Abstract
Encefalopatía del prematuro (EOP) es un término que abarca el sistema nervioso central (SNC) anormalidades asociadas con el parto prematuro. Para mejores objetivos de traslación antelación y descubrir nuevas estrategias terapéuticas para la lesión cerebral asociada con el parto prematuro, modelos preclínicos de EOP deben incluir mecanismos similares de lesión mundial prenatal observado en los seres humanos y la participación de múltiples componentes del sistema materno-placentaria-fetal. Idealmente, los modelos deben producir un espectro similar de déficit funcional en el animal maduro y recapitular los múltiples aspectos de la fisiopatología. Para imitar los defectos humanos sistémicas placentarios perfusión, hipoperfusión placentaria y / o corioamnionitis asociados con la inflamación inducida por patógenos en el parto prematuro temprano, hemos desarrollado un modelo de prenatal transitoria hipoxia-isquemia sistémica (Tshi) combinado con lipopolisacárido intra-amniótica (LPS). En embarazadas ratas Sprague Dawley, Tshi través de oclusión de la arteria uterina on día embrionario 18 (E18) induce un defecto hipoperfusión placentaria graduada asociada con el aumento de daño en el SNC en el feto. Cuando se combina con inyecciones de LPS intra-amniótico, la placenta se incrementa la inflamación y daño en el SNC se ve agravado con la materia, de la marcha y de imagen anomalías blancos asociados. Prenatal Tshi y Tshi + LPS insultos prenatales cumplen varios de los criterios de un modelo de EOP incluyendo recapitulando el insulto intrauterino, causando la pérdida de neuronas, oligodendrocitos y los axones, la pérdida de la placa de conexión, y los déficits funcionales en animales adultos que imitan a los observados en los niños nacidos extremadamente prematuro. Además, este modelo permite la disección de la inflamación inducida por los tipos de lesiones divergentes.
Introduction
Con más del 12% de los bebés nacidos en los Estados Unidos antes de la edad de las 37 semanas de gestación estimada 1, lesión cerebral perinatal (PBI) de la prematuridad es una causa importante de discapacidad permanente. PBI de la prematuridad, la encefalopatía también denominado del prematuro (EOP), afecta a todo el sistema nervioso central (SNC). Lesión del SNC a menudo comienza en el útero, y se ve exacerbada por procesos prenatales incluyendo corioamnionitis y las complicaciones postnatales tales como la hipoxia y sepsis. PBI de insultos sistémicos altera el desarrollo neurológico y conduce a la parálisis cerebral, epilepsia, retraso cognitivo y numerosos trastornos neuropsiquiátricos que afecta a la regulación emocional, la memoria y la función ejecutiva 1,2. Aunque se ha avanzado mucho, una comprensión limitada sigue siendo cómo las consecuencias celulares y moleculares de la lesión del SNC desde el nacimiento prematuro se traducen en la multitud de secuelas neurológicas en los niños que nacen prematuros. Esta falta de conocimiento traserares diagnóstico en tiempo real de la gravedad de la lesión del SNC y la dosificación informado de las intervenciones emergentes. Además, las estrategias terapéuticas apropiadas a su edad para esta población de pacientes vulnerables siguen siendo difícil de alcanzar.
