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Developmental Biology

मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न पिरामिड न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के तीन आयामी मात्रा

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

पिरामिड न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान कांटा स्तनधारी मस्तिष्क प्रांतस्था में सबसे उत्तेजक synapses की साइटों रहे हैं। इस विधि को प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न मानव cortical पिरामिड ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स में रीढ़ morphologies की एक 3 डी मात्रात्मक विश्लेषण का वर्णन है।

Abstract

वृक्ष के समान कांटा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उत्तेजक synapses के बाद synaptic डिब्बों के अनुरूप है कि छोटे उभार कर रहे हैं। वे dendrites साथ वितरित कर रहे हैं। उनकी आकृति विज्ञान neuronal गतिविधि पर काफी हद तक निर्भर है, और वे गतिशील हैं। वृक्ष के समान कांटा उनकी सतह पर और पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व के स्तर पर ग्लूटामेटरगिक रिसेप्टर्स (AMPA और NMDA रिसेप्टर्स) व्यक्त करते हैं। प्रत्येक रीढ़ न्यूरॉन स्वतंत्र रूप से अपने राज्य और स्थानीय गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है। रीढ़ morphologies बड़े पैमाने पर इन विवो दृष्टिकोण और कृंतक ऊतकों से प्राप्त neuronal संस्कृतियों दोनों का उपयोग कर, मस्तिष्क प्रांतस्था के ग्लूटामेटरगिक पिरामिड कोशिकाओं में अध्ययन किया गया है। कृंतक सभ्य न्यूरॉन्स और एक आयामी मात्रात्मक विश्लेषण 1 में दिखाया गया है नयूरोपथोलोगिकल की स्थिति, बदल रीढ़ प्रेरण और परिपक्वता से जुड़ा हो सकता है। वर्तमान अध्ययन मानव cortic का उपयोग कर रीढ़ morphologies की 3 डी मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णनतंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (देर से कॉर्टिकल पूर्वज) से व्युत्पन्न अल न्यूरॉन्स। इन कोशिकाओं को शुरू में प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त किया गया। इस प्रोटोकॉल अलग संस्कृति अवधि में रीढ़ morphologies के विश्लेषण की अनुमति देता है, और मानसिक बीमारियों के साथ रोगियों से प्राप्त उन लोगों के साथ नियंत्रण व्यक्तियों से प्राप्त प्रेरित स्टेम कोशिकाओं के बीच संभव तुलना के साथ।

Introduction

कॉर्टिकल पिरामिड न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान कांटा कृंतक, रहनुमा, और मानव मस्तिष्क में इन न्यूरोनल उपप्रकार के बेसल और शिखर dendrites के साथ वितरित कर रहे हैं, जो छोटे और पतले उभार कर रहे हैं। वे सबसे उत्तेजक synapses की साइटों रहे हैं और सीखने और संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण कार्यों प्रदर्शित करते हैं। मानव वृक्ष के समान कांटा की विस्तृत संरचनाओं तकनीकी रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 2 से अध्ययन किया गया है। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण से समय लेने वाली है और भारी काम का बोझ का प्रतिनिधित्व करता है। हाल ही में, वृक्ष के समान कांटा की आकृति विज्ञान की एक तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण बड़े मैनुअल रीढ़ विश्लेषण 3 करने के लिए संयुक्त विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग मानव मस्तिष्क प्रांतस्था में सूचना दी गई है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने के लिए मिलकर हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) तकनीक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रीढ़ की पहचान और आकार माप के लिए एक सटीक उपकरण प्रतिनिधित्व करता है। यह दृष्टिकोण आसानी से सभ्य न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जा सकता है। होवेदेखें, कोई डेटा प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSC) से व्युत्पन्न मानव न्यूरॉन्स पर रीढ़ परिपक्वता और आकृति विज्ञान के विश्लेषण पर सूचना दी गई है।

इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो में सुसंस्कृत मानव न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग की अनुमति देता है जो एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए किया गया था। Imaris सॉफ्टवेयर का रेशा अनुरेखक मॉड्यूल के साथ GFP लेबलिंग, confocal माइक्रोस्कोपी और 3 डी विश्लेषण वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया। द्वितीय तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से चतुर्थ (एनएससी) के लिए परतों के cortical ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं कि संस्कृति कदम भी यहाँ वर्णित संक्षेप में कर रहे हैं। मानव एनएससी उत्पादन के लिए पूरे प्रोटोकॉल पहले से ही कहीं 4 प्रकाशित किया गया है।

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Protocol

1. Neuronal संस्कृति

नोट: स्टेम कोशिकाओं में तंतुकोशिका reprogramming, देर कॉर्टिकल पूर्वज के पृष्ठीय telencephalon वंश, व्युत्पत्ति, प्रवर्धन, और बैंकिंग के लिए प्रतिबद्धता (LCP) Boissart एट अल 4 में वर्णित किया गया। LCP कोशिकाओं की तरह के neuronal भेदभाव भी मामूली संशोधनों के साथ Boissart एट अल 4 के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। अन्य प्रक्रियाओं न्यूरॉन्स में उनके भेदभाव के द्वारा पीछा किया प्रेरित स्टेम कोशिकाओं में fibroblasts की प्रत्यक्ष reprogramming के लिए विकसित किया गया है। यह पिरामिड ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स के चुनिंदा उत्पादन की अनुमति देता है के बाद से इस प्रोटोकॉल को बरकरार रखा था।

  1. पाली ओर्निथिन (DPBS में 1/6 के लिए पतला, शेयर एकाग्रता 0.01%) DPBS में तीन washes के द्वारा पीछा हे / एन, के साथ कांच coverslips के साथ 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों को समझो। तब प्रवाह हुड के तहत कम से कम 10 घंटे के लिए laminin (1 मिलीग्राम / एमएल, DPBS में 500 गुना पतला शेयर एकाग्रता) जोड़ने ।
  2. प्लेट और कम घनत्व पर एनएससी प्रेषण एन 2 पूरक के (50,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) गिलास DMEM / F12 से मिलकर संस्कृति के माध्यम से 3 मिलीग्राम में coverslips (500 मिलीलीटर), 2 शीशियों के साथ 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में (5 मिलीलीटर प्रत्येक), B27 पूरक के 2 शीशियों (10 मिलीलीटर प्रत्येक), पेन स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 मिलीलीटर (पेनिसिलिन = मिलीग्राम और स्ट्रेप्टोमाइसिन = 10,000 इकाइयों / एमएल 10,000 इकाइयों /), 2-mercaptoethanol के 1 मिलीलीटर (स्टॉक समाधान: 50 मिमी) और laminin (1 / 500), विकास कारकों के बिना। महत्वपूर्ण कदम: सेल क्लस्टरिंग कम करने के लिए धीमी गति से घूर्णन आंदोलनों के साथ कोशिकाओं को जोड़कर ध्यान से इस कदम के बाहर ले।
  3. संस्कृति के माध्यम से निकालें। कांच coverslips पर संलग्न न्यूरॉन रखने के लिए और clumping से बचने के लिए ताजा laminin समाधान के 2 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त ताजा N2B27 मध्यम जोड़ें। हर 3 दिन मध्यम बदलें। सूखने से सेल को रोकने के क्रम में ताजा मध्यम जोड़ने से पहले शेष मध्यम (200 μl) के कुछ रखें। वैकल्पिक रूप से, तेजी से आगे बढ़ना है और कुल मात्रा (3 एमएल) बदल जाते हैं।
e_title "> 2। Lentiviral पारगमन

नोट: GFP lentiviral वैक्टर कृपया Institut पाश्चर पर डॉ उवे Maskos प्रयोगशाला (पेरिस) द्वारा प्रदान की और प्रकाशित प्रोटोकॉल 5 के अनुसार तैयार किए गए थे। GFP अभिव्यक्ति माउस phosphoglycerate kinase (PGK) प्रमोटर द्वारा संचालित है। इस अध्ययन के लिए, वायरल अनुमापांक 400 एनजी / μl (पीबीएस 1x में शेयर समाधान) का था।

