Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Dendritiske spines af pyramideformede neuroner er de steder, hvor de fleste excitatoriske synapser i pattedyrs hjerne cortex. Denne metode beskriver en 3D-kvantitativ analyse af rygsøjlen morfologier i humane kortikale pyramideformet glutamaterge neuroner afledt af inducerede pluripotente stamceller.

Abstract

Dendritiske spidser er små fremspring, der svarer til de post-synaptiske rum af excitatoriske synapser i centralnervesystemet. De er fordelt langs dendritter. Deres morfologi afhænger i høj grad neuronal aktivitet, og de er dynamiske. Dendritiske spines udtrykker glutamaterge receptorer (AMPA og NMDA-receptorer) på deres overflade, og på niveauet af postsynaptiske tætheder. Hver rygsøjlen tillader neuron til at styre sin tilstand og lokal aktivitet uafhængigt af hinanden. Spine morfologier er blevet grundigt undersøgt i glutamaterge pyramidale celler i hjernen cortex, ved hjælp af både in vivo fremgangsmåder og neuronale kulturer opnået fra gnaver væv. Neuropatologiske tilstande kan tilknyttes ændret rygsøjlen induktion og modning, som vist i gnavere dyrkede neuroner og endimensional kvantitativ analyse 1. Den foreliggende undersøgelse beskriver en protokol for 3D-kvantitativ analyse af rygsøjlen morfologier hjælp menneskelige corticAL neuroner afledt fra neurale stamceller (sene kortikale progenitorer). Disse celler blev oprindeligt fremstillet fra inducerede pluripotente stamceller. Denne protokol muliggør analysen af ​​rygsøjlen morfologier ved forskellige kultur perioder, og med mulighed for sammenligning mellem inducerede pluripotente stamceller opnået fra kontrolpersoner med dem, der opnås fra patienter med psykiatriske lidelser.

Introduction

Dendritiske spidser af corticale pyramideneuroner er små og tynde fremspring, som er fordelt langs basale og apikale dendritter af disse neuronale undertyper i gnavere, primat, og den menneskelige hjerne. De er de steder, hvor de fleste excitatoriske synapser og vise nøglefunktioner i læring og kognitive processer. De detaljerede strukturer af humane dendritiske spines er teknisk studeret ved elektronmikroskopi 2. Men sådan tilgang er tidskrævende og repræsenterer tung arbejdsbyrde. For nylig er en tredimensional (3D) rekonstruktion af morfologien af dendritiske spidser er rapporteret i human hjernebark via bestemte software kombineret til store manuel rygsøjlen analyse 3.

Grøn fluorescens protein (GFP) teknologi koblet til immunfluorescens repræsenterer et præcist værktøj til identifikation ryg og måling form ved fluorescensmikroskopi. Denne fremgangsmåde kan let anvendes til dyrkede neuroner. However, har ingen data er indberettet på analysen af ​​rygsøjlen modning og morfologi på humane neuroner afledt af inducerede pluripotente stamceller (IPSC).

Formålet med denne undersøgelse var at beskrive en protokol, som gør det muligt dendritisk rygsøjlen billeddannelse fra dyrkede humane neuroner in vitro. GFP mærkning, konfokal mikroskopi og 3D-analyse med Filament Tracer modul Imaris software blev anvendt i den foreliggende protokol. Kultur trin, der er nødvendige for at opnå corticale neuroner glutamaterge af lag II til IV fra neurale stamceller (NSC) er også kort beskrevet her. Hele protokol for menneskelige NSC produktion er allerede blevet offentliggjort andre steder 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neuronal Kultur

Bemærk: Fibroblast omprogrammering i pluripotente stamceller, engagement i dorsale telencephalon afstamning, afledning, forstærkning, og bankvæsen af sene kortikale stamceller (LCP), blev beskrevet i Boissart et al 4. Neuronal differentiering af LCP-lignende celler blev også udført ifølge Boissart et al 4 med mindre ændringer. Der er udviklet andre procedurer til direkte omprogrammering af fibroblaster i inducerede pluripotente stamceller, efterfulgt af deres differentiering i neuroner. Denne protokol blev bevaret, da den tillader den selektive produktion af pyramideformede glutamaterge neuroner.

  1. Behandl 6-brønds dyrkningsplader med dækglas med poly-ornithin (fortyndet til 1/6 i DPBS, stock koncentration 0,01%) O / N, efterfulgt af tre vaske i DPBS. Derefter tilsættes laminin (stamkoncentration 1 mg / ml, fortyndet 500 gange i DPBS) i mindst 10 timer under strømningshætte .
  2. Plade og afsende NSC ved lav densitet (50.000 celler / cm2) i 6-brønds dyrkningsplader med dækglas i 3 ml dyrkningsmedium bestående af DMEM / F12 (500 ml), 2 hætteglas (5 ml hver) af N2 supplement, 2 hætteglas (10 ml hver) af B27 supplement, 10 ml Pen-streptomycin (Penicillin = 10.000 enheder / ml og streptomycin = 10.000 enheder / ml), 1 ml 2-mercaptoethanol (Stamopløsning: 50 mM) og laminin (1 / 500), uden vækstfaktorer. Afgørende skridt: Udfør dette trin omhyggeligt ved at tilføje celler med langsomme roterende bevægelser for at reducere celle klyngedannelse.
  3. Fjern kulturmediet. Tilføj frisk N2B27 medium indeholdende 2 ug / ml frisk laminin løsning til at holde neuron fastgjort på dækglas og undgå sammenklumpning. Skift medium hver 3 dage. Holde nogle af de resterende medium (200 pi), før tilsætning af frisk medium med henblik på at forhindre, at cellen fra tørring. Alternativt foregår hurtigt og ændre det totale volumen (3 ml).
e_title "> 2. Lentiviral transduktion

Bemærk: GFP lentivirale vektorer blev venligst stillet til rådighed af Dr. Uwe Maskos Laboratory ved Institut Pasteur (Paris) og fremstillet ifølge den offentliggjorte protokol 5. GFP-ekspression er drevet af muse phosphoglyceratkinase (PGK) -promotoren. Til denne undersøgelse virustiter var på 400 ng / pl (stamopløsning i PBS 1x).

  1. Transducere humane iPSC-afledte neuroner på ethvert trin af modningen af ​​virale partikler ved tilsætning af 1 ml af stamopløsningen indeholdende 40 ng GFP lentiviral vector pr dyrkningsbrønd (6-brønds plader) og inkuberes i 48 timer i frisk dyrkningsmedium. Bemærk: Til denne protokol, varigheden af ​​inkubationen tillader en god mærkning af rygsøjlen strukturer.

3. Immunofluorescens

Bemærk: For at forbedre mærkning af hele rygsøjlen morfologi, blev immunfluorescens mærkning udføres under anvendelse af et anti-GFP-antistof i permeabiliserede betingelser.

  • Fjern dyrkningsmedium og løse transducerede celler på dækglas i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter vask 3 gange i 1 x PBS (10 minutter hver).
  • Immerge dækglas i PBS suppleret med 0,05% Triton (100x) og 10% hesteserum i 1 time ved stuetemperatur, derefter vask 3 gange i 1 x PBS.
  • Tilsæt 100 pi 1x PBS suppleret med 4% hesteserum og primært antistof (1 / 1.000) rejst mod GFP og fortyndet med en faktor på 1.000 på hver dækglas. Der inkuberes i en mørk boks O / N ved 4 ° C, vask derefter 3 gange med 1 x PBS.
  • Fortynd Alexa Fluor 488-konjugeret antistof (1/200) i PBS suppleret med 0,5% Tween 20 og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Vask derefter 3 gange i 1x PBS og montere dækglas på objektglas med montering medium for fluorescens mikroskopi.
  • 4. Dendritisk Spine Imaging

    1. Udfør konfokal billeddannelse gennem et konfokalt laser-scanning-mikroskop.
    2. Vælg sunde neuroner med pyramideformet morfologi ennd en fuld dendritisk arborization, og kvantificere mindst 10 neuroner pr betingelse fra separate eksperimenter. Kvantificere 60-100 um pr dendritceller.
    3. Anskaf billeder ved hjælp af en 40X olie NA = 1,3 objektiv og en 488 nm laser linje for GFP excitation, med en typisk spidseffekt på prøve niveau omkring 20 uW. Set pixelstørrelse omkring 80 nm til korrekt prøve dendritiske Torner.
      Bemærk: Den efterfølgende analyse opfordring til et billede, hvor støjen ikke hindrer korrekt segmentering af dendritter og pigge. Med de rumlige prøvetagning og strømindstillinger nævnt ovenfor, bemærkede vi, at en pixel opholdstid-tid på 3,15 mikrosekunder er tilstrækkeligt til at indsamle nok fotoner til at bygge sådan et billede. For dim prøver, kan billedkvaliteten forbedres ved gennemsnit 2 til 4 scanninger. Købet af flere XY fliser kan være nødvendig for at dække området af interesse, som derefter skal sys sammen inden behandling.
    4. At prøve hele neuron volumen, erhverve en Z-stack, meden Z med afstand i området fra 150 nm til 300 nm, hvilket gav 20 til 30 Z skiver.
      Bemærk: Den laterale rumlige opløsning opnås med disse indstillinger er 234 nm, og den aksiale opløsning er 591 nm. Prøveudtagning valgt her er tilstrækkelig, men som den aksiale opløsning er større end den mindste størrelse af pigge, der skal afbildes, analysen favoriserer de pigge, der strækker sig sideværts fra dendritter.