Inflamación intrauterina es muy común en la prematuridad extrema e implica una compleja cascada inflamatoria fetal-materno-placentaria 3. La infección intrauterina suele ser subclínica. Hallazgos placentarios específicos consistentes con la inflamación aguda o corioamnionitis histológica, son los principales determinantes de la respuesta inflamatoria fetal y son coincidentes con lesión cerebral asociada con el parto prematuro 3-5. De hecho, la respuesta inflamatoria fetal tiene implicaciones clínicas distintas de resultados a largo plazo desde el nacimiento prematuro. Los bebés que son pequeños para la edad gestacional (PEG) o que experimentar la infección son excepcionalmente vulnerables a los déficit neurológico 3,4. La corioamnionitis es un diagnóstico típico patológica tras el parto prematuro
Para imitar los defectos de perfusión placentaria sistémicos humanos y corioamnionitis asociados con la inflamación inducida por patógenos, hemos desarrollado un modelo de prenatal transitoria hipoxia-isquemia sistémica (Tshi) combinado con lipopolisacárido intra-amniótica (LPS) en ratas. Nuestro objetivo era adaptar nuestro modelo de Tshi solo en ratas 12-16 para incluir la inflamación intrauterina,para facilitar el modelado preclínica de lesión del SNC asociado con el parto prematuro. Tshi solo ha revelado pérdida persistente de células del linaje oligodendroglial, las neuronas corticales, el aumento de la muerte celular, y niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias, con intervalos de isquemia progresiva que conduce a un patrón graduada de la lesión consistente con lesión cerebral prenatal 16. Las modificaciones a los componentes isquémicos de este modelo han demostrado también déficits en la codificación de la memoria, y la memoria a corto a largo plazo y alteraciones musculoesqueléticas leves en ratas, ya que 17-19 de envejecen. De hecho, hemos demostrado previamente que la combinación de Tshi + LPS recapitula las características fisiopatológicas de la EOP, incluyendo los oligodendrocitos y la pérdida neuronal, lesión axonal, la inflamación celular y las anormalidades funcionales 20.
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Protocol
Atención Institucional y el empleo Comités en el Hospital de Niños de Boston, tanto y la Universidad de Nuevo Centro de Ciencias de Salud de Nuevo México aprobó todos los procedimientos experimentales.
NOTA: Antes de comenzar el procedimiento, el sello, esterilizar y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y paños quirúrgicos. Además, preparar medicamentos post-operatorios en viales estériles incluyendo 0,125% bipivucaine y 0,1 mg / kg de buprenorfina. También hay que preparar la solución de lipopolisacárido (LPS) de forma estéril: 0,04 mg / ml de LPS (0111: B4) en solución salina estéril que contiene diluir colorante azul de Evan.
1. Anestesia
- Inducir la anestesia en un día embrionario 18 (E18) de ratas Sprague Dawley embarazada con una mezcla de 3% de isoflurano equilibrado 70% de nitrógeno y 30% de oxígeno.
- Retire la rata de la cámara de inducción y coloque la supina rata en quirúrgico envuelto manta de agua que circula a 37 ° C. Traslado anestesia para cono de la nariz y reducir isofluranivel ne a 2%.
- Aplique suavemente pomada oftálmica a cada ojo para prevenir la sequedad de la córnea. Durante el procedimiento de monitorear continuamente la temperatura, la tasa de respiración y la frecuencia cardiaca del animal. Fisiología materna debe permanecer estable durante todo el procedimiento.
2. Preparación quirúrgica y Scrub
- Usando pequeñas tijeras de animales eliminan todo el pelo en la región abdominal inferior. Afeitarse en un patrón rectangular con cuidado para evitar mellar los pezones o la generación de erupción de afeitar que puede ser irritante para el futuro de la enfermería de los cachorros nacidos vivos.
- Preparar la piel abdominal por la alternancia de aplicación de povidona yodada y el 70% de etanol frote con hisopos de algodón estériles. Repita el matorral de tal manera que la povidona yodada y etanol 70% son cada aplicado 3x de forma alterna. Deje que se seque.
- Confirme la profundidad de la anestesia a través de ausencia de reflejo toe-pinch. En ausencia de reflejo y estímulos de dolor, reducir el nivel de isoflurano al 1%.
- El uso de toallas quirúrgicos estériles,cuelgue el animal. Tenga cuidado de colocar las cortinas en un ángulo apropiado de tal manera que maximizan la cantidad de fluido de irrigación que absorben mientras que no obstruye el flujo de sangre a los cuernos uterinos.
3. La laparotomía abdominal
- Con un bisturí hacer una incisión en la línea media de 3 cm en la piel abdominal preparada. Sin rodeos diseccionar la capa de piel de la fascia abdominal con tijeras. Usando fórceps y tijeras quirúrgicas, elevar la capa fascial abdominal y hacer una incisión de la línea alba avascular para obtener acceso a la cavidad peritoneal.
- Coloque gasa quirúrgica en el exterior de la incisión y humedecer con solución salina estéril. Con unas pinzas romas y presión externa sobre el abdomen, retire con cuidado los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal y organizar en la gasa humedecida.
- Evitar con cuidado el enredo y el contacto con los intestinos. Organizar fetos utilizando pinzas contactando sólo el tejido muscular en entre sacos amnióticos individuales.Exponer y aislar a las 4 arterias uterinas mediante disección roma.
NOTA: Se debe tener cuidado para diseccionar las arterias uterinas. Tejido circundante y los vasos mismos son extremadamente delicada. El daño a los vasos maternos puede causar sangrado, y en casos severos, muerte fetal y materna.
4. Colocación de los clips de aneurismas
- Coloque una G clip de aneurisma de la rata 30 en cada arteria uterina. Asegurar la cesación del flujo de sangre, incluyendo proximal y pulsos distales, y oscurecimiento de los vasos uterinos incluyendo placentas individuales. Cubra los cuernos a la vista y campo quirúrgico entero con una gasa y regar con solución salina estéril. Tenga cuidado de mantener el terreno húmedo con riego aproximadamente cada 10 min.
- Después de 60 minutos, retire la gasa y el riego del campo. Asegúrese de que los cuernos uterinos y los vasos se humedecen de manera adecuada para la eliminación de clip de éxito. Retire con cuidado cada clip de aneurisma utilizando fórceps. Tenga cuidado de no causar traumatismos en el recipiente, y maintain la integridad del tejido durante la extracción.
- Completamente regar los cuernos uterinos y el campo, teniendo cuidado de eliminar cualquier hilo callejeros de gasa de las bolsas amnióticas.
5. La inyección de lipopolisacárido para amniótico Sacs
- En la base de cada saco amniótico individual, justo anterior a la placa de la placenta, inyecte 100 l de LPS (4 mg / saco) con colorante azul diluido de Evan en el líquido amniótico. El uso de fórceps romos para estabilizar y girar cada saco amniótico para una posición óptima para la inyección. Colorante azul de Diluir Evan es un agente de contraste que es útil para confirmar la colocación correcta de la jeringa e inyección.
NOTA: Utilice sólo un ultra-fino jeringa 0,3 ml de insulina con el adjunto 8 mm 31 G de agujas para las inyecciones intra-amniótica. El uso de grandes agujas de calibre dará lugar a la pérdida de líquido amniótico crónica, muerte fetal y reabsorción del embarazo. Pequeñas cantidades de fuga de líquido amniótico tras la retirada de la jeringa pueden ser mitiglización creada por presión directa en el saco amniótico. Algunos fetos de rata pueden tolerar un grado de oligohidramnios. Sin embargo, la pérdida de líquido amniótico aguda de la punción con grandes agujas de calibre, o punción accidental que resulta en pérdida de líquido crónica, los resultados en la pérdida fetal y en los casos graves, pérdida de embarazos vecinos. - Riegue el útero cuernos 3x con solución salina estéril.
6. Cierre de la laparotomía
- Con unas pinzas, devuelva cuidadosamente los cuernos uterinos de la cavidad peritoneal. Garantizar un espacio adecuado entre los sacos amnióticos y la incisión en la línea media, volver a aproximar los bordes de la capa musculofascial utilizando una sutura de seda 3-0 en funcionamiento. Sea consciente de la colocación de los sacos amnióticos mientras se cierra la incisión muscular. Tenga cuidado de no suturar hacia oa través de un saco.
- Re-aproximar la capa de piel, utilizando una sutura de seda 3-0 en funcionamiento, el cierre de la capa de la piel.
NOTA: La laparotomía debe ser cerrado en dos capas de suturas continuas que permitanpara la piel y la expansión muscular con el aumento de la gestación. Suturas continuas permiten la tensión de la herida uniformemente distribuida. Suturas interrumpidas son menos deseables como múltiples nudos son irritantes y pueden ser fácilmente masticadas por la rata tras recuperarse de la anestesia. Grapas quirúrgicas no son deseados. Las colas de los nudos quirúrgicos se deben cortar muy corto (<3 mm). - Se inyecta 1 ml de 0,125% por vía subcutánea bupivacaína bordes alrededor de la herida utilizando una aguja de 26 G. Administrar una dosis de 0,1 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea en la nuca del cuello.
- Apague el isoflurano y toalla rata seca como sea necesario. Colocar en jaula limpia y seguimiento de la recuperación de la anestesia. Asegurar la rata no se convierta en hipotermia.
7. Recuperación postoperatoria y Cuidado
- Supervisar la rata cada 8 a 12 horas durante 72 horas y luego todos los días hasta las crías nacen (aproximadamente E22 o E23). Administrar dosis adicionales de q8-12 buprenorfina hr / 72 hr o prn según lo dictado por el IACUC.
- Monitorear las ratas para detectar signos de dolor, malestar, sangrado vaginal o sangrado de la zona quirúrgica. Inspeccione las suturas y la incisión y tener cuidado de asegurarse rata no está masticando o retirar sus suturas prematuramente. Aunque excepcionalmente raro, las ratas que comprometen sus suturas están en riesgo de dehiscencia de la herida.
NOTA: De vez en cuando las ratas pueden ingerir cantidades excesivas de ropa de cama o artículos no alimentarios, llamado pica, como un efecto secundario de la administración de buprenorfina. Aunque es muy poco común, las ratas deben ser monitorizados para la pica y el potencial de obstrucción intestinal posterior.
8. Procesamiento de tejidos y cryosectioning
- Para prepararse para hematoxilina y eosina (H & E) tinción del cerebro postnatal, retirar las crías de su jaula en postnatal día 2 (P2). Con unas tijeras quirúrgicas decapitan crías de ratas y suavemente retire el cerebro del cráneo.
- Caída de corrección cerebro en un tubo cónico de 15 ml que contiene 7 ml de 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino(PBS). Coloque cerebro a 4 ° C y fijar durante 72 horas.
- Después de 72 horas, transferir cerebros para una solución estéril que contiene 30% PBS sacarosa (w / v) y volver a 4 ° C.
NOTA: Una vez que el cerebro caen en la solución de sacarosa que están listos para ser seccionado en un criostato. - Rápidamente congelar cerebros y montar en una maja criostato para la adquisición de secciones coronales congeladas. Cortar 20 micras secciones coronales congeladas y montar en las diapositivas. Asegurar secciones se recogen en serie.
- Permitir que las diapositivas se sequen a temperatura ambiente durante la noche. Tienda desliza a -20 ° C.
9. hematoxilina y eosina tinción
- Tome diapositivas montadas secciones congeladas y caliente a temperatura ambiente.
NOTA: Preparar todas las soluciones fresco. - Colocar los portaobjetos en una diapositiva conjunto más caliente a 50 ° C durante 2 horas.
- Transferencia desliza a un estante de tinción. Dip desliza 10x en agua desionizada doblemente destilada (ddH2O).
- Incubar los portaobjetos en 100% hematoxilina durante 5 min. Timí en hematoxilina se puede optimizar dependiendo del grado de coloración púrpura.
- Diapositivas Dip 4x en grifo H2O, y dejar reposar en la limpia del grifo H2O durante 1 min.
- Dip desliza 15x en alcohol ácido (250 ml 70% de etanol + 1 ml de ácido clorhídrico concentrado).
- Diapositivas Dip 4x en grifo H2O, y dejar reposar en la limpia del grifo H2O durante 1 min.
- Incubar en 1% de carbonato de litio durante 2 min.
- Diapositivas Dip 4x en grifo H2O, y dejar reposar en la limpia del grifo H2O durante 1 min.
- Incubar en etanol 95% durante 1 min.
- Diapositivas Dip 7x en el 100% Eosina. Número de caídas en Eosina puede ser modificado en función del grado de coloración rosada.
- Diapositivas Dip 5x en etanol al 95%.
- 5x diapositivas inmersión en un nuevo cambio de etanol al 95%.
- Incubar los portaobjetos en etanol al 100% durante 1 min.
- Incubar los portaobjetos en un nuevo cambio de etanol 100% durante 1 min.
- Incubar los portaobjetos en 100% xileno durante 15 min.
NOTA: Los pasos de xileno ycubrición debe ocurrir en una campana de humos. - Incubar los portaobjetos en cambios frescas de xileno durante 15 min.
- Cubreobjetos con Permount y dejar secar en campana de humos.
- Imagen desliza con un microscopio óptico.
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Representative Results
Siguiendo Tshi + LPS a E18, hematoxilina y eosina revela anomalías significativas histopatológicos en tanto la placenta (Figura 1) y en el cerebro (Figura 2). Placentas examinadas en E19 y E21 son groseramente edematosa con micro-hemorragia y necrosis en toda la decidua y laberinto. También se observa infiltrado inflamatorio importante y aumento de la vascularización. Los cerebros examinados en P2 revelan ventrículomegalia, así como la materia blanca y la pérdida de neuronas sobre placa en comparación con fundas. Anteriormente, hemos informado de que Tshi + LPS induce la inflamación y produce la sustancia blanca persistente y anomalías axonal concomitante con deterioro motor importante en los adultos jóvenes 20. Tshi + LPS también disminuye significativamente cloruro de potasio co-transportador 2 (KCC2) expresión de la proteína, un cloruro de co-transportador central para el desarrollo de ácido γ-aminobutírico (GABA) érgicas inhibición, en la corteza en P15 (Figura 3 13.
Figura 1:. Tshi + LPS induce anormalidades histológicas significativas en la placenta Siguiendo transitoria en el útero hipoxia-isquemia y la administración de LPS intra-amniótico en el día embrionario 18 (E18), placentas de fetos E19 Tshi + LPS (B) son groseramente edematoso con hemorragia (flechas), necrosis y una mayor infiltrado inflamatorio en comparación con el tratamiento simulado (A, barra de escala = 100 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Tshi + LPS induce anormalidades histológicas significativas en el cerebro Siguiendo transitoria en el útero hipoxia-isquemia y la administración de LPS intra-amniótica en el día embrionario 18 (E18), ventrículomegalia posnatal, neurona sobre placa y pérdida de sustancia blanca se observa en las crías sometidas a dual Tshi + LPS (B) en comparación con el tratamiento simulado (A) de forma aguda en P2. (Barra de escala = 100 micras; Sp = placa de conexión; WM = sustancia blanca; LV = ventrículo lateral) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tshi + LPS reduce la expresión KCC2 transferencias Western realizadas desde mem.preparaciones branas de tejido cortical micro-disecados, espectáculo en el útero transitoria hipoxia-isquemia sistémica y la administración de LPS intra-amniótica en el día embrionario 18 (E18) reduce significativamente la expresión de KCC2, un cloruro de potasio co-transportador neuronal específica fundamental para el desarrollo de circuitos cerebrales integradas y la inhibición, en el día postnatal 15 (n = 6-10, media ± SEM, la prueba t de Student, * P <0,05).
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Discussion
Encefalopatía del prematuro es difícil de modelar en los animales debido a la compleja interacción de causas, evolución en el tiempo del desarrollo neurológico, complejidad de la formación de la red cerebral humana, mecanismos de lesión se superponen, y los diversos fenotipos de SNC insulta manifiesta en los recién nacidos prematuros humanos. EOP se asocia con vulnerabilidades específicas de tipo celular (es decir, los oligodendrocitos inmaduros) 21, así como diversos caminos regulados por el desarrollo (es decir, de placas secundarias, transportadores de membrana y subunidades del receptor) 12,13,22. Sin embargo, el progreso significativo se puede hacer cuando los modelos animales replican la condición humana en la mayor medida posible. Aquí, hemos desarrollado un modelo de un insulto prenatal que incorpora la heterogeneidad de los mecanismos de la lesión del SNC observados en el recién nacido prematuro, lo que permite la posterior evaluación de los daños materia gris y blanca y la recuperación. En los seres humanos, que ascienden infecciones bacterianas debilitan el amnios y precipitaruptura prematura de las membranas te. Además, los defectos de perfusión placentaria hincapié en la interfaz de la placenta y alteran la homeostasis de la placenta. Por lo tanto, la hipoperfusión placentaria compuestos lesión del SNC de una infección intrauterina. Sin lugar a dudas, es un reto para modelar el escenario clínico común de ascender infecciones bacterianas que precederán corioamnionitis en los roedores, ya que tienen un útero dúplex. Cada cuerno uterino tiene su propio cuello uterino y los embarazos múltiples se realizan a la vez. A pesar de estos desafíos, los modelos preclínicos se han adaptado a la participación de múltiples componentes de la unidad materno-placentaria-fetal e incorporar en la inflamación del útero en varios grados. Si bien no existe un modelo preclínico individual es ideal para probar todas las hipótesis específica, el modelo descrito en el presente documento incorpora las alteraciones celulares y moleculares, deterioro conductual y funcional, sistema materno-fetal de la placenta, y la infección intrauterina y componentes inflamación de la placenta común a lo many nacimientos prematuros 20,23.
La elección de las especies utiliza para modelar impactos EOP la interpretación de datos experimentales en el contexto de las limitaciones inherentes planteados por la especie. En los términos más simples, el nacimiento no equivale a puntos similares de desarrollo del SNC a través de todos los animales 24. El modelo descrito aquí se puede realizar tanto en ratones y ratas preñadas, a pesar de supervivencia de las crías en ratones se redujo significativamente en presas inexpertos o estresados. De acuerdo con nuestros informes anteriores, la pérdida fetal en ratas al nacer (P0) se incrementa en animales Tshi + LPS (aproximadamente 40%) en comparación con el simulacro, LPS y Tshi solos, pero las crías supervivientes no presentan diferencias de peso significativas a través P28 20. Al igual que las diferencias entre las especies, el momento de la lesión durante la gestación tiene un papel crucial en la trayectoria del desarrollo neurológico de las crías. La regulación espacio-temporal de las etapas de desarrollo de células neuronales de la proliferación, la migración y la diferentiation difiere entre los diversos mamíferos 24-26. Estos programas de desarrollo de células específicas que influyen en la vulnerabilidad a la lesión. Por ejemplo, la superposición de los tiempos de linaje de oligodendrocitos y GABAérgica desarrollo neuronal con el momento del parto prematuro hace que estas células sean particularmente susceptibles a los insultos perinatales 27-29. Por lo tanto, este modelo fue desarrollado en ratas E18 (y con éxito traducido a E17 ratones en un fondo C57BL / 6), ya que la sincronización se corresponde con el insulto prenatal mundial intrauterino que se produce en los bebés humanos a luz antes de la extremadamente prematuros a 23-25 semanas de gestación 20 . Anteriormente mostró-O4 inmunorreactiva oligodendrocitos inmaduros son los más afectados en esta etapa de desarrollo 16. Su pérdida se correlaciona con la disminución de la supervivencia y la maduración 14, con las reducciones más notables en O4 + y etapas O1 + del linaje 16, en consonancia con los informes previos de otros investigadores 30. Además, Hemos demostrado la pérdida prematura de la placa de conexión, la reducción de expresión KCC2, menor umbral de convulsiones y alteración de la marcha 12,13,15 consistente con desregulada GABAérgica señalización en recién nacidos prematuros 31.
El modelo aquí descrito ofrece numerosas ventajas con respecto a los modelos anteriores en roedores utilizados para estudiar la lesión cerebral perinatal de parto prematuro 23. Incorpora todo el sistema materno-fetal de la placenta-y causa tanto cerebro y lesión placentaria. Hemos publicado anteriormente comparaciones entre farsa, Tshi solo, LPS solo y Tshi + LPS y las diferencias en los resultados funcionales y bioquímica 20, y las diferencias con graduada Tshi 16. Aunque investigaciones previas de la ligadura de la carótida unilaterales y la hipoxia sistémica en ratas recién nacidas han arrojado una visión mecanicista en numerosos procesos fisiopatológicos (es decir, la susceptibilidad de los oligodendrocitos inmaduros a la isquemia), la traducción directa y releva clínicaNCE para tales modelos es menos robusto. Además de los casos de aplicación, el modelo descrito aquí puede ser una herramienta informativa para la investigación de otros sistemas de órganos afectados por la prematuridad, incluida la enterocolitis necrotizante (NEC), corazón, pulmón, renal y disfunción del eje hipotálamo-hipófisis. Debido a las complejidades de LPS farmacología y las diferencias en la farmacodinamia maternas y fetales, las inyecciones de LPS intraperitoneal en presas tienen menos probabilidades de producir la misma respuesta inflamatoria fetal se muestra aquí. Además, LPS no atraviesa la placenta fiable 20,32. Anteriormente, se intentó la aplicación cervical directa de LPS y la inyección intrauterina similar a lo que se ha descrito en otros modelos de ratón 33. Sin embargo, se encontró que la mortalidad y la inconsistencia de la lesión del SNC se incrementó significativamente entre los cachorros de la misma camada. Aquí, la dosis de 4 mg / sac se optimizó usando experimentos de dosis-respuesta. El aumento de las dosis de LPS administrados al AMNresultados compartimiento iotic en aumento de la mortalidad fetal. LPS tiene la ventaja sobre la infección directa con bacterias típicas gramnegativos intrauterinos en que se activa la señalización inflamatoria a través de Toll-like receptor 4 sin causar infección bacteriana activa y el riesgo asociado de la propagación de patógenos. Sin embargo, este modelo podría ser modificado para incluir los agentes patógenos y organismos comunes aislados a partir de placentas humanas, incluyendo Streptococcus grupo B, lo que provoca anormalidades en la placenta y neuropatológicos, y el comportamiento autista en ratas 34. Del mismo modo, el antígeno de múltiples bandas lipoproteína Ureaplasma puede simular la infección por especies de Ureaplasma. Desde Ureaplasma es la causa más común de la corioamnionitis humana 35, esto también podría ser una vía para futuras investigaciones. Como agentes más inactivadas infecciosa que se disponga, será informativo para determinar cómo afectan diferencialmente el neurodesarrollo y la eficacia de las intervenciones neuro-reparadora.
Las limitaciones de este modelo incluyen la pérdida de líquido amniótico de las inyecciones intra-amniótica. Aunque ningún efecto se observó con inyecciones intra-amniótica de solución salina estéril, el calibre de la aguja utilizada para realizar las inyecciones es un elemento técnico fundamental. Se debe tener cuidado de no utilizar agujas más grande que 31 G. Las complicaciones quirúrgicas en la rata madre relacionado con la laparotomía son extremadamente raros, incluyendo dehiscencia de la herida, obstrucción intestinal, peritonitis y la pérdida completa del embarazo, con la mortalidad materna a menos de 5%.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Dan Firl, Chris Corbett y Jesse Denson, PhD. La financiación fue proporcionada por el NIH NINDS R01 NS060765 a SR, el P30 Programa Piloto de Cobre a LJ y el Programa de Salud Infantil Firma de LJ en la Universidad de Nuevo México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Solution, 0.9% | Sigma | S8776 | |
| LPS 011B4 | Sigma | L2630 | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Surgical gloves | Biogel | 40870 | |
| OR Towels | Cardinal Health | 287000-008 | Sterile |
| PDI Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Mini Arco Rechargeable Clippers | Kent Scientific Corp. | CL8787 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Eye Lubricant | Refresh Lacri Lube | 00023-0312 | |
| Blunt Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Scissors | Roboz | RS-6808 | |
| Surgical Scissors | Roboz | RS-5880 | |
| Surgical Scissors | F.S.T. | 14002-16 | |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml |
| Needle | BD | 305122 | 25G 5/8 |
| Needle | BD | 305128 | 30G 1 |
| Cotton-tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-114 | Small, 6 inch sterile |
| Cotton Gauze Sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Needle Holders | Kent Scientific Corp. | INS600109 | 12.5 CM STR |
| Vessel Clips | Kent Scientific Corp. | INS600120 | 30G Pressure |
| 3-0 Perma Hand Silk Sutures | Ethicon | 1684G | Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable, PS-1 24 mm needle, 3/8 circle |
| Insulin Syringes | BD | 328438 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Pentobarbital | |||
| Buprenorphine | |||
| Bupivacaine | |||
| Isoflurane | |||
| Lithium Carbonate | Acros Chemicals | 554-13-2 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Hematoxylin | Leica | 3801521 | Surgipath Gill II Hematoxylin |
| Eosin | Leica | 3801601 | Surgipath Eosin |
| Xylenes | Fisherbrand | X3S-4 | Histological Grade |
| Permount | Fisherbrand | SP15-100 | |
| Coverglass | Fisherbrand | 12-548-5P | Fisher Finest Premium Coverglass |
References
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