  1. संस्कृति प्रति GFP lentiviral वेक्टर अच्छी तरह से (6 अच्छी तरह प्लेटें) के 40 एनजी युक्त शेयर समाधान के 1 μl जोड़कर वायरल कणों से परिपक्वता के किसी भी कदम पर मानव IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स transduce और ताजा संस्कृति के माध्यम में 48 घंटे के लिए सेते हैं। नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, ऊष्मायन की अवधि के लिए रीढ़ की हड्डी संरचनाओं का एक अच्छा लेबलिंग की अनुमति देता है।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: पूरे रीढ़ आकृति विज्ञान की लेबलिंग में सुधार करने के लिए, immunofluorescence लेबलिंग permeabilized की स्थिति में एक विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था।

  • आरटी पर 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में coverslips पर transduced कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से निकालें और ठीक है, तो 1x पीबीएस में (10 मिनट प्रत्येक) 3 बार धोएं।
  • पीबीएस में immerge coverslips 0.05% ट्राइटन (100x) और आरटी पर 1 घंटे के लिए 10% घोड़े सीरम के साथ पूरक, तो 1x पीबीएस में 3 बार धोएं।
  • 1x पीबीएस के 100 μl 4% घोड़े सीरम और प्राथमिक एंटीबॉडी (1/1000) GFP के खिलाफ उठाए गए हैं और प्रत्येक coverslip पर 1,000 का एक पहलू से पतला के साथ पूरक जोड़ें। एक अंधेरे बॉक्स हे में सेते / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर, तो 1x पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  • पीबीएस बीच 20 के 0.5% के साथ पूरक में एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित एंटीबॉडी (1/200) पतला और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। फिर 1x पीबीएस में 3 बार धोने और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते मध्यम के साथ कांच स्लाइड पर coverslips माउंट।
  • 4. वृक्ष के समान रीढ़ इमेजिंग

    1. एक confocal लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन के माध्यम से confocal इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
    2. पिरामिड आकृति विज्ञान एक साथ स्वस्थ न्यूरॉन्स का चयन करेंएन डी एक पूर्ण वृक्ष के समान द्रुमायण, और अलग प्रयोगों से शर्त के अनुसार कम से कम 10 न्यूरॉन्स यों। डेन्ड्राइट प्रति 100 माइक्रोन - 60 यों।
    3. 20 μW के आसपास नमूना स्तर पर एक ठेठ सत्ता शिखर के साथ NA उद्देश्य 1.3 = एक 40x तेल और GFP उत्तेजना के लिए एक 488 एनएम लेजर लाइन का उपयोग कर छवियों, मोल। 80 एनएम के आसपास सेट पिक्सेल आकार ठीक से वृक्ष के समान कांटा करने के लिए नमूना।
      नोट: शोर dendrites और कांटा के समुचित विभाजन समझौता नहीं करता है, जिसमें एक छवि के लिए बाद के विश्लेषण के लिए बुलाया गया। जैसा कि ऊपर उल्लेख स्थानिक नमूना और शक्ति सेटिंग्स के साथ, हम 3.15 μs के एक पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय की एक ऐसी छवि का निर्माण करने के लिए पर्याप्त फोटॉनों इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त है कि मनाया। मंद नमूने के लिए, छवि गुणवत्ता 2-4 स्कैन के औसत से सुधार किया जा सकता है। कई XY टाइल्स के अधिग्रहण फिर एक साथ प्रसंस्करण से पहले सिले किया जाना चाहिए जो हित के क्षेत्र को कवर करने की जरूरत हो सकती है।
    4. के साथ, एक Z ढेर अधिग्रहण, पूरे न्यूरॉन मात्रा नमूने के लिएएक जेड 20 से 30 जेड स्लाइस उपज, 150 एनएम से 300 एनएम से लेकर रिक्ति।
      नोट: इन सेटिंग्स के साथ हासिल की पार्श्व स्थानिक संकल्प 234 एनएम है और अक्षीय संकल्प 591 एनएम है। यहां चुना नमूना पर्याप्त है, लेकिन अक्षीय संकल्प imaged किया जा कांटा के सबसे छोटे आकार से बड़ा है, के रूप में विश्लेषण डेन्ड्राइट से laterally विस्तार है कि कांटा पक्ष में है।

    वृक्ष के समान spines 5