    5. 3D Kvantificering af dendritiske spidser

    Bemærk: De følgende afsnit beskriver specifikt anvendelsen af ​​Imaris software til analyse. Alternative implementeringer findes, herunder NeuronStudio 15 eller Metamorph 8, som kan give lignende resultater.

    Brug følgende centrale indstillinger:

    1. Som forbehandling fase, bruge Gauss filtrering gennem billedbehandling, der tilbydes af softwaren. Udfør Gaussisk filtrering via Billedbehandling> Smooting> Gaussisk filter. Indstil filteret bredde til at være lig med pixelstørrelsen i XY.
    2. Udfør en Halvautomatisk sporing af dendritter, ved hjælp af Filament Tracer modul af softwaren.
      1. Først estimere dendritceller diameter, ved hjælp af afstanden værktøj i fanen af softwaren Slice.
      2. På fanen overgå, skal du klikke på Filaments værktøjet. For en bedre robusthed, denne protokol bygger på halvautomatisk sporing; klik på Spring automatisk oprettelse. Modulet interfacet viser nu fanen Draw. Her skal du vælge AutoPath som en metode, dendritceller som type, og input den anslåede dendritceller diameter.
      3. Brug Vælg tilstand af markøren, vender markøren ind i en kasse. Shift-højre-klik på dendritceller udgangspunkt. Bemærk: softwaren udfører første beregninger.
      4. Flyt markøren langs dendritceller. Fra startpunktet (repræsenterered som en blå kugle), er en gul linje, der repræsenterer den mest sandsynlige dendritceller sti vist. Shift-venstre-klik på dendritceller endpoint.
    3. Udfør den automatiske pigge segmentering. Bemærk: De pigge på sporet dendritceller findes automatisk af modulgrænsefladen.
      1. I modulet interfacet, skal du klikke på fanen Oprettelse. I drop-listen Genopbyg, vælge Genopbyg dendritceller diameter og tjek Behold data feltet. Klik derefter på Genopbyg.
      2. Indstil tærsklen, så den segmenterede volumen svarer til den faktiske dendritceller volumen. Som en algoritme, skal du vælge korteste afstand fra Afstand Kort. Klik på knappen Næste.
      3. Bestem den mindste rygsøjlen hoved diameter og den maksimale længde, igen ved hjælp af afstanden værktøj i fanen af softwaren Slice, derefter vende tilbage til fanen Overgå og indtast parametrene. Feller denne protokol, værdier omkring 200-300 nm for minimal diameter og 4 um for maksimal længde er gode udgangspunkter. Ikke kontrollere Tillad Branch Spines kassen. Klik på knappen Næste.
      4. Juster kimpunkter Threshold, så de blå punkter, der repræsenterer pigge lokalisere de faktiske rygsøjlen hoveder. Klik på knappen Næste. Bemærk: Kernen Beregningen sker nu og kan være langvarig.
    4. Klassificere pigge ved at gå til fanen af modulet interfacet Tools. Klik på Klassificer pigge. I bedt brugergrænseflade, skal du sørge for, at der er fire klasser, der er defineret ved deres morfologi som følger: Stubby: længde <1 um; Mushroom: Længde (rygsøjlen)> 3 og Max bredde (hoved)> betyder bredde (hals) x 2; Lang tynd: Middel bredde (hoved) ≥ Mean bredde (halsen); Filopodia-lignende: Længde ≤ 4 um (ingen hoved).
      Bemærk: moDule grænseflade genererer fire nye Filamentviklemaskiner objekter, der indeholder resultaterne af klassificeringen.
    5. Eksport Statistisk data: på nogen af disse fire objekt grænseflader, gå til fanen Statistik.
      Klik på Eksporter al statistik til fil knappen.
      Bemærk: Andre statistiske værdier kan eksporteres til dendritter (. Fx længde, areal, middeldiameter, gren dybde, forgrening vinkel, volumen, osv.) Og til pigge (f.eks rethed, område for fastgørelse, længde og volumen af særskilte rygsøjlen dele, rygsøjlen diameter, tætheder, osv.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Den foreliggende undersøgelse beskriver en standardiseret protokol for rygsøjlen kvantificering af dyrkede dendritter af pyramideformede neuroner afledt af iPSC. Denne protokol muliggør analysen af rygsøjlen modning på menneskelige neuroner og dens mulige sammenligning med modning af pigge i standard gnaver neuronkulturer samt i in vivo-dyremodeller.

    Figur 1A viser et skema over de forskellige trin i kultur, der tillader produktion af corticale pyramideneuroner. En sådan skematisk repræsentation gives for bedre at forstå den globale tid skalering af produktionen af ​​pyramideformede neuroner udstyret med forskellige kategorier af pigge. Reprogrammation trin, er imidlertid uden for rammerne af denne undersøgelse og er blevet beskrevet andetsteds 4. Sunde neuroner kan holdes i kultur op til 65 -. 70 dage Figur 1B viser arbejdsgangen for billedbehandling og 3D-kvantificering af pigge.

    ove_content "> Figur 2A illustrerer dyrkning af humane neuroner mærket med et anti-beta lll-tubulin-antistof. Denne figur viser også tendensen celle klyngedannelse. Figur 2B viser et GFP-mærket pyramideformet neuron af de overfladiske kortikale lag på 40 dage efter differentiering af sene kortikale stamfædre (LCP).

    Figur 2C og 3A illustrerer 3D-rekonstruktion af segmenter af dendritiske spidser på forskellige stadier af modning. Den kvantitative analyse af to udvalgte parametre (rygsøjlen tætheder og ryg hoved volumen) er repræsenteret i figur 3B. Vores resultater viser, at disse to parametre stige i løbet af dyrkningsperioden som forventet.

    Figur 1
    Figur 1. (A) Oversigt over tidshorisont af neuronal diff erentiation. Dette skematisk beskriver de tre trin af neuronal differentiering. Protokollen er tilpasset fra Boissart et al. 4. I trin 1 er menneskelig iPSC afledt i tidlige kortikale progenitorer (dvs.., Tidlig neuro-epitel celler fra dorsale telencephalon) efterfulgt af transformation til slutningen af kortikale stamfædre (LCP). LCP derefter amplificeret i cellebanker i flydende nitrogen. I trin 2 er neural differentiering opnået inden for to uger. Trin 3 svarer til opretholdelse af neuroner i kultur i længere perioder, med henblik på at følge rygsøjlen voksende og gradvise modning. Under de dyrkningsbetingelser, kan sunde neuroner holdes op til 65 -. 70 dage (B) Workflow af de forskellige trin for billedbehandling og 3D-kvantificering af pigge. (IF: immunofluorescens). Klik her for at se en større version af dette tal.

    ove_content "fo: holde-together.within-side =" altid "> Figur 2
    Figur 2. (A) Beta III tubulin positive celler afslørede ved immunofluorescens ved anvendelse af den samme protokol som beskrevet, og et polyklonalt anti-beta III tubulin antistof anvendes i en fortynding på 1 / 1.000. (B) Primær og sekundær dendritiske forgrening af et GFP -mærket pyramideformet neuron dyrket 40 dage efter LCP fase. I det indsatte, er det samme neuron repræsenteret ved en lavere forstørrelse med tilsyneladende celle krop. (C) 3D-rekonstruktion af to kategorier af pigge på et segment af en sekundær dendritceller. Scale barer:. 250 um (A), 100 um (B), 40 pm (B indsat), 1,5 um (C) Klik her for at se en større version af dette tal.


    Figur 3. (A) 3D-rekonstruktion af dendritiske Torner (blå farve) med illustrerede segmenter af sekundære dendritter (grå farve), på to forskellige stadier Kultur (25 og 45 dage efter differentiering fra LCP). (B) Kvantitativ analyse af rygsøjlen tætheder og morfologier med to udvalgte parametre såsom rygsøjlen tæthed langs dendritceller og rygsøjle hoved volumen og ved to kultur perioder. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM af mindst 10 forskellige neuron segmenter opnået fra sekundære dendritter afbildet ved konfokal mikroskopi. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en Mann-Whitney-test (* p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den kvantificering af de morfologiske træk af pyramideformede neuroner påberåbt softwaren. Glødetråden Tracer grænsefladen blev anvendt til segmentering af neuroner og pigge, og XT modulet blev anvendt til analysen.

    For at analysere nøjagtigheden af vores teknik, vi først sammenlignet de målte morfologiske parametre (længde, areal, og total rygsøjlen volumen, når det er relevant), med dem, der offentliggøres ved hjælp af rotte modne pyramideformede neuroner i kultur 6, 7 og menneskelige hjernevæv 3. Densiteter var sammenlignelige i alle tilfælde. Ingen data volumen blev beskrevet i rotte neuroner (en 2D-analyse blev rapporteret med den software, der bruges af forfatterne), mens den samlede rygsøjlen volumen var lidt reduceret i forhold til vores data, i studiet af Benavides-Piccione 3 ved hjælp af deres egen protokol for volumen genopbygning på udvalgte pigge. Sådanne forskelle kan også forklares ved den regionale oprindelse af celler og det fluorescerende farvestof anvendes til deresmærkning.

    Nogle kritiske punkter bør understreges i vores protokol, som primært henvises til tærskel definitioner for konfokal kvaliteten af ​​billeder og efterfølgende kvantificeringer. Koblingen af ​​transduktionen af ​​et GFP-lentivirusvektor med anti-GFP immunfluorescens sikrer en god mærkning og visualisering af hele rygsøjlen strukturer. Vi var ikke i stand til at mærke den fulde dendritiske arborization ved transfektion omprogrammerede celler med GFP vektorer og ved konventionelle protokoller. Typisk 70 - 80% er transduceret under vore eksperimentelle betingelser. Denne procentdel er meget større end hvad vi observeret ved anvendelse transfektionsprotokoller med GFP plasmider (15% af transficerede neuroner i vores test).

    Afhængig af effektiviteten og specificiteten af ​​mærkning, kan Gaussisk filtrering eller udfoldning være nyttig som en præ-behandlingstrin for at mindske støj. Vi testede også 3D-billedet genopbygning og kvantificering efter deconvolution. Denne process var forventet at være nyttig, fordi selv med konfokal billeddannelse, udfoldning betydeligt forbedrer billedkvaliteten og grænser sløring forårsaget af diffraktion. Dekonvolution dog lægger et stort pres på den billeddannende trin pålægge barske rumlig sampling i alle tre retninger. Med optisk opsætning anvendes i denne protokol, det ønskede pixelstørrelse for udfoldning er omkring 40 nm, mens vi sat for omkring 80 nm for billederne præsenteret her. Flytning til 40 nm ville firedoble købet tid, og sænk foton udbytte pixel. Desuden under de eksperimentelle betingelser, ingen signifikant forbedring af segmentering resultater blev observeret i forhold til de resultater, som kan være blevet opnået med Gaussisk filtrering. Protokollen bygger derfor på denne enklere efterbehandling skridt, og lempet de Z prøveudtagning begrænsninger under billedbehandling. Dette vil til gengæld formindsket erhvervelse tid og prøve blegning.

    Glødetråden Tracer modulet tilbyder et fuldt automatic segmentering. Men i denne type kultur, neuronerne er ofte tætte, krydser over hinanden, og afbildes fra en stærk baggrund. Dette påvirker negativt nøjagtigheden af ​​automatiske segmentering. Den semi-automatiske segmentering ført til mere robuste resultater og effektiv behandling. Denne består af en guidet sporing af dendritter fra basale krop neuron, efterfulgt af en automatisk 3D-segmentering af pigge langs udvalgte dendritter.

    Vores metode kunne anvendes til at udføre time-lapse billedbehandling og optage direkte rygsøjlen modning i levende neuroner fra rotte primære corticalneuroner, som beskrevet tidligere 8.

    Humane iPSC-afledte neuroner har henledt forskerne og der har været de seneste forsøg på at modellere neurologiske lidelser, herunder autisme spektrum forstyrrelser 9-14. I kortikale kredsløb, dendritiske Torner spille en vigtig rolle i etableringen af ​​excitatoriske synapser, men dereskvantitativ analyse er dårligt dokumenteret i mennesker med neurologiske lidelser. Under udviklingen og hele levetid, de tætheder af pigge og deres morfologier er afgørende for konnektivitet af neuronale kredsløb. I patologier med genetiske årsager, anvendelse af iPSC-afledte neuroner fra patientens biopsier (f.eks. Fibroblaster) tillader analyse af kredsløb udvikling mellem neuroner udtrykker det muterede gen (er), der kunne være ansvarlig for sygdomstilstande. Denne protokol udgør en kraftfuld metode til omfattende in vitro-analyser af spinogenesis inden for en population af muterede neuroner og sammenligning af fænotyper med omprogrammerede neuroner fra kontrolpersoner.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    Tre-dimensionel Kvantificering af dendritiske Spines fra pyramideneuroner Afledt af menneskeskabte pluripotente stamceller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter