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Developmental Biology

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Abstract

Dendriten sind kleine Vorsprünge, die mit den postsynaptischen Kompartimente von exzitatorischen Synapsen des zentralen Nervensystems zu entsprechen. Sie sind entlang den Dendriten verteilt sind. Ihrer Morphologie ist weitgehend abhängig von der neuronalen Aktivität, und sie dynamisch sind. Dendritenfortsätzen exprimieren glutamatergen Rezeptoren (AMPA und NMDA-Rezeptoren) auf ihrer Oberfläche und auf der Ebene der postsynaptischen Dichten. Jeder Dorn ermöglicht das Neuron seine staatlichen und lokalen Aktivität unabhängig zu steuern. Wirbelsäulen Morphologien wurden ausgiebig in glutamatergen Pyramidenzellen der Hirnrinde untersucht, wobei sowohl in-vivo-Ansätzen und neuronale Kulturen aus Nagetiergewebe erhalten. Neuropathologischen Bedingungen können zu veränderten Wirbelsäule Induktion und Reifung verbunden werden, weil in Nagetier kultivierten Neuronen und eindimensional quantitative Analyse. 1 gezeigt Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll für die 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien mit menschlichen Cortial Neuronen aus neuralen Stammzellen (späten kortikalen Vorläuferzellen) stammt. Diese Zellen wurden ursprünglich von pluripotenten Stammzellen erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Morphologien bei unterschiedlichen Kulturperioden und mit möglichen Vergleich zwischen pluripotenten Stammzellen, die aus Kontroll-Individuen mit denen von Patienten mit psychiatrischen Erkrankungen erhalten wird.

Introduction

Dendritischen Dornen kortikaler Pyramidenzellen sind klein und dünn Vorsprüngen, die entlang der basalen und apikalen Dendriten dieser neuronalen Subtypen in Nagetier, Primaten und menschliche Gehirn verteilt sind. Sie sind die Websites der meisten Synapsen und Anzeige Tastenfunktionen beim Lernen und kognitive Prozesse. Die detaillierten Strukturen der menschlichen dendritischen Dornen wurden technisch durch Elektronenmikroskopie 2 untersucht. Allerdings ist eine solche Vorgehensweise zeitaufwendig und stellt hohe Arbeitsbelastung. In jüngerer Zeit hat eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Morphologie der dendritischen Dornen in menschlichen Hirnrinde mit spezifischer Software kombiniert werden, um große manuelle Wirbelsäulenanalyse 3 gemeldet.

Green Fluorescence Protein (GFP) Technologie, um Immun gekoppelt stellt ein genaues Werkzeug für die Wirbelsäulen Identifizierung und Formmessung durch Fluoreszenzmikroskopie. Diese Vorgehensweise kann leicht an kultivierten Neuronen angewendet werden. However, haben keine Angaben über die Analyse der Wirbelsäule Reifung und Morphologie auf die menschliche Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) abgeleitet gemeldet.

Das Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll, das dendritischen Dorn Abbildungs ​​aus kultivierten menschlichen Nervenzellen in vitro ermöglicht beschreiben. GFP-Markierung, die konfokale Mikroskopie und 3D-Analyse mit dem Filament Tracer-Modul von Imaris Software wurden in dem vorliegenden Protokoll verwendet. Kultur Schritte, die erforderlich sind, um kortikale glutamatergen Neuronen der Schichten II bis IV von neuralen Stammzellen (NSC) zu erhalten sind, sind auch hier kurz beschrieben. Das gesamte Protokoll für den menschlichen NSC Produktion hat bereits an anderer Stelle 4 veröffentlicht.

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Protocol

1. Neuronale Kultur

Hinweis: Fibroblast Umprogrammierung in pluripotente Stammzellen, die Verpflichtung zu der dorsalen Telencephalon Abstammung, Abstammung, Amplifikation und Banken der späten kortikalen Vorläuferzellen (LCP) wurden in BOISSART et al 4 beschrieben. Neuronale Differenzierung von LCP-ähnlichen Zellen wurde ebenfalls nach BOISSART et al 4 mit leichten Modifikationen durchgeführt. Andere Verfahren sind für direkten Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen gefolgt von deren Differenzierung in Neuronen entwickelt. Dieses Protokoll wurde beibehalten, da es die selektive Herstellung von pyramiden glutamatergen Neuronen.

  1. Gönnen 6-Well-Kulturplatten mit Deckgläschen mit Poly-Ornithin (1/6 in DPBS verdünnt, Lager-Konzentration 0,01%) O / N gefolgt von drei Wäschen in DPBS. Dann fügen Laminin (Stammkonzentration 1 mg / ml, in DPBS verdünnt 500 mal) für mindestens 10 Stunden unter der Flow-Haube .
  2. Platte und Versand NSC bei niedriger Dichte (50.000 Zellen / cm 2) in 6-Well-Kulturplatten mit Deckgläschen in 3 ml Kulturmedium, bestehend aus DMEM / F12 (500 ml), 2 Fläschchen (je 5 ml) von N2 zu ergänzen, 2 Fläschchen (jeweils 10 ml) von B27 Supplement, 10 ml Pen-Streptomycin (Penicillin = 10.000 Einheiten / ml und Streptomycin = 10.000 Einheiten / ml), 1 ml 2-Mercaptoethanol (Stammlösung: 50 mM) und Laminin (1 / 500) ohne Wachstumsfaktoren. Entscheidender Schritt: Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch Zugabe von Zellen, die mit langsamen Drehbewegungen um Zellclusterbildung zu reduzieren.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium. Add frischen N2B27 Medium, das 2 & mgr; g / ml frischem Laminin-Lösung, um das Neuron auf den Deckgläsern befestigt zu halten und Klumpenbildung zu vermeiden. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage. Halten einige der verbleibenden Medium (200 ul) vor der Zugabe von frischem Medium, um die Zelle vor dem Trocknen zu verhindern. Alternativ gehen Sie schnell und ändern Sie das Gesamtvolumen (3 ml).
e_title "> 2. Lentivirale Transduction

Hinweis: GFP lentiviralen Vektoren wurden freundlicherweise von Dr. Uwe Maskos Labor am Institut Pasteur (Paris) zur Verfügung gestellt und nach der veröffentlichten Protokoll 5 hergestellt. GFP-Expression durch die Maus Phosphoglyceratkinase (PGK) Promotor angetrieben. Für diese Studie wurde von 400 ng / ul (Stammlösung in PBS 1x) Virustiter.

  1. Transduktion menschlicher iPSC abgeleiteten Neuronen in jeder Stufe der Reifung von Viruspartikeln durch Zugabe von 1 ul der Stammlösung, die 40 ng des GFP lentiviralen Vektor pro Kulturvertiefung (6-Well-Platten) und Inkubation für 48 Stunden in frischem Kulturmedium. Hinweis: Bei diesem Protokoll wird die Dauer der Inkubation ermöglicht eine gute Kennzeichnung von Wirbelsäulenstrukturen.

3. Immunfluoreszenz

Anmerkung: Um die Kennzeichnung der gesamten Wirbelsäule Morphologie zu verbessern, wurde Immunfluoreszenz-Markierung unter Verwendung eines anti-GFP-Antikörper in permeabilisierten Bedingungen.

  • Entfernen Kulturmedium und fixieren transduzierten Zellen auf Deckgläsern in 4% Paraformaldehyd für 10 min bei RT, dann waschen 3 Mal in 1x PBS (jeweils 10 Minuten).
  • Immerge Deckgläser in PBS, ergänzt mit 0,05% Triton (100x) und 10% Pferdeserum, 1 h bei RT, dann 3 x waschen in 1x PBS.
  • 100 ul 1x PBS, ergänzt mit 4% Pferdeserum und primärem Antikörper (1 / 1.000) gegen GFP angehoben und um einen Faktor von 1,000 auf jedem Deckglas verdünnt. Inkubieren in einer dunklen Box O / N bei 4 ° C, dann waschen 3 Mal mit 1x PBS.
  • Verdünnter Alexa Fluor 488-konjugiertem Antikörper (1/200) in PBS, ergänzt mit 0,5% Tween 20 und Inkubation für 1 h bei RT. Dann waschen 3 Mal in 1x PBS und montieren Deckgläser auf Glasobjektträger mit Eindeckmittel für die Fluoreszenzmikroskopie.
  • 4. dendritischen Dorn Imaging

    1. Führen konfokale Bildgebung durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop.
    2. Wählen Sie gesunde Neuronen mit pyramidenförmigen Morphologie einnd eine vollständige dendritischen Verzweigung, und zu quantifizieren, mindestens 10 Neuronen pro Bedingung aus getrennten Versuchen. Quantifizierung von 60 bis 100 & mgr; m pro Dendriten.
    3. Erwerben Sie Bilder mit einem 40x Öl NA = 1.3 Objektiv und eine 488 nm Laserlinie für die GFP-Anregung mit einer typischen Spitzenleistung auf Sample-Ebene etwa 20 & mgr; W. Set Pixelgröße etwa 80 nm, um richtig zu probieren dendritischen Dornen.
      Hinweis: Die nachfolgende Analyse Forderung nach einem Bild, in dem der Lärm nicht die richtige Segmentierung von Dendriten und Dornen zu kompromittieren. Mit den genannten räumlichen Abtastung und Leistungseinstellung, haben wir beobachtet, dass ein Pixel-Verweilzeit von 3,15 & mgr; s ist ausreichend, um genügend Photonen auf ein solches Bild aufbauen zu sammeln. Für trübe Proben, kann die Bildqualität durch Mittelung 2-4 Scans verbessert werden. Die Übernahme von mehreren XY Fliesen erforderlich sein, um den interessierenden Bereich, die dann vor der Verarbeitung zusammengenäht werden, zu decken.
    4. Zur Probe das gesamte Neuronenvolumen, eine Z-Stapel zu erwerben, miteine Z Abstand im Bereich von 150 nm bis 300 nm, wodurch 20 bis 30 Z-Scheiben.
      Hinweis: Die laterale räumliche Auflösung mit diesen Einstellungen wird erreicht, 234 nm und die axiale Auflösung von 591 nm. Die hier gewählte Abtastrate ist ausreichend, aber die axiale Auflösung größer ist als die kleinste Größe der Stacheln abzubildenden die Analyse begünstigt die Stacheln, die sich seitlich von den Dendriten erstrecken.

    5. 3D-Quantifizierung von dendritischen Dornen

    Anmerkung: Die folgenden Abschnitte beschreiben speziell die Verwendung des Imaris Software für die Analyse. Alternative Implementierungen gibt, einschließlich NeuronStudio 15 oder Metamorph 8, die ähnliche Ergebnisse liefern kann.

    Verwenden Sie die folgenden Tasteneinstellungen:

    1. Als Vorverarbeitungsstufe, verwenden Gauss-Filterung durch die Bildverarbeitungseinrichtungen von der Software angeboten. Führen Gauss-Filterung über die Bildverarbeitung> SmooSache> Gauß-Filter. Stellen Sie die Filterbreite gleich der Pixelgröße in XY sein.
    2. Führen Sie eine halbautomatische Rückverfolgung von Dendriten, mit dem Filament Tracer-Modul der Software.
      1. Zunächst schätzen den Dendriten Durchmesser, durch eine Distanz Tool auf der Registerkarte Scheibe der Software.
      2. In der Registerkarte Surpass, klicken Sie auf den Fäden Werkzeug. Für eine bessere Robustheit, stützt sich dieses Protokoll auf halbautomatischen Spurhaltung; klicken Sie auf Weiter automatische Erstellung. Die Modulschnittstelle zeigt nun die Registerkarte ziehen. Wählen Sie hier AutoPath als eine Methode, Dendrite als eine Art, und geben Sie die geschätzten Dendriten Durchmesser.
      3. Verwenden Sie den Auswahlmodus des Zeigers, drehen Sie den Cursor in eine Box. Umschalt-Rechtsklick auf den Dendriten Ausgangspunkt. Hinweis: Die Software führt ersten Berechnungen.
      4. Bewegen Sie den Mauszeiger entlang der Dendriten. Vom Ausgangspunkt (vertretened als blaue Kugel), eine gelbe Linie, die die wahrscheinlichste Dendriten Pfad gezeigt. Umschalt-Linksklick auf den Dendriten Endpunkt.
    3. Führen Sie die automatische Stacheln Segmentierung. Hinweis: Die Stacheln auf dem Dendriten zurückzuführen sind, die von der Modulschnittstelle automatisch gefunden.
      1. In der Modulschnittstelle, klicken Sie auf die Registerkarte Erstellen. In der Rebuild der Dropdown-Liste, wählen Sie Rebuild Dendrite Durchmesser und überprüfen Sie die Fried Feld. Klicken Sie dann auf Neu erstellen.
      2. Stellen Sie den Schwellenwert, so dass der segmentierte Volumen entspricht dem aktuellen Dendriten Volumen. Als ein Algorithmus, wählen Kürzeste Entfernung Entfernung Karte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.
      3. Bestimmen Sie die kleinste Wirbelsäule Kopfdurchmesser und die maximale Länge, erneut unter Verwendung des Abstands Tool auf der Registerkarte Scheibe der Software, dann wieder auf die Registerkarte Surpass kommen und geben Sie die Parameter. Foder dieses Protokoll, Werte um 200 bis 300 nm für minimale Durchmesser und 4 & mgr; m für die maximale Länge sind gute Ausgangspunkte. Aktivieren Sie das Allow Niederlassung Spines Feld. Klicken Sie auf Weiter.
      4. Stellen Sie die Seed-Punkte Threshold so dass die blauen Punkte, die Stacheln zu lokalisieren, um tatsächlichen Wirbelsäule Köpfe. Klicken Sie auf Weiter. Hinweis: Die Eckpunkte für die Berechnung ist nun fertig und kann langwierig sein.
    4. Klassifizieren Stacheln, indem Sie auf der Registerkarte Extras der Modulschnittstelle. Klicken Sie auf Classify Spines. In der Sie dazu aufgefordert Benutzeroberfläche, stellen Sie sicher, dass es vier Klassen, von ihrer Morphologie wie folgt definiert: Stubby: Länge <1 & mgr; m; Pilz: Länge (Wirbelsäule)> 3 und Max Breite (Kopf)> bedeuten Breite (Hals) x 2; Lange dünne: Mittlere Breite (Kopf) ≥ mittlere Breite (Hals); Filopodien artig: Länge ≤ 4 & mgr; m (ohne Kopf).
      Hinweis: Die modul Schnittstelle erzeugt vier neuen Filament Objekte enthält die Ergebnisse der Klassifizierung.
    5. Export Statistische Daten: auf jeder dieser vier Objektschnittstellen, auf die Registerkarte Statistik zu gehen.
      Klicken Sie auf die Export Alle Statistiken to Datei.
      Hinweis: Weitere statistische Werte können für Dendriten exportiert werden (. ZB Länge, Fläche, mittlerer Durchmesser, Zweigtiefe, Verzweigungswinkel, Lautstärke, etc.) Und für die Stacheln (zB Geradheit, Bereich der Befestigung, Länge und Volumen der verschiedenen Wirbelsäulenteile, Wirbelsäule Durchmesser, Dichte, etc.)

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    Representative Results

    Die vorliegende Studie beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die Wirbelsäule Quantifizierung der kultivierten Dendriten der Pyramidenzellen aus iPS abgeleitet. Dieses Protokoll erlaubt die Analyse der Wirbelsäule Reifung auf die menschliche Neuronen und ihre möglichen Vergleich mit der Reifung von Stacheln in Standard-Nagetier neuronalen Kulturen als auch in in vivo Tiermodellen.

    1A stellt ein Schema der verschiedenen Schritte der Kultur, die die Produktion der kortikalen Pyramidenneuronen ermöglichen. Solche schematische Darstellung ist, um die globalen Zeitskalierung der Produktion von Pyramidenzellen mit verschiedenen Kategorien von Dornen ausgestattet ist, besser zu verstehen ist. Neuzuteilung Schritte sind jedoch aus dem Rahmen der vorliegenden Studie wurden an anderer Stelle und 4 beschrieben worden. Gesunde Nervenzellen können in Kultur bis zu 65 gehalten werden. - 70 Tage 1B zeigen den Workflow von Imaging und 3D-Quantifizierung von Stacheln.

    ove_content "> 2A stellt die Kultur von menschlichen Nervenzellen mit einem Anti-beta-III-Tubulin-Antikörper markiert. Diese Abbildung zeigt auch die Tendenz des Zell Clustering. 2B zeigt eine GFP-markierten pyramidalen Neuronen der oberflächlichen kortikalen Schichten auf 40 Tage nach der Differenzierung der späten kortikalen Vorläuferzellen (LCP).

    2C und 3A veranschaulichen 3D-Rekonstruktion der Segmente dendritischen Dornen in verschiedenen Stadien der Reifung. Die quantitative Analyse der beiden gewählten Parameter (Wirbelsäule Dichten und Wirbelsäule Kopfvolumen) ist in 3B dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, daß diese beiden Parameter ansteigen über die Kulturdauer, wie erwartet.

    Abbildung 1
    Figur 1 (A) Überblick über die Zeitskala des neuronalen diff erentiation. Diese schematische Darstellung beschreibt die drei Schritte der neuronalen Differenzierung. Das Protokoll wird von BOISSART et al. 4 angepaßt ist. In Schritt 1, human iPSC sind in frühen kortikalen Vorläufern abgeleitet (dh., Frühe neuro-Epithelzellen von der dorsalen Telencephalon), gefolgt von Umwandlung zu spät kortikalen Progenitoren (LCP). LCP werden dann für Zellbanken in flüssigem Stickstoff verstärkt. In Schritt 2 wird neuronalen Differenzierung innerhalb von zwei Wochen erreicht. Schritt 3 entspricht dem Beibehalten der Neuronen in Kultur für längere Zeiträume, um die Wirbelsäule wächst und progressive Reifung zu. 70 Tage (B) Arbeitsablauf der verschiedenen Schritte für die Bildgebung und 3D-Quantifizierung von Stacheln - unter den Kulturbedingungen, gesunde Neuronen können bis zu 65 gehalten werden.. (IF: Immunfluoreszenz). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 2
    Figur 2 (A) Beta-III-Tubulin-positive Zellen durch Immunfluoreszenz zeigte, unter Verwendung des gleichen Protokolls, wie beschrieben, und einem polyklonalen Anti-beta-III-Tubulin-Antikörper bei einer Verdünnung von 1 / 1.000 verwendet. (B) primäre und sekundäre dendritische Verzweigung eines GFP -markierten Pyramidenzelle kultiviert 40 Tage veröffentlichen LCP Bühne. In dem Einsatz der gleichen Neuronen bei einer niedrigeren Vergrßerung mit offensichtlichen Zellkörper (C) 3D-Rekonstruktion der beiden Gruppen von Dornen auf einem Segment eines Sekundärdendritarmabstand dargestellt.. Maßstabsbalken:. 250 & mgr; m (A), 100 & mgr; m (B), 40 & mgr; m (B Einschub), 1,5 & mgr; m (C) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


    Abbildung 3. (A) 3D-Rekonstruktion der dendritischen Dornen (blaue Farbe) mit dargestellt Segmente sekundären Dendriten (graue Farbe), bei zwei verschiedenen Kulturstufen (25 und 45 Tage nach der Unterscheidung von LCP). (B) Die quantitative Analyse der Wirbelsäule Dichten und Morphologien mit zwei ausgewählten Parameter wie Wirbelsäule Dichte entlang Dendriten und Wirbelsäule Kopfvolumen und an zwei Kulturperioden. Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM von mindestens 10 aus sekundären Dendriten durch konfokale Mikroskopie abgebildet erhaltenen unterschiedlichen Neuron Segmente dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte mit einem Mann-Whitney-Test (* p <0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Discussion

    Die Quantifizierung der morphologischen Merkmale der Pyramidenneuronen stützte sich auf die Software. Das Filament Tracer Oberfläche wurde für die Segmentierung von Neuronen und Dorne verwendet, und die XT-Modul wurde für die Analyse verwendet.

    Um die Genauigkeit der unsere Technik analysieren wir zunächst Vergleich der gemessenen morphologischen Parameter (Länge, Fläche, und die Gesamtmenge der Wirbelsäule, wenn zutreffend), mit denen veröffentlichte unter Verwendung von Ratten reife Pyramidenzellen in Kultur 6, 7 und menschlichen Hirngewebe 3. Dichten in allen Fällen vergleichbar. Keine Volumendaten wurden in Rattenneuronen beschrieben Die Summe der Wirbelsäule Lautstärke über ihr eigenes Protokoll für die Volumenrekonstruktion (ein 2D-Analyse wurde mit dem von den Autoren verwendete Software berichtete) wurde leicht reduziert, im Vergleich zu unseren Daten in der Studie von Benavides-Piccione 3 auf ausgewählten Stacheln. Solche Unterschiede könnten auch durch die regionale Herkunft der Zellen und dem Fluoreszenzfarbstoff für die verwendet wird, erläutert ihreKennzeichnung.

    Einige kritische Punkte sollten in unserem Protokoll, das in erster Linie beziehen sich auf Schwellenwertdefinitionen für die konfokale Bildqualität und die anschließende Quantifizierung unterstrichen. Die Kopplung der Transduktion eines GFP-lentiviralen Vektor mit Anti-GFP Immunofluoreszenz gewährleistet eine gute Markierung und Visualisierung der gesamten Wirbelsäule Strukturen. Wir waren nicht in der Lage, die volle dendritische Verzweigung durch Transfektion umgewandelten Zellen mit GFP-Vektoren und von herkömmlichen Protokollen markieren. In der Regel 70 - 80% sind unter unseren experimentellen Bedingungen transduziert. Wobei dieser Prozentsatz ist viel größer als das, was wir mit Transfektionsprotokolle mit GFP-Plasmide (15% der transfizierten Neuronen im Test) untersucht.

    Abhängig von der Effizienz und Spezifität der Markierung kann Gauss-Filterung oder Dekonvolution nützlich sein als eine Vorverarbeitungsstufe Rauschen zu vermindern. Wir testeten auch die 3D-Bildrekonstruktion und Quantifizierung nach der Entfaltung. Diese process wurde erwartet, um nützlich zu sein, denn selbst mit konfokaler Bildgebung, Dekonvolution Bildqualität erheblich verbessert und Grenzen Unschärfe durch Beugung verursacht. Entfaltung jedoch stellt eine große Belastung für die bildgebenden Schritt, imposante rauen räumliche Abtastung in allen drei Richtungen. Mit optischen Aufbau in diesem Protokoll verwendet, die gewünschte Pixelgröße für die Entfaltung ist etwa 40 nm, während wir für etwa 80 nm für die hier präsentierten Bilder eingestellt. Umzug in 40 nm würde die Erfassungszeit vervierfachen, und senken Sie die Photonenausbeute Pixel. Zusätzlich können unter den Versuchsbedingungen keine signifikante Verbesserung in der Segmentierungsergebnisse wurden verglichen mit den Ergebnissen, die mit Gauss-Filterung erhalten wurden, beobachtet. Das Protokoll setzt daher auf diesem einfachere Nachbearbeitung Schritt und entspannt die Z Probenahme Einschränkungen während der Bildgebung. Dies wiederum verringert die Erfassungszeit und Proben Bleichen.

    Das Filament Tracer-Modul bietet eine voll automatic Segmentierung. Doch in dieser Art von Kultur, sind die Nervenzellen oft dicht, einander überkreuzen, und werden von einem starken Hintergrund abgebildet. Dies beeinträchtigt die Genauigkeit der automatischen Segmentierung. Die halbautomatische Segmentierung führte zu robuster Ergebnisse und effiziente Verarbeitung. Diese besteht aus einer geführten Rückverfolgung von Dendriten von der Basaltemperatur des Neurons, gefolgt von einer automatischen 3D-Segmentierung von Stacheln entlang ausgewählter Dendriten.

    Unsere Methode könnte verwendet werden, um Zeitraffer-Bildgebung durchführen und direkt aufzeichnen Wirbelsäule Reifung in lebenden Nervenzellen von primären Ratten-kortikalen Neuronen, wie zuvor 8 beschrieben.

    Menschlichen iPS-abgeleiteten Neuronen haben die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler gezogen und es wurden die jüngsten Versuche, neurologische Entwicklungsstörungen wie Autismus 9-14 modellieren. In kortikalen Schaltkreisen, Spiel dendritischen Dornen eine wichtige Rolle bei der Gründung der Synapsen, aber ihrequantitative Analyse wurde schlecht bei Menschen mit Entwicklungsstörungen des Nerven dokumentiert. Während der Entwicklung und in der gesamten Lebensdauer, die Dichten von Stacheln und ihre Morphologien kritisch für Konnektivität neuronaler Schaltkreise. Bei Pathologien, die mit genetischen Ursachen, die Verwendung von iPSC abgeleiteten Neuronen aus Biopsien von Patienten (z. B. Fibroblasten) erlaubt die Analyse von Schaltungen Entwicklung zwischen Neuronen, die das mutierte Gen (en), die für Krankheitszustände verantwortlich sein könnte exprimieren. Dieses Protokoll stellt einen leistungsfähigen Ansatz für umfangreiche In-vitro-Analyse der spinogenesis innerhalb einer Population von mutierten Neuronen und Vergleich der Phänotypen mit umprogrammiert Neuronen von Kontrollpersonen.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

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    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
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    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

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