolisaccaride (LPS) sterilmente: 0,04 mg / ml (LPS 0111: B4) in soluzione fisiologica sterile contenente diluire colorante blu di Evan.
1. Anestesia
- Indurre anestesia in un giorno embrionale 18 (E18) Sprague Dawley incinta ratto con una miscela di 3% isoflurano bilanciato 70% di azoto e del 30% di ossigeno.
- Rimuovere ratto dalla camera di induzione e posizionare il supina ratto su chirurgica coperta acqua circolante drappeggiata a 37 ° C. Trasferimento anestesia a cono e ridurre isofluraLivello ne al 2%.
- Applicare delicatamente pomata oftalmica per ciascun occhio per evitare l'essiccazione della cornea. Durante la procedura di continuo monitoraggio della temperatura, frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca dell'animale. Fisiologia materna dovrebbe rimanere stabile durante tutta la procedura.
2. chirurgico Prep e Scrub
- Utilizzando piccoli tagliatori animali rimuovere tutti i capelli nella regione addominale inferiore. Shave in un modello rettangolare con cura per evitare di intaccare i capezzoli o la generazione di eruzioni cutanee rasoio che può essere irritante per il futuro di cura di cuccioli nati vivi.
- Preparare la pelle addominale alternando applicazione di povidone-iodio e il 70% di etanolo scrub con tamponi di cotone sterili. Ripetere la macchia in modo che iodopovidone e il 70% di etanolo sono ciascuno applicato 3x in modo alterno. Lasciate asciugare.
- Confermare profondità dell'anestesia via dell'assenza di convergenza pizzico reflex. In assenza di riflessi e stimoli al dolore, ridurre il livello di isoflurano al 1%.
- Usando i tovaglioli chirurgici sterili,drappeggio l'animale. Fare attenzione a posizionare le tende in un angolo appropriato tale da massimizzare la quantità di liquido di irrigazione che assorbono pur non ostacolare il flusso di sangue per le corna uterine.
3. addominale laparotomia
- Usando un bisturi fare una incisione mediana 3 cm nella pelle addominale preparato. Senza mezzi termini sezionare lo strato di pelle dalla fascia addominale con le forbici. Utilizzando pinze e forbici chirurgiche, elevare lo strato fasciale addominale ed effettuare una incisione della linea alba avascolare per accedere alla cavità peritoneale.
- Posizionare garza all'esterno dell'incisione e bagnare con soluzione fisiologica sterile. Utilizzando pinze smussato e pressione esterna sull'addome, rimuovere delicatamente le corna uterine dalla cavità peritoneale e disporre sulla garza inumidita.
- Evitare accuratamente entanglement e il contatto con gli intestini. Disporre feti con pinze contattando solo il tessuto muscolare in tra i singoli sacchi amniotici.Esporre e isolare i 4 arterie uterine utilizzando smussa.
NOTA: Si deve prestare attenzione a sezionare le arterie uterine. Tessuto circostante e dei vasi stessi sono estremamente delicati. Danni ai vasi materni può causare sanguinamento, e nei casi più gravi, morte fetale e materna.
4. Posizionamento di clip per aneurisma
- Posizionare un G clip di topo 30 aneurisma dell'arteria uterina ogni. Garantire la cessazione del flusso di sangue, tra cui prossimali e distali impulsi, e oscuramento dei vasi uterini tra cui singole placente. Coprire le corna a vista e tutto il campo chirurgico con garza ed irrigare con soluzione salina sterile. Fare attenzione a mantenere il campo umido con irrigazione circa ogni 10 min.
- Dopo 60 minuti, rimuovere la garza e irrigare il campo. Assicurarsi che le corna uterine e le navi sono adeguatamente inumidite per la rimozione della clip di successo. Rimuovere delicatamente ogni clip aneurisma con pinze. Fare attenzione a non causare traumi alla nave, e maintl'integrità dei tessuti ain durante la rimozione.
- Lavare bene le corna uterine e campo, avendo cura di rimuovere eventuali discussioni randagi di garza dalle sacche amniotiche.
5. Iniezione di Lipopolisaccaride per Amniotic Sacs
- Alla base di ogni singolo sacco amniotico, solo anteriore alla piastra placentare, iniettare 100 ml di LPS (4 mg / sac) con colorante blu diluito di Evan per il liquido amniotico. Utilizzare pinze smussato per stabilizzare e ruotare ogni sacco amniotico per una posizione ottimale per l'iniezione. Colorante blu di Evan è Diluire un mezzo di contrasto che è utile per confermare il corretto posizionamento siringa e l'iniezione.
NOTA: Usare solo un ultra-sottile siringa da 0,3 ml di insulina con annesso 8 millimetri 31 ago G per le iniezioni intra-amniotico. Usando aghi calibro maggiore comporterà la perdita del liquido amniotico cronica, morte fetale e il riassorbimento della gravidanza. Piccole quantità di perdite di liquido amniotico dopo l'estrazione della siringa può essere mitigated dalla pressione diretta al sacco amniotico. Alcuni feti di ratto possono tollerare un certo grado di oligoidramnios. Tuttavia, la perdita di liquido amniotico acuta da puntura con i grandi aghi calibro, o puntura accidentale con conseguente perdita di fluido cronico, si traduce in perdita fetale e nei casi più gravi, la perdita di gravidanze vicini. - Irrigare il uterino corna 3x con soluzione salina sterile.
6. Chiusura della laparotomia
- Utilizzando pinze, tornare attentamente le corna uterine alla cavità peritoneale. Garantire un adeguato spazio tra le sacche amniotiche e l'incisione mediana, nuovamente ravvicinare le bordi del livello muscolofasciale utilizzando una esecuzione di sutura 3-0 seta. Essere consapevoli del posizionamento dei sacchi amniotici durante la chiusura l'incisione muscolo. Fare attenzione a non a suturare dentro o attraverso un sac.
- Re-approssimare lo strato di pelle, usando una sutura 3-0 esecuzione seta, chiudendo lo strato di pelle.
NOTA: La laparotomia deve essere chiuso in due strati di sutura continua per consentireper la pelle e l'espansione muscolare con l'aumentare della gestazione. Suture continue consentono di tensione ferita uniformemente distribuito. Punti staccati sono meno desiderati come più nodi sono irritanti e possono essere facilmente masticati dal topo in recupero da anestesia. Punti chirurgici non sono desiderati. Code dei nodi chirurgici devono essere tagliati molto corti (<3 mm). - Iniettare 1 ml di 0,125% bupivacaina per via sottocutanea bordi intorno ferita con un ago 26 G. Somministrare una dose di 0,1 mg / kg per via sottocutanea alla buprenorfina nuca.
- Spegnere isoflurano e asciugamano ratto asciutto, se necessario. Mettere in gabbia casa pulita e monitorare il recupero dall'anestesia. Garantire ratto non diventi ipotermico.
7. postoperatoria recupero e cura
- Monitorare il ratto ogni 8-12 ore per 72 ore e poi tutti i giorni fino cuccioli sono nati (circa E22 o E23). Somministrare ulteriori dosi di buprenorfina q8-12 ore / 72 ore o prn come dettato dalla IACUC.
- Monitorare ratti per segni di dolore, disagio, sanguinamento vaginale o sanguinamento dal sito chirurgico. Ispezionare le suture e incisione e fare attenzione a garantire topo non è masticare o rimuovendo i loro punti di sutura prematuramente. Anche se eccezionalmente raro, i ratti che compromettono i loro punti di sutura sono a rischio di deiscenza della ferita.
NOTA: A volte i ratti possono ingerire quantità eccessive di biancheria da letto o di generi non alimentari, chiamato pica, come effetto collaterale di amministrazione buprenorfina. Anche se molto raro, topi devono essere monitorati per la pica e potenziale conseguente occlusione intestinale.
8. Tissue Processing e criosezionamento
- Per preparare Ematossilina e eosina (H & E) la colorazione del cervello post-natale, rimuovere i cuccioli dalla loro gabbia casa il postnatale giorno 2 (P2). Utilizzando le forbici chirurgiche decapitano cuccioli di ratto e delicatamente rimuovere il cervello dal cranio.
- Goccia correzione cervello in un tubo da 15 ml contenente 7 ml di 4% paraformaldeide in tampone fosfato(PBS). Posizionare il cervello a 4 ° C e fissare per 72 ore.
- Dopo 72 ore, trasferire cervelli di una soluzione sterile di PBS contenente il 30% di saccarosio (w / v) e ritornare a 4 ° C.
NOTA: Una volta cervelli goccia nella soluzione di saccarosio sono pronti per essere sezionato su un criostato. - Rapidamente congelare il cervello e il montaggio su pestello criostato per l'acquisizione di sezioni coronali congelate. Tagliare 20 micron sezioni coronali congelate e montare su vetrini. Assicurarsi che le sezioni sono raccolti in serie.
- Lasciare i vetrini si asciughino notte a temperatura ambiente. Conservare scivola a -20 ° C.
9. ematossilina & eosina
- Prendere scivolo montato sezioni congelate e caldo a temperatura ambiente.
NOTA: Preparare tutte le soluzioni fresco. - Collocare i vetrini in una diapositiva set più calda a 50 ° C per 2 ore.
- Trasferire i vetrini in un rack per colorazione. Dip scivola 10x in acqua bidistillata deionizzata (DDH 2 O).
- Incubare i vetrini in 100% ematossilina per 5 min. Time in ematossilina può essere ottimizzata a seconda del grado di colorazione viola.
- Immergere i vetrini 4x in rubinetto H 2 O, e lasciare riposare in un ambiente pulito rubinetto H 2 O per 1 min.
- Dip scivola 15x in alcool acido (250 ml 70% di etanolo + 1 ml di acido cloridrico).
- Immergere i vetrini 4x in rubinetto H 2 O, e lasciare riposare in un ambiente pulito rubinetto H 2 O per 1 min.
- Incubare in 1% di carbonato di litio per 2 min.
- Immergere i vetrini 4x in rubinetto H 2 O, e lasciare riposare in un ambiente pulito rubinetto H 2 O per 1 min.
- Incubare in 95% di etanolo per 1 min.
- Immergere i vetrini 7x in 100% eosina. Numero di cali di Eosina può essere modificato a seconda del grado di colorazione rosa.
- Immergere i vetrini in 5x 95% di etanolo.
- 5x Dip diapositiva in una nuova variazione del 95% di etanolo.
- Incubare i vetrini in etanolo al 100% per 1 min.
- Incubare i vetrini in una nuova variazione di etanolo 100% per 1 min.
- Incubare i vetrini in 100% xilene per 15 min.
NOTA: passaggi xilene emontavetrini dovrebbe avvenire in una cappa aspirante. - Incubare i vetrini a nuove modifiche di xilene per 15 min.
- Coverslip con Permount e lasciare asciugare in cappa.
- Immagine vetrini con un microscopio ottico.
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Representative Results
A seguito di TSHI + LPS a E18, ematossilina e eosina rivela significative alterazioni istopatologiche sia la placenta (Figura 1) e nel cervello (Figura 2). Placente esaminate su E19 e E21 sono grossolanamente edematosi con micro-emorragie e necrosi in tutto il decidua e labirinto. Si osserva anche infiltrato infiammatorio e significativo aumento della vascolarizzazione. Brains esaminati sulla P2 rivelano ventricolomegalia, così come la perdita di materia bianca e piastra neuroni rispetto a falsità. In precedenza, abbiamo riportato che TSHI + LPS induce infiammazione e produce sostanza bianca e persistente anormalità assonale concomitanti con significative disabilità motoria nei giovani adulti 20. TSHI + LPS anche diminuisce notevolmente cloruro di potassio co-trasportatore 2 (KCC2) espressione della proteina, un cloruro co-trasportatore centrale per lo sviluppo di acido γ-aminobutirrico (GABA) inibizione ergica, nella corteccia a P15 (Figura 3 13.
Figura 1:. TSHI + LPS induce significative alterazioni istologiche nella placenta Dopo transitorio in utero ipossia-ischemia e amministrazione LPS intra-amniotico giorno embrionale 18 (E18), placente di feti E19 TSHI + LPS (B) sono grossolanamente edematosi con emorragia (frecce), necrosi e una maggiore infiltrato infiammatorio rispetto a sham (A, barra della scala = 100 micron). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. TSHI + LPS induce significative alterazioni istologiche nel cervello seguito transitorio in utero ipossia-ischemia e amministrazione LPS intra-amniotico giorno embrionale 18 (E18), ventricolomegalia postnatale, a piastra neurone e la perdita di materia bianca si osserva in cuccioli sottoposti a doppio TSHI + LPS (B) rispetto a sham (A) acutamente a P2. (Scala bar = 100 micron; Sp = piastra; WM = sostanza bianca; LV = ventricolo laterale) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: TSHI + LPS riduce espressione KCC2 Western blot eseguiti da mem.preparazioni brane di tessuto corticale micro-sezionato, spettacolo in utero transitorio ipossia-ischemia sistemica e amministrazione LPS intra-amniotico giorno embrionale 18 (E18) riduce in modo significativo l'espressione di KCC2, un cloruro di potassio co-transporter specifica dei neuroni centrali per lo sviluppo di circuiti cerebrali integrati e di inibizione, il giorno dopo la nascita 15. (n = 6-10, media ± SEM, test t, * P <0,05).
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Discussion
Encefalopatia di prematurità è difficile da modellare negli animali a causa della complessa interazione di eziologie, decorso dello sviluppo neurologico, complessità di formazione delle reti cerebrale umana, meccanismi di danno che si sovrappongono, e le diverse fenotipi di CNS insulti manifestano nei neonati prematuri umani. EoP è associato con specifiche vulnerabilità delle cellule di tipo (cioè oligodendrociti immaturi) 21, così come diversi percorsi evolutivamente regolamentati (cioè a piastra, trasportatori di membrana e subunità del recettore) 12,13,22. Tuttavia, progressi significativi può essere fatta quando modelli animali replicare la condizione umana il più possibile. Qui, abbiamo sviluppato un modello un insulto prenatale che incorpora l'eterogeneità dei meccanismi di danno del SNC osservati nel neonato pretermine, consentendo successiva valutazione sia del danno sostanza grigia e bianca e recupero. Negli esseri umani, le infezioni batteriche ascendente indeboliscono sacco amniotico e precipitazionite rottura prematura delle membrane. Inoltre, difetti di perfusione placentare sottolineano l'interfaccia placentare e disturbare l'omeostasi placentare. Così, ipoperfusione placentare composti lesioni del sistema nervoso centrale da un'infezione intrauterina. Innegabilmente, è difficile da modellare lo scenario clinico comune ascendente infezioni batteriche che precederanno corionamnionite nei roditori in quanto hanno un utero duplex. Ogni corno uterino ha la sua cervice, e gravidanze multiple sono effettuate in una sola volta. Nonostante queste sfide, modelli preclinici sono state adattate per coinvolgere più componenti dell'unità materno-placentare-fetale e integrare in utero infiammazione a vari livelli. Mentre nessun individuo modello preclinico è ideale per testare ogni ipotesi specifica, il modello qui descritto incorpora le anomalie cellulari e molecolari, di valore comportamentale e funzionale, sistema materno-placentare-fetale, e l'infezione intrauterina e componenti infiammazione placentare comune a così many pretermine nascite 20,23.
La scelta delle specie utilizzate per modellare impatti EoP l'interpretazione dei dati sperimentali nel contesto delle limitazioni intrinseche che presentano le specie. In termini più semplici, la nascita non equivale a punti simili di sviluppo del sistema nervoso centrale in tutti gli animali 24. Il modello qui descritto può essere eseguita sia in topi e ratti in stato di gravidanza, anche se la sopravvivenza dei cuccioli nei topi è significativamente diminuita in dighe inesperti o stressati. In linea con i nostri rapporti precedenti, perdita fetale nei ratti alla nascita (P0) è aumentato negli animali TSHI + LPS (circa il 40%) rispetto al sham, LPS e TSHI solo, ma i cuccioli sopravvissuti non presentano significative differenze di peso attraverso P28 20. Simile a differenze tra le specie, i tempi di lesioni durante la gestazione ha un ruolo cruciale nella traiettoria dello sviluppo neurologico della prole. La regolazione spazio-temporale di cellule neurali fasi di sviluppo di proliferazione, la migrazione e la differentiation differisce fra vari mammiferi 24-26. Questi programmi di sviluppo specifici delle cellule influenzano la vulnerabilità di un infortunio. Ad esempio, la sovrapposizione dei tempi di oligodendrociti lignaggio e GABAergici sviluppo neuronale con i tempi della nascita pretermine rende queste cellule particolarmente sensibili agli insulti perinatali 27-29. Così, questo modello è stato sviluppato nel ratto E18 (e con successo tradotto in E17 topi su un C57BL / 6 background) come questo calendario corrisponde al intrauterina insulto prenatale globale che si verifica nei neonati umani nascita prima di estremamente pretermine a 23-25 settimane di gestazione 20 . Abbiamo precedentemente dimostrato O4-immunoreattive oligodendrociti immaturi sono i più colpiti in questa fase di sviluppo 16. La loro perdita correla con ridotta sopravvivenza e la maturazione 14, con le riduzioni più importanti in O4 + e O1 + fasi della stirpe 16, in linea con le precedenti relazioni di altri ricercatori 30. Inoltre, Abbiamo dimostrato la perdita prematura del piastra, espressione KCC2 ridotta, soglia delle convulsioni più bassa e ridotta andatura 12,13,15 coerente con deregolazione GABAergici di segnalazione nei neonati pretermine 31.
Il modello qui descritto offre numerosi vantaggi rispetto ai modelli precedenti nei roditori utilizzati per studiare danno cerebrale perinatale da parto pretermine 23. Incorpora l'intero sistema materno-placentare-fetale e provoca sia il cervello e lesioni placentare. Abbiamo già pubblicato i confronti tra finzione, TSHI da solo, LPS solo e TSHI + LPS e differenze nei risultati funzionali e la biochimica 20, e le differenze con classificato TSHI 16. Mentre le indagini preliminari di legature carotidee unilaterali e ipossia sistemica in ratti neonati hanno versato una visione meccanicistica in numerosi processi fisiopatologici (cioè la suscettibilità degli oligodendrociti immaturi all'ischemia), traslazionale diretto e Releva clinicance per tali modelli è meno robusta. Oltre alle applicazioni descritte, il modello qui descritto può essere uno strumento informativo per le indagini di altri organi colpiti da prematurità, tra cui enterocolite necrotizzante (NEC), cuore, polmone, renali e disfunzione asse ipotalamo-ipofisi. A causa delle complessità di LPS farmacologia e delle differenze di farmacodinamica materne e fetali, iniezioni LPS intraperitoneale di dighe hanno meno probabilità di produrre la stessa risposta infiammatoria fetale mostrato qui. Inoltre, LPS non attraversa la placenta in modo affidabile 20,32. In precedenza, abbiamo tentato applicazione cervicale diretta di LPS e iniezione intrauterina simile a quanto descritto in altri modelli murini 33. Tuttavia, abbiamo trovato che la mortalità e l'incoerenza di lesioni del sistema nervoso centrale era significativamente aumentata tra cuccioli all'interno della stessa cucciolata. Qui, la dose di 4 mg / uscita è stato ottimizzato mediante esperimenti dose-risposta. L'aumento delle dosi di LPS somministrati al AMNrisultati vano iotico a un aumento della mortalità fetale. LPS ha il vantaggio rispetto contagio diretto con batteri tipici intrauterine gram-negativi, nel senso che attiva la segnalazione infiammatoria attraverso toll-like receptor 4 senza causare infezione batterica attiva e il rischio associato di diffusione degli agenti patogeni. Tuttavia, questo modello potrebbe essere modificato per includere patogeni e organismi comuni isolati da placente umane, tra cui streptococco del gruppo B, che provoca placentari e neuropatologici anomalie, e comportamento autistico-simili nei ratti 34. Allo stesso modo, Ureaplasma lipoproteine antigeni multipli fasciato in grado di simulare l'infezione specie Ureaplasma. Poiché Ureaplasma è la causa più comune di corioamnionite umano 35, questo potrebbe anche essere una via per la ricerca futura. Come agenti più inattivati infettiva saranno disponibili, sarà informativo per determinare il loro impatto differenziato sviluppo neurologico e l'efficacia degli interventi neuro-riparativa.
Limitazioni di questo modello includono perdita di liquido amniotico dalle iniezioni intra-amniotico. Anche se nessun effetto si nota con iniezioni intra-amniotico di soluzione salina sterile, il calibro dell'ago utilizzato per eseguire le iniezioni è un elemento tecnico fondamentale. Bisogna fare attenzione a non utilizzare aghi più grandi di 31 G. complicazioni chirurgiche nel ratto madre relativa alla laparotomia sono estremamente rari, tra cui deiscenza della ferita, occlusione intestinale, peritonite e completa perdita della gravidanza, con la mortalità materna inferiore al 5%.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a Dan Firl, Chris Corbett e Jesse Denson, PhD. Il finanziamento è stato fornito dal NIH NINDS R01 NS060765 per SR, il P30 Cobre programma pilota di LJ e la firma del programma Child Health di LJ presso l'Università del New Mexico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
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