Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

Abstract

קוצים הדנדריטים הם בליטות קטנות שמתאימות לתאי פוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות במערכת העצבים המרכזית. הם מופצים יחד דנדריטים. המורפולוגיה שלהם תלויה במידה רבה בפעילות עצבית, והם דינמיים. קוצים הדנדריטים לבטא קולטנים glutamatergic (קולטני AMPA וNMDA) על פני השטח שלהם וברמות של צפיפות פוסט-סינפטי. כל עמוד השדרה מאפשרת נוירון כדי לשלוט בפעילות מקומית ואת מדינתו באופן עצמאי. מורפולוגיות עמוד השדרה נחקרו רבות בתאים פירמידליים glutamatergic של קליפת המוח, באמצעות שני גישות in vivo ותרבויות עצביות המתקבלות מרקמות מכרסמים. יכולים להיות קשורים לתנאי נוירו אינדוקציה עמוד השדרה שינו והתבגרות, כפי שמוצגים בנוירונים בתרבית מכרסמים וניתוח כמותי חד-ממדי 1. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניתוח כמותי של מורפולוגיות עמוד השדרה 3D באמצעות cortic אדםנוירונים אל שמקורם בתאי גזע עצביים (אבות קליפת המוח מאוחר). תאים אלה בתחילה התקבלו מתאי גזע pluripotent מושרה. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של מורפולוגיות עמוד השדרה בתקופות תרבות שונות, ועם השוואה אפשרית בין תאי גזע pluripotent מושרה מתקבלים מאנשים שליטה עם אלה המתקבלים מחולים במחלות פסיכיאטריות.

Introduction

קוצים הדנדריטים של תאי עצב בקליפת המוח הם פירמידה בליטות קטנות ודקים אשר מופצות לאורך הדנדריטים הבסיסיים ופסגה של תת העצבי אלה במכרסמים, קופים, ומוח אנושי. הם האתרים של רוב סינפסות מעוררות ולהציג פונקציות מרכזיות בלמידה ובתהליכים קוגניטיביים. המבנים מפורטים של קוצים הדנדריטים אדם נחקרו מבחינה טכנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 2. עם זאת, גישה כזו היא זמן רב ומייצגת עומס עבודה כבדה. לאחרונה, שחזור תלת ממדים (3D) במורפולוגיה של קוצים הדנדריטים דווח בקליפת המוח אנושית באמצעות תוכנה ספציפית בשילוב לניתוח בעמוד השדרה במדריך גדול 3.

טכנולוגיה ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) מצמידים את immunofluorescence מייצגת כלי מדויק לזיהוי עמוד השדרה ומדידת צורה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לנוירונים בתרבית. האוVer, אין נתונים דווחו על הניתוח של התבגרות עמוד השדרה ומורפולוגיה על נוירונים אנושיים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC).

מטרת המחקר הייתה לתאר את פרוטוקול, המאפשר הדמיה בעמוד השדרה הדנדריטים מתאי עצב אנושיים בתרבית במבחנה. תיוג GFP, מיקרוסקופיה confocal וניתוח 3D עם מודול נימת Tracer של תוכנת Imaris שמשו בפרוטוקול הנוכחי. צעדי תרבות שנחוצים כדי להשיג תאי עצב בקליפת המוח glutamatergic של שכבות השניה לIV מתאי גזע עצביים (המל"ל) הם גם תאר בקצרה כאן. הפרוטוקול כולו לייצור המל"ל אדם כבר פורסם במקום אחר 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עצבי תרבות

הערה: תכנות מחדש פיברובלסטים בתאי גזע pluripotent, מחויבת לשושלת telencephalon הגב, גזירה, הגברה, ובנקאות של אבות קליפת המוח מאוחר (LCP) תוארה באל Boissart et 4. בידול עצבי של תאים כמו LCP-גם ביצע על פי אל Boissart et 4 עם שינויים קלים. נהלים אחרים פותחו עבור תכנות מחדש ישיר של fibroblasts לתאי גזע pluripotent המושרה ואחריו הבידול שלהם לתאי עצב. פרוטוקול זה נשמר שכן הוא מאפשר ייצור סלקטיבית של תאי עצב glutamatergic פירמידה.

  1. פנק את תרבות צלחות 6-גם עם coverslips זכוכית עם פולי-ornithine (בדילול ל1/6 בDPBS, ריכוז המניה 0.01%) O / N, ואחריו שלושה שוטף בDPBS. לאחר מכן להוסיף laminin (ריכוז מניות 1 מ"ג / מיליליטר, בדילול 500 פעמים בDPBS) לפחות 10 שעות תחת מכסה המנוע הזרימה .
  2. צלחת ולשגר המל"ל בצפיפות נמוכה (50,000 תאים / 2 סנטימטר) בתרבות צלחות 6-גם עם coverslips זכוכית ב 3 מיליליטר של מדיום התרבות המורכב DMEM / F12 (500 מיליליטר), 2 בקבוקונים (5 מיליליטר כל אחת) של תוספת N2, 2 בקבוקונים (10 מיליליטר כל אחד) של תוסף B27, 10 מיליליטר של העט, סטרפטומיצין (פניצילין = 10,000 יחידות / מיליליטר וסטרפטומיצין = 10,000 יחידות / מיליליטר), 1 מיליליטר של 2-mercaptoethanol (פתרון במלאי: 50 מ"מ) וlaminin (1 / 500), ללא גורמי גדילה. שלב קריטי: לבצע את הצעד הזה בזהירות על ידי הוספת תאים עם תנועות סיבוב איטיות על מנת לצמצם אשכולות תא.
  3. הסר את מדיום התרבות. הוסף בינוני N2B27 טרי המכיל 2 מיקרוגרם / מיליליטר של פתרון laminin הטרי כדי לשמור על תא העצב מצורף על coverslips הזכוכית ולהימנע clumping. לשנות הבינוני כל 3 ימים. שמור חלק מבינוני שנותר (200 μl) לפני הוספה בינונית טרי כדי למנוע את התא מהתייבשות. לחלופין, להמשיך במהירות ולשנות את הנפח הכולל (3 מיליליטר).
e_title "> 2. lentiviral התמרה

הערה: וקטורי lentiviral GFP נמסרו באדיבות על ידי ד"ר Uwe Maskos מעבדה במכון פסטר (פריז) והוכנו על פי הפרוטוקול שפורסם 5. הביטוי של GFP הוא מונע על ידי האמרגן קינאז phosphoglycerate העכבר (PGK). במחקר זה, כייל נגיף היה של 400 ng / μl (פתרון מניות בPBS 1x).

  1. Transduce נוירונים נגזר iPSC אדם בכל צעד של התבגרות על ידי חלקיקים נגיפיים על ידי הוספת 1 μl של פתרון המניות המכיל 40 ng של וקטור GFP lentiviral לתרבות ו( 6-גם צלחות) ודגירה של 48 שעות במדיום תרבות טרי. הערה: פרוטוקול זה, משך הדגירה מאפשר תיוג טוב של מבני עמוד השדרה.

3. Immunofluorescence

הערה: על מנת לשפר את התיוג של כל מורפולוגיה עמוד השדרה, תיוג immunofluorescence בוצע באמצעות נוגדן אנטי GFP בתנאי permeabilized.

  • הסר בינוני תרבות ולתקן את תאי transduced על coverslips paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS (10 דקות כל אחד).
  • coverslips טובלים בPBS בתוספת 0.05% טריטון (100x) ו -10% בסרום סוס עבור שעה 1 ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS.
  • להוסיף של 1x PBS 100 μl בתוספת 4% בסרום סוס ונוגדן ראשוני (1/1000) שהועלה נגד GFP ומדולל בפקטור של 1000 על כל coverslip. דגירה בO תיבה כהה / N ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם 1X PBS.
  • לדלל נוגדן אלקסה פלואוריד 488-מצומדת (1/200) בPBS בתוספת 0.5% מTween 20 ו דגירה עבור שעה 1 ב RT. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב1x PBS והר coverslips על שקופיות זכוכית עם ההרכבה בינונית למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  • 4. דנדריטים השדרה הדמיה

    1. לבצע הדמיה confocal דרך מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal.
    2. בחר נוירונים בריאים עם מורפולוגיה פירמידהND arborization הדנדריטים מלא, ולכמת לפחות 10 נוירונים לכל מצב מניסויים נפרדים. לכמת 60-100 מיקרומטר לדנדריט.
    3. לרכוש תמונות באמצעות שמן 40X NA = 1.3 אובייקטיביים וקו לייזר 488 ננומטר לעירור GFP, עם שיא כוח טיפוסי במדגם רמה סביב 20 μW. גודל פיקסל הגדר סביב 80 ננומטר לטעום כראוי קוצים הדנדריטים.
      הערה: שיחת הניתוח שלאחר מכן לתמונה שברעש אינו מתפשר הפילוח הנכון של דנדריטים וקוצים. עם הגדרות דגימה והכוח במרחב שהוזכרו לעיל, שצפינו כי פיקסל להתעכב זמן של 3.15 מייקרו-שני הוא מספיק כדי לאסוף מספיק פוטונים לבנות תמונה כזו. עבור דגימות עמומות, ניתן לשפר את איכות תמונה על ידי חישוב ממוצע 2 עד 4 סריקות. ייתכן שתהיה צורך הרכישה של כמה אריחי XY כדי לכסות את האזור של עניין, אשר לאחר מכן יש מאוחה לפני העיבוד.
    4. כדי לטעום את כל נוירון הנפח, לרכוש Z-ערימה, עםZ ריווח החל 150 ננומטר ל -300 ננומטר, מניב 20 עד 30 פרוסות Z.
      הערה: הרזולוציה מרחבית הרוחב הושגה עם הגדרות אלה היא 234 ננומטר והרזולוציה הצירית היא 591 ננומטר. הדגימה שנבחרה כאן היא נאותה, אלא כהחלטה הצירית היא גדולה יותר מהגודל הקטן ביותר של עמוד השדרה להיות צילם, הניתוח מעדיף את הקוצים שלהאריך רוחבית מדנדריטים.

    5. 3D כימות של קוצים הדנדריטים

    הערה: בסעיפים הבאים במיוחד לתאר את השימוש בתוכנת Imaris לניתוח. מימושים אלטרנטיביים קיימים, כולל 15 NeuronStudio או Metamorph 8, אשר יכול לספק תוצאות דומות.

    השתמש בהגדרות המפתח הבאות:

    1. כשלב עיבוד מראש, להשתמש בסינון גאוס באמצעות מתקני עיבוד תמונה המוצעים על ידי התוכנה. בצע סינון גאוס באמצעות עיבוד תמונה> Smooדבר> סינון גאוס. הגדר את רוחב המסנן להיות שווה לגודל פיקסל בXY.
    2. לבצע מעקב אוטומטי למחצה של דנדריטים, באמצעות מודול נימת Tracer של התוכנה.
      1. ראשית, להעריך את קוטר דנדריט, על ידי שימוש בכלי המרחק בכרטיסיית Slice של התוכנה.
      2. בכרטיסייה לעלות, לחץ על כלי החוטים. לאיתנות טובה יותר, פרוטוקול זה מסתמך על מעקב חצי אוטומטי; לחץ על יצירה אוטומטית דלג. ממשק מודול עכשיו מראה את כרטיסיית צייר. כאן, בחר AutoPath כשיטה, דנדריט כסוג, וקלט קוטר דנדריט המוערך.
      3. השתמש במצב בחר של המצביע, הופך את הסמן לתיבה. לחץ Shift ימני על נקודת התחלת דנדריט. הערה: התוכנה מבצעת חישובים ראשוניים.
      4. הזז את המצביע לאורך דנדריט. מנקודת ההתחלה (מייצגאד כתחום כחול), קו צהוב מייצג את נתיב דנדריט הסביר ביותר מוצג. לחץ-Shift-שמאל בנקודת סיום דנדריט.
    3. לבצע פילוח קוצים האוטומטי. הערה: הקוצים על דנדריט לייחס נמצאים באופן אוטומטי על ידי ממשק מודול.
      1. בממשק מודול, לחץ על כרטיסיית היצירה. ברשימה שחררה לבנות מחדש, לבחור לבנות מחדש קוטר דנדריט וסמן את תיבת הנתונים שמור. לאחר מכן לחץ על בנה מחדש.
      2. הגדר את הסף, כך שהנפח המפולח תואם את בפועל דנדריט הנפח. כאלגוריתם, בחר הקצרה ביותר מרחק ממרחק מפה. לחץ על הכפתור הבא.
      3. לקבוע את קוטר ראש עמוד השדרה הקטן ואורך המקסימאלי, שוב על ידי שימוש בכלי המרחק בכרטיסיית Slice של התוכנה, ולאחר מכן לחזור לכרטיסייה לעלות ולהזין את הפרמטרים. Fאו בפרוטוקול זה, ערכים סביב 200-300 ננומטר לקוטר מינימאלי ו -4 מיקרומטר לאורך מקסימאלי הם נקודת התחלה טובה. אל תסמן את תיבת סניף שדרות אפשר. לחץ על הכפתור הבא.
      4. התאם את סף זרע נקודות, כך שהנקודות הכחולות מייצגות קוצים למקם את ראשי עמוד השדרה בפועל. לחץ על הכפתור הבא. הערה: חישוב הליבה מתבצע עכשיו ויכול להיות ארוך.
    4. לסווג קוצים ידי מעבר ללשונית כלים של ממשק מודול. לחץ על לסווג קוצים. בממשק המשתמש תתבקש, לוודא שיש ארבע כיתות, שהוגדרו על ידי המורפולוגיה שלהם כדלקמן: סטאבי: אורך <1 מיקרומטר; פטריות: אורך (עמוד השדרה)> 3 ורוחב מקס (ראש)> אומר רוחב (צוואר) x 2; ארוך דק: Mean רוחב ≥ Mean רוחב (צוואר) (ראש); כמו filopodia-: אורך ≤ 4 מיקרומטר (לא ראש).
      הערה: מוממשק Dule מייצר ארבעה חפצי נימה חדשים המכילים את התוצאות של הסיווג.
    5. נתונים סטטיסטיים יצוא: על כל ארבעת ממשקי אובייקט אלה, עבור לכרטיסיית סטטיסטיקה.
      לחץ על כל סטטיסטיקת היצוא לקובץ לחצן.
      הערה: ערכים סטטיסטיים אחרים ניתן לייצא לדנדריטים (. למשל, אורך, שטח, אומר קוטר, עומק סניף, הסתעפות זווית, נפח, וכו '.), ועבור עמוד השדרה (למשל, יושר, אזור של קובץ מצורף, אורך ונפח של מובחן חלקי עמוד השדרה, בקוטר עמוד השדרה, צפיפות, וכו '.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול סטנדרטי לכימות עמוד השדרה של דנדריטים תרבית של תאי עצב פירמידה נגזרים מiPSC. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של התבגרות עמוד השדרה על נוירונים אנושיים והשוואה האפשרית שלה עם ההתבגרות של עמוד השדרה בתרבויות עצביות מכרסם סטנדרטיים, כמו גם in vivo מודלים של בעלי חיים ב.

    איור 1 א מייצג ערכה של השלבים השונים של תרבות המאפשרים הייצור של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה. ייצוג סכמטי כגון מסופק על מנת להבין את קנה המידה העולמית של זמן הייצור של תאי עצב הפירמידה ניחן בקטגוריות שונות של עמוד השדרה טוב יותר. צעדי Reprogrammation, לעומת זאת, נמצאים מחוץ להיקפו של מחקר זה ותוארו במקום אחר 4. יכולים להיות כל הזמן נוירונים בריאים בתרבות עד 65 -. 70 ימי איור 1 מראה את זרימת העבודה של הדמיה וכימות 3D של עמוד השדרה.

    ove_content "> איור 2 א ממחיש את התרבות של תאי עצב האנושיים שכותרתו עם נוגדן אנטי-טובולין בטא שלישי. נתון זה מראה גם את הנטייה של אשכולות תא. איור 2 מציג נוירון פירמידלי כותרת GFP של השכבות בקליפת המוח השטחיות בהודעת בידול 40 ימים אבות מאוחרים של קליפת המוח (LCP).

    איור 2C ואיור 3A להמחיש שחזור 3D של מגזרים של קוצים הדנדריטים בשלבים שונים של התבגרות. ניתוח כמותי של שני פרמטרים שנבחרו (צפיפות עמוד השדרה ועמוד השדרה ראש נפח) מיוצג באיור 3. התוצאות שלנו מצביעות על כך ששני פרמטרים אלה יגדלו במהלך תקופת התרבות כצפוי.

    איור 1
    סקירה כללית באיור 1. (א) ללוח הזמנים של הבדל עצבי erentiation. ייצוג סכמטי זה מתאר את שלושה שלבים של בידול עצבי. הפרוטוקול מותאם et al Boissart. 4. בשלב 1, iPSC אדם נגזרים באבות קליפת המוח מוקדמים (כלומר., תאים מוקדמים נוירו-אפיתל מtelencephalon הגב) ואחריו שינוי לאבות מאוחר קליפת המוח (LCP). LCP מכן מוגבר לבנקאות סלולארי בחנקן נוזלי. בשלב 2, בידול עצבי מושגת תוך שבועיים. שלב 3 מתאים לשמירה על תאי העצב בתרבות לתקופות ארוכות יותר, כדי לעקוב אחרי עמוד השדרה גדלה והתבגרות מתקדמת. בתנאי התרבות, יכולים להישמר נוירונים בריאים עד 65 -. 70 ימי זרימת עבודה (B) של הצעדים השונים להדמיה וכימות 3D של עמוד השדרה. (IF: immunofluorescence). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    ove_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 2
    תאים חיוביים איור טובולין 2. (א) בטא III נחשפו על ידי Immunofluorescence באמצעות אותו הפרוטוקול כפי שתוארו, ונוגדן III טובולין אנטי-ביתא polyclonal שימש בדילול של 1/1000. השלכה הדנדריטים ראשונית ומשנית של ה- GFP (ב) נוירון פירמידלי -labeled תרבית 40 ימי הודעה שלב LCP. בהבלעה, אותו נוירון מיוצג בהגדלה נמוכה עם גוף תא נראית לעין. שחזור 3D (C) משתי קטגוריות של עמוד השדרה בקטע של דנדריט המשני. ברים סולם:. 250 מיקרומטר (), 100 מיקרומטר (ב), 40 מיקרומטר (ב הבלעה), 1.5 מיקרומטר (C) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    class = "jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
    שחזור איור 3. 3D () של קוצים הדנדריטים (צבע כחול) עם מגזרים מאוירים של דנדריטים המשניים (צבע אפור), בשני שלבים שונים תרבות (25 ו -45 ימים שלאחר התמיינות מLCP). (ב) ניתוח כמותי של עמוד השדרה צפיפות ומורפולוגיות עם שני פרמטרים שנבחרו כגון צפיפות עמוד השדרה לאורך דנדריט וראש עמוד השדרה ונפח בשתי תקופות תרבות. תוצאות מוצגות כממוצע ± SEM של לפחות 10 מגזרי נוירון שונים המתקבלים מדנדריטים המשניים צילמו על ידי מיקרוסקופ confocal. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן מאן-וויטני (* p <0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    כימות של תכונות מורפולוגיות של נוירונים פירמידה הסתמכה על התוכנה. ממשק נימת Tracer שימש לפילוח של נוירונים וקוצים, ואת מודול XT שימש לניתוח שלהם.

    כדי לנתח את הדיוק של הטכניקה שלנו, אנחנו בהשוואה ראשונה פרמטרים שנמדדו מורפולוגיים (אורך, שטח, ועמוד השדרה כולל כאשר החלים נפח), עם אלה שפורסמו באמצעות נוירונים פירמידה בוגרים עכברוש בתרבות 6, 7 ורקמות מוח אנושיות 3. הצפיפות היתה דומה בכל המקרים. אין נתונים נפח תוארו בתאי עצב חולדה (2D ניתוח דווח בתוכנה המשמשת את הכותבים) ואילו סך עמוד השדרה נפח מעט הופחת בהשוואה לנתונים שלנו, במחקר של בנאווידס-Piccione 3 באמצעות הפרוטוקול שלהם לשיקום נפח על קוצים שנבחרו. הבדלים כאלה גם יכולים להיות מוסברים על ידי המקור האזורי של תאים וצבע הניאון משמש להםתיוג.

    כמה נקודות קריטיות צריכה להיות בקו תחתון בפרוטוקול שלנו, שמתייחס בעיקר להגדרות סף לאיכות confocal של תמונות וquantifications שלאחר מכן. הצימוד של התמרה של וקטור GFP-lentiviral עם immunofluorescence אנטי-GFP מבטיח תיוג טוב והדמיה של מבני עמוד השדרה כולו. לא הצלחנו לתייג arborization הדנדריטים המלא על ידי transfecting תאים לתכנות מחדש עם וקטורי GFP ועל ידי פרוטוקולים קונבנציונליים. בדרך כלל, 70 - 80% הם transduced תחת תנאי הניסוי שלנו. אחוז כזה הוא הרבה יותר גדול ממה שנצפו באמצעות פרוטוקולי transfection עם פלסמידים GFP (15% מתאי עצב transfected בבדיקות שלנו).

    בהתאם ליעילות והספציפיות של תיוג, סינון או deconvolution גאוס עשוי להיות שימושי כשלב עיבוד מראש כדי להפחית רעש. גם אנחנו בדקנו את שחזור 3D תמונה וכימות לאחר deconvolution. proce זההיה צפוי ss להיות שימושי כי, אפילו עם ההדמיה confocal, deconvolution משמעותית משפרת את איכות תמונה וגבולות טשטוש נגרם משבירה. Deconvolution עם זאת, מציב את מתח גדול על צעד ההדמיה, דגימת הטלת המרחבית קשה בכל שלושת הכיוונים. עם התקנה אופטית שימוש בפרוטוקול זה, גודל פיקסל הרצוי עבור deconvolution הוא סביב 40 ​​ננומטר, בעוד שהצבנו לכ -80 ננומטר לתמונות שהוצגו כאן. נע עד 40 ננומטר היה פי ארבעת זמן הרכישה, ולהפחית את פיקסל תשואת פוטון. בנוסף, תחת תנאי הניסוי, לא חלו שיפור משמעותי בתוצאות הפילוח נצפה בהשוואה לתוצאות, שייתכן שהושגו עם סינון גאוס. הפרוטוקול ולכן מסתמך על צעד שלאחר העיבוד פשוט ורגוע אילוצי דגימת Z במהלך הדמיה. זה בתורו פחת זמן הרכישה והלבנת מדגם.

    מודול נימת Tracer מציע autom מלאפילוח atic. עם זאת בסוג זה של תרבות, הנוירונים הם לעתים קרובות צפופים, לחצות אחד את השני, והם צילמו מרקע חזק. זה משפיע לרעה על הדיוק של פילוח אוטומטי. הפילוח האוטומטי למחצה הוביל לתוצאות חזקות יותר ועיבוד יעיל. זה מורכב של איתור מודרך דנדריטים מהגוף הבסיסי של תא העצב, ואחריו פילוח 3D אוטומטי של עמוד השדרה לאורך הדנדריטים שנבחרו.

    השיטה שלנו יכולה לשמש כדי לבצע הדמיה הזמן לשגות וישירות להקליט התבגרות עמוד השדרה בחיים נוירונים מנוירונים בקליפת המוח חולדה העיקרית, כפי שתואר לעיל 8.

    נוירונים נגזר iPSC אדם משכו את תשומת לבם של המדענים ושם נעשה הניסיונות האחרונים למודל הפרעות התפתחותיות כוללים הפרעות ספקטרום האוטיסטי 9-14. במעגלים בקליפת המוח, קוצים הדנדריטים לשחק תפקיד מרכזי בהקמתה של סינפסות מעוררות, אבלניתוח כמותי תועד היטב בבני אדם עם הפרעות התפתחותיות. במהלך פיתוח ולאורך כל חיים, הצפיפות של עמוד השדרה והמורפולוגיות שלהם הן קריטיות לקישוריות של מעגלים עצביים. בפתולוגיות עם גורמים גנטיים, השימוש בתאי עצב נגזר iPSC מביופסיות מטופל (למשל., Fibroblasts) מאפשר ניתוח התפתחות מעגלים בין נוירונים המבטא את הגן שעבר מוטציה (ים) שיכול להיות אחראי למצבי מחלה. פרוטוקול זה מייצג גישה רבת עוצמה לניתוח נרחב במבחנה של spinogenesis בתוך אוכלוסייה של תאי עצב והשוואה של פנוטיפים עם נוירונים לתכנות מחדש מאנשים שעברו מוטציה שליטה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter