Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية هي مواقع معظم نقاط الاشتباك العصبي مثير في الثدييات قشرة الدماغ. يصف هذا الأسلوب التحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري في القشرية الخلايا العصبية الهرمية glutamatergic الإنسان المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة.

Abstract

العمود الفقري شجيري هي نتوءات صغيرة التي تتوافق مع مقصورات بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي مثير في الجهاز العصبي المركزي. وهي موزعة على طول التشعبات. مورفولوجيا يعتمد إلى حد كبير على نشاط الخلايا العصبية، وهي ديناميكية. العمود الفقري شجيري تعبر عن مستقبلات glutamatergic (أمبا ومستقبلات NMDA) على سطحها وعلى مستوى كثافة بعد المشبكي. كل العمود الفقري يسمح الخلايا العصبية للسيطرة على نشاط الدولة والمحلي بشكل مستقل. وقد الأشكال التضاريسية العمود الفقري درس على نطاق واسع في الخلايا الهرمية glutamatergic من القشرة الخارجية للدماغ، وذلك باستخدام كلا النهجين في الجسم الحي والثقافات العصبية التي تم الحصول عليها من الأنسجة القوارض. ظروف عصبية مرضية يمكن أن تكون مرتبطة إلى تغير تحريض العمود الفقري والنضج، كما هو مبين في القوارض الخلايا العصبية مثقف والتحليل الكمي ذات بعد واحد 1. توضح هذه الدراسة بروتوكول للتحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري باستخدام cortic الإنسانالخلايا العصبية آل المستمدة من الخلايا الجذعية العصبية (الأسلاف القشرية في وقت متأخر). تم الحصول على هذه الخلايا في البداية من الخلايا الجذعية المحفزة. هذا البروتوكول يسمح للتحليل الأشكال التضاريسية العمود الفقري في فترات ثقافة مختلفة، ومع المقارنة الممكنة بين الخلايا الجذعية المحفزة التي تم الحصول عليها من الأفراد التحكم مع تلك التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من الأمراض النفسية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية القشرية هي نتوءات صغيرة ورقيقة والتي يتم توزيعها على طول التشعبات القاعدية وقمية من هذه الأنواع الفرعية العصبية في القوارض، الرئيسيات، والدماغ البشري. فهي مواقع لمعظم نقاط الاشتباك العصبي مثير وعرض وظائف أساسية في التعلم والعمليات المعرفية. الهياكل التفصيلية في العمود الفقري شجيري الإنسان تم دراستها فنيا من قبل المجهر الإلكتروني (2). ومع ذلك، فإن هذا النهج هو مضيعة للوقت، ويمثل عبء العمل الثقيل. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء مورفولوجية شجيري العمود الفقري في قشرة الدماغ البشري باستخدام برامج معينة مجتمعة لدليل كبير تحليل العمود الفقري 3.

الخضراء البروتين مضان (GFP) التكنولوجيا بالإضافة إلى المناعي تمثل أداة دقيقة لتحديد العمود الفقري وقياس الشكل بواسطة المجهر مضان. هذا النهج يمكن تطبيقها بسهولة على الخلايا العصبية مثقف. هاوالاصدار، تم الإبلاغ عن أي بيانات عن تحليل النضج العمود الفقري والتشكل على الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة (التوجيهية).

وكان الهدف من هذه الدراسة لوصف البروتوكول الذي يسمح التصوير العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية البشرية المستزرعة في المختبر. تم استخدام العلامات GFP، متحد البؤر المجهري والتحليل 3D مع وحدة الشعيرة الراسم من البرامج Imaris في هذا البروتوكول. خطوات الثقافة التي هي ضرورية للحصول على الخلايا العصبية glutamatergic القشرية من طبقات من الثاني إلى الرابع من الخلايا الجذعية العصبية (NSC) هي أيضا لفترة وجيزة الموصوفة هنا. وقد تم بالفعل نشر بروتوكول كامل لإنتاج NSC الإنسان في أي مكان آخر 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. العصبية الثقافة

ملاحظة: إعادة برمجة الخلايا الليفية في الخلايا الجذعية المحفزة، والالتزام النسب الظهرية الدماغ الانتهائي، الاشتقاق، والتضخيم، والخدمات المصرفية من الأسلاف القشرية في وقت متأخر (نظام الإجراءات الجزائية) وصفت في Boissart وآخرون (4). تم إجراء تمايز الخلايا العصبية من الخلايا مثل نظام الإجراءات الجزائية أيضا وفقا لBoissart آخرون 4 مع تعديلات طفيفة. وقد وضعت إجراءات أخرى لإعادة البرمجة المباشرة من الخلايا الليفية إلى خلايا الجذعية المحفزة تليها التمايز بهم إلى الخلايا العصبية. تم الإبقاء على هذا البروتوكول لأنه يسمح للإنتاج انتقائي من الخلايا العصبية glutamatergic الهرمية.

  1. علاج لوحات ثقافة 6 جيدا مع coverslips الزجاج مع بولي الأورنيثين (مخفف إلى 1/6 في DPBS، تركيز الأسهم 0.01٪) O / N، تليها ثلاث غسلات في DPBS. ثم إضافة laminin (تركيز المخزون 1 ملغ / مل، مخففة 500 مرة في DPBS) لا يقل عن 10 ساعة تحت غطاء محرك السيارة تدفق .
  2. لوحة وإيفاد NSC في منخفض الكثافة (50000 خلية / سم 2) في لوحات ثقافة 6 جيدا مع الزجاج coverslips في 3 مل من مستنبت تتألف من DMEM / F12 (500 مل)، 2 قارورة (5 مل لكل منهما) من N2 ملحق، 2 قارورة (10 مل لكل منهما) من B27 الملحق، 10 مل من القلم، الستربتوميسين (البنسلين = 10000 وحدة / مل وإستربتومايسين = 10000 وحدة / مل)، 1 مل من 2 المركابتويثانول (الأسهم الحل: 50 ملم) و laminin (1 / 500)، من دون عوامل النمو. خطوة حاسمة: إجراء هذه الخطوة بعناية بإضافة خلايا مع الحركات الدورية بطيئة من أجل الحد من تجميع الخلية.
  3. إزالة مستنبت. إضافة المتوسطة N2B27 الطازجة التي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل من محلول laminin جديدة للحفاظ على الخلايا العصبية تعلق على الزجاج coverslips وتجنب تراكمها. تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام. الابقاء على بعض من المتوسط ​​المتبقية (200 ميكرولتر) قبل إضافة متوسطة جديدة لمنع الخلية من التجفيف. بدلا من ذلك، والمضي قدما بسرعة وتغيير الحجم الكلي (3 مل).
e_title "> 2. Lentiviral تنبيغ

ملاحظة: تم ناقلات lentiviral GFP تفضلت التي تقدمها مختبر الدكتور أوفه Maskos في معهد باستور (باريس)، وأعد وفقا لبروتوكول نشر 5. والدافع GFP التعبير عن طريق الماوس فسفوغليسرات كيناز (PGK) المروج. لهذه الدراسة، كان عيار الفيروسية من 400 نانوغرام / ميكرولتر (حل الأسهم في برنامج تلفزيوني 1X).

  1. تنبيغ الخلايا العصبية البشرية التوجيهية المشتقة في أي خطوة من النضج بواسطة الجسيمات الفيروسية عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون تحتوي على 40 نانوغرام من GFP ناقلات lentiviral في ثقافة جيدا (6 لوحات جيدا)، واحتضان لمدة 48 ساعة في مستنبت الطازجة. ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، ومدة الحضانة يسمح وضع العلامات جيد للهياكل العمود الفقري.

3. المناعي

ملاحظة: من أجل تحسين وضع العلامات على التشكل العمود الفقري كله، تم إجراء وسم المناعي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP في ظروف permeabilized.

  • إزالة مستنبت وإصلاح الخلايا transduced coverslips على 4٪ لامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة في RT، ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X (10 دقيقة لكل منهما).
  • coverslips Immerge في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.05٪ تريتون (100X) و 10٪ مصل الحصان لمدة 1 ساعة على RT، ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X.
  • إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS تستكمل مع 4٪ مصل الحصان والأجسام المضادة الأولية (1/1000) التي أثيرت ضد GFP والمخففة بعامل 1000 على كل ساترة. احتضان في مربع O الظلام / N عند 4 درجات مئوية، ثم يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
  • تمييع اليكسا فلور الأضداد 488 مترافق (1/200) في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5٪ من توين 20 واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X وجبل coverslips على الشرائح الزجاجية مع تصاعد المتوسطة لمضان المجهر.
  • 4. شجيري العمود الفقري التصوير

    1. أداء التصوير متحد البؤر من خلال متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي.
    2. حدد الخلايا العصبية السليمة مع هرمي التشكل لالثانية وتشجر شجيري كاملة، وتحديد ما لا يقل عن 10 الخلايا العصبية في حالة من تجارب منفصلة. تحديد 60-100 ميكرون في التغصنات.
    3. الحصول على صور باستخدام النفط 40X NA = 1.3 هدف وخط ليزر 488 نانومتر لGFP الإثارة، وبلغت ذروتها قوة نموذجية على مستوى العينة حوالي 20 مللي واط. مجموعة حجم بكسل حوالي 80 نانومتر لأخذ عينات العمود الفقري شجيري بشكل صحيح.
      ملاحظة: إن الدعوة تحليل لاحقة للصورة التي ضجيج لا تفسد تجزئة المناسبة من التشعبات والعمود الفقري. مع الإعدادات أخذ العينات والطاقة المكانية المذكورة أعلاه، لاحظنا أن بكسل يسكن الوقت من 3.15 ميكرو ثانية كافية لجمع ما يكفي من الفوتونات لبناء مثل هذه الصورة. للحصول على عينات قاتمة، ويمكن تحسين جودة الصورة عن طريق حساب متوسط ​​2-4 بالاشعة. قد تكون هناك حاجة إلى اكتساب العديد من البلاط XY لتغطية المنطقة من اهتمام، والتي ثم يجب مخيط معا قبل المعالجة.
    4. لأخذ عينات من حجم الخلايا العصبية كله، الحصول على Z-المكدس، معوZ تباعد تتراوح بين 150 نانومتر إلى 300 نانومتر، مما أسفر عن 20-30 شرائح Z.
      ملاحظة: القرار المكانية الجانبي يتحقق مع هذه الإعدادات هو 234 نانومتر، والقرار المحوري هو 591 نانومتر. أخذ العينات المختارة هنا هي كافية، ولكن كما القرار المحوري أكبر من أصغر حجم العمود الفقري للتصوير، وتحليل تفضل العمود الفقري التي تمتد أفقيا من التشعبات.

    5. 3D الكمي لشجيري العمود الفقري

    ملاحظة: المقاطع التالية تصف على وجه التحديد استخدام البرنامج Imaris للتحليل. تطبيقات بديلة موجودة، بما في ذلك NeuronStudio 15 أو Metamorph والتي يمكن أن توفر نتائج مماثلة.

    استخدام الإعدادات الأساسية التالية:

    1. ونتيجة لمرحلة ما قبل المعالجة، استخدم تصفية جاوس من خلال مرافق معالجة الصور المقدمة من قبل البرنامج. إجراء التصفية جاوس عن طريق معالجة الصور> Smooشيء> مرشح التمويه. تعيين عرض مرشح ليكون مساويا لحجم بكسل في XY.
    2. إجراء تتبع شبه التلقائي من التشعبات، وذلك باستخدام وحدة الشعيرة الراسم من البرنامج.
      1. أولا، تقدير القطر التغصنات، باستخدام أداة المسافة في علامة التبويب شريحة من البرنامج.
      2. في علامة التبويب فق، انقر على أداة الشعيرات. لمتانة أفضل، ويعتمد هذا البروتوكول على تتبع شبه الآلي. انقر على إنشاء التلقائي تخطي. واجهة وحدة يظهر الآن على علامة التبويب رسم. هنا، حدد أرجية مستقلية المنشأ كوسيلة من وسائل، التغصنات كنوع، وإدخال قطر التغصنات المقدرة.
      3. استخدام اختر وضع المؤشر، وتحول المؤشر إلى مربع. مفتاح Shift بزر الماوس الأيمن فوق نقطة انطلاق التغصنات. ملاحظة: البرنامج ينفذ الحسابات الأولية.
      4. حرك المؤشر على طول التغصنات. من نقطة البداية (تمثيلإد كمجال الأزرق)، ويظهر خط أصفر يمثل مسار التغصنات على الأرجح. التحول من اليسار انقر على نقطة النهاية التغصنات.
    3. أداء العمود الفقري تجزئة الآلي. ملاحظة: أشواك على التغصنات تتبع هي التي يمكن العثور عليها تلقائيا من قبل واجهة وحدة.
      1. في واجهة وحدة، انقر فوق علامة التبويب الخلق. في إعادة المنسدلة القائمة، واختيار إعادة التغصنات قطر والتحقق من المربع بيانات الاحتفاظ بها. ثم انقر فوق إعادة الإنشاء.
      2. تعيين العتبة بحيث يتوافق مع حجم مجزأة إلى حجم التغصنات الفعلي. كما خوارزمية، حدد أقصر مسافة من نصف القطر خريطة انقر على زر التالي.
      3. تحديد أصغر قطر الرأس العمود الفقري وطول القصوى، مرة أخرى باستخدام أداة المسافة في علامة التبويب شريحة من البرنامج، ثم يعود إلى علامة التبويب تفوق وأدخل المعلمات. Fأو هذا البروتوكول، والقيم حول 200-300 نانومتر عن الحد الأدنى من قطر و 4 ميكرون لطول القصوى هي نقطة انطلاق جيدة. لا تحقق السماح فرع العمود الفقري مربع. انقر على زر التالي.
      4. ضبط عتبة النقاط البذور بحيث يشير اللون الأزرق يمثل العمود الفقري لتوطين رؤوس العمود الفقري الفعلي. انقر على زر التالي. ملاحظة: يتم احتساب الأساسية الآن، ويمكن أن تكون طويلة.
    4. تصنيف العمود الفقري عن طريق الذهاب إلى علامة التبويب أدوات واجهة وحدة. انقر على صنف العمود الفقري. في واجهة المستخدم المطالبة، تأكد أن هناك أربع فئات، يحددها التشكل على النحو التالي: قصير و: طول <1 ميكرون. الفطر: الطول (العمود الفقري)> 3 وعرض ماكس (الرأس)> يعني العرض (الرقبة) × (2)؛ طويل ورفيع: متوسط ​​العرض (الرأس) ≥ متوسط ​​العرض (الرقبة). أرجل كاذبة خيطية، مثل: طول ≤ 4 ميكرون (بلا رأس).
      ملاحظة: موواجهة مصح يولد أربعة أشياء خيوط جديدة تحتوي على نتائج التصنيف.
    5. البيانات الإحصائية تصدير: على أي من هذه الواجهات وجوه أربعة، انتقل إلى علامة التبويب الاحصائيات.
      انقر على تصدير جميع الاحصائيات إلى زر ملف.
      ملاحظة: يمكن تصديرها القيم إحصائية أخرى عن التشعبات (. على سبيل المثال، الطول والمساحة، يعني قطر، وعمق فرع، المتفرعة زاوية، وحجم، الخ)، والعمود الفقري (على سبيل المثال، الاستقامة، منطقة المرفق، وطول وحجم متميزة أجزاء العمود الفقري، وقطر العمود الفقري، الكثافة، الخ.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    توضح هذه الدراسة بروتوكول موحد لالعمود الفقري الكمي من التشعبات مثقف الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من IPSC. هذا البروتوكول يسمح للتحليل العمود الفقري النضج على الخلايا العصبية البشرية والمقارنة ممكنة مع نضوج العمود الفقري في مستوى الثقافات القوارض العصبية وكذلك في الجسم الحي في النماذج الحيوانية.

    يمثل الشكل 1A مخطط للخطوات مختلفة من الثقافة التي تسمح للإنتاج الخلايا العصبية الهرمية القشرية. يتم توفير هذا التمثيل التخطيطي من أجل فهم أفضل لتحجيم الوقت عالمي لإنتاج الخلايا العصبية الهرمية هبوا فئات مختلفة من العمود الفقري. خطوات Reprogrammation، ومع ذلك، هي خارج نطاق هذه الدراسة، وقد وصفت في مكان آخر 4. يمكن أن تبقى الخلايا العصبية السليمة في ثقافة ما يصل الى 65 - 70 أيام الشكل 1B تبين سير العمل من التصوير والكمي 3D في العمود الفقري.

    ove_content "> الشكل 2A يوضح ثقافة الخلايا العصبية البشرية المسمى مع تويولين الأضداد المضادة للبيتا III. ويبين هذا الرقم أيضا ميل تجميع الخلية. ويبين الشكل 2B على الهرمية الخلايا العصبية التي تحمل علامات GFP من طبقات قشرية سطحية في 40 أيام آخر التمايز الأسلاف القشرية في وقت متأخر (نظام الإجراءات الجزائية).

    الشكل 2C والشكل 3A توضيح 3D إعادة إعمار شرائح العمود الفقري شجيري في مراحل مختلفة من النضج. ويمثل التحليل الكمي للمعلمتين المحدد (كثافة العمود الفقري والعمود الفقري حجم الرأس) في الشكل 3B. تشير نتائجنا إلى أن هذه المعلمتين زيادة خلال الفترة الثقافة كما هو متوقع.

    الشكل 1
    الشكل 1. (A) لمحة عامة عن الجدول الزمني لمهرجان دبي السينمائي الدولي العصبية erentiation. يصف هذا التمثيل التخطيطي الخطوات الثلاث من تمايز الخلايا العصبية. ويتم تكييف البروتوكول من Boissart وآخرون. 4. في الخطوة 1، تستمد التوجيهية البشري في الأسلاف القشرية في وقت مبكر (أي الخلايا العصبية الظهارية في وقت مبكر من الدماغ الانتهائي الظهرية)، يليه التحول إلى الأسلاف القشرية في وقت متأخر (نظام الإجراءات الجزائية). نظام الإجراءات الجزائية ثم يتم تضخيمها للأعمال المصرفية خلية في النيتروجين السائل. في الخطوة 2، ويتحقق التمايز العصبي في غضون أسبوعين. الخطوة 3 يتوافق مع الحفاظ على الخلايا العصبية في الثقافة لفترات أطول، من أجل متابعة العمود الفقري النمو والنضج التدريجي. وفقا للشروط والثقافة، ويمكن أن تبقى الخلايا العصبية السليمة تصل إلى 65 - 70 يوما (B) سير العمل من الخطوات المختلفة للتصوير والكمي 3D في العمود الفقري. (IF: المناعي). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    ove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 2
    خلايا إيجابية الشكل 2. (A) بيتا III تويولين التي كشفت عنها المناعي باستخدام نفس البروتوكول كما هو موضح، وبولكلونل مكافحة بيتا III تويولين الضد استخدامها في التخفيف من 1/1000. (B) تشعب شجيري الابتدائي والثانوي لGFP -labeled الهرمية الخلايا العصبية مثقف 40 آخر أيام مرحلة نظام الإجراءات الجزائية. في أقحم، يتم تمثيل نفس الخلايا العصبية في التكبير أقل مع جسم الخلية واضح. التعمير (C) 3D من فئتين من الأشواك على قطعة من التغصنات الثانوية. أشرطة النطاق: 250 ميكرون (A)، و 100 ميكرون (B)، 40 ميكرون (B أقحم)، 1.5 ميكرون (C) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
    الرقم 3. إعادة الإعمار (A) 3D من العمود الفقري شجيري (اللون الأزرق) مع شرائح مصورة من التشعبات الثانوية (اللون الرمادي)، في مرحلتين مختلفتين الثقافة (25 و 45 يوما بعد التمايز من نظام الإجراءات الجزائية). (ب) التحليل الكمي للعمود الفقري الكثافة والأشكال التضاريسية مع معلمتين مختارة مثل كثافة العمود الفقري على طول التغصنات ورئيس العمود الفقري الحجم وعلى فترات ثقافة اثنين. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SEM لا يقل عن 10 شرائح الخلايا العصبية متميزة تم الحصول عليها من التشعبات الثانوية تصويرها بواسطة المجهر متحد البؤر. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار مان ويتني (* P <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    اعتمد الكمي من الميزات المورفولوجية من الخلايا العصبية الهرمية على البرنامج. تم استخدام واجهة الشعيرة الراسم لتقسيم الخلايا العصبية والعمود الفقري، وكان يستخدم وحدة XT لتحليلها.

    لتحليل دقة تقنية لدينا، ونحن أول مقارنة قياس المعلمات الشكلية (الطول والمساحة والحجم الكلي العمود الفقري عند الاقتضاء)، مع تلك التي نشرت باستخدام الفئران الخلايا العصبية الهرمية ناضجة في الثقافة 6 و 7 و أنسجة الدماغ البشري 3. وكانت كثافة مماثلة في جميع الحالات. وقد وصفت أية بيانات حجم الخلايا العصبية في الفئران (وذكر تحليل 2D مع البرامج المستخدمة من قبل المؤلفين) في حين أن إجمالي حجم العمود الفقري وانخفاض طفيف بالمقارنة مع البيانات المتوفرة لدينا، في دراسة بينافيدس-Piccione 3 باستخدام بروتوكول الخاصة بهم لإعادة الإعمار حجم على العمود الفقري المحدد. ويمكن أيضا أن يفسر هذه الاختلافات من خلال المنطقة التي ينحدر الخلايا وتستخدم صبغة الفلورسنت الخاصة بهموضع العلامات.

    ينبغي التأكيد على بعض النقاط الهامة في بروتوكول لدينا، والتي تشير أساسا إلى تعريفات عتبة نوعية مبائر الصور وquantifications اللاحقة. اقتران تنبيغ من ناقلات GFP lentiviral مع المناعي لمكافحة GFP يضمن وضع العلامات الجيدة والتصور من الهياكل العمود الفقري بأكمله. لم نكن قادرين على تسمية تشجر شجيري الكاملة بنقل العدوى إلى خلايا برمجتها مع ناقلات GFP والبروتوكولات التقليدية. عادة، 70 - يتم transduced 80٪ تحت ظروف تجريبية لدينا. هذه النسبة أكبر بكثير مما لاحظنا باستخدام بروتوكولات ترنسفكأيشن مع البلازميدات GFP (15٪ من الخلايا العصبية transfected في تجاربنا).

    اعتمادا على كفاءة وخصوصية وضع العلامات، وتصفية جاوس أو deconvolution قد تكون مفيدة بوصفها مرحلة ما قبل المعالجة ليقلل من الضوضاء. اختبرنا أيضا إعادة بناء صورة 3D وتقدير بعد deconvolution. هذه اإلجراءاتوكان من المتوقع أن تكون مفيدة، لأنه حتى مع التصوير متحد البؤر، deconvolution يحسن بشكل كبير من جودة الصورة وحدود الضبابية التي تسببها الحيود ق ق. Deconvolution ومع ذلك، يضع ضغطا كبيرا على خطوة التصوير، وفرض أخذ العينات المكانية قاسية في كل الاتجاهات الثلاثة. مع الإعداد البصرية المستخدمة في هذا البروتوكول، وحجم البكسل المطلوب لdeconvolution حوالي 40 نانومتر، في حين وضعناها لحوالي 80 نانومتر للصور المعروضة هنا. سوف تتحرك إلى 40 نانومتر أربعة أضعاف لاكتساب الوقت، وخفض بكسل العائد الفوتون. بالإضافة إلى ذلك، في ظل الظروف التجريبية، لم يلاحظ أي تحسن كبير في نتائج تجزئة بالمقارنة مع النتائج التي قد تم الحصول عليها مع تصفية جاوس. ولذلك يعتمد البروتوكول على هذه الخطوة أبسط مرحلة ما بعد المعالجة وتخفيف القيود Z أخذ العينات أثناء التصوير. وهذا بدوره يقلل من اكتساب الوقت وتبيض عينة.

    وحدة الشعيرة الراسم تقدم AUTOM تماماتجزئة آتيك. ولكن في هذا النوع من الثقافة، والخلايا العصبية وغالبا ما تكون كثيفة، عبر أكثر من بعضها البعض، ويتم تصوير من خلفية قوية. وهذا يؤثر سلبا على دقة تجزئة التلقائي. أدت تجزئة شبه التلقائي إلى نتائج أكثر قوة وكفاءة معالجة. هذا يتكون من تتبع الموجهة من التشعبات من الجسم القاعدية من الخلايا العصبية، تليها تجزئة 3D التلقائي في العمود الفقري على طول التشعبات المحدد.

    لدينا وسيلة يمكن أن تستخدم لأداء الوقت الفاصل بين التصوير وتسجيل مباشرة العمود الفقري النضج في الخلايا العصبية من الفئران الأساسي العصبونات القشرية المعيشة، كما هو موضح سابقا 8.

    وقد وجهت الخلايا العصبية البشرية التوجيهية المستمدة من اهتمام العلماء وكانت هناك محاولات الأخيرة لنموذج الاضطرابات العصبية النمائية بما في ذلك اضطرابات طيف التوحد 14/09. في الدوائر القشرية، العمود الفقري شجيري تلعب دورا رئيسيا في إنشاء نقاط الاشتباك العصبي مثير، ولكن منوقد تم توثيق التحليل الكمي ضعيفا في البشر الذين يعانون من اضطرابات النمو العصبي. خلال تطوير وطوال عمر، والكثافة في العمود الفقري والأشكال التضاريسية هم حرجة للاتصال الدوائر العصبية. في الأمراض الوراثية مع الأسباب، واستخدام الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من الخزعات المريض (على سبيل المثال، الخلايا الليفية) يسمح للتحليل التنمية الدوائر بين الخلايا العصبية معربا عن الجين المتحور (ق) التي يمكن أن تكون مسؤولة عن الحالات المرضية. ويمثل هذا البروتوكول نهجا قويا للواسعة في تحليل المختبر من spinogenesis ضمن مجموعة من السكان من الخلايا العصبية تحور والمقارنة بين الظواهر مع الخلايا العصبية إعادة برمجة من أفراد السيطرة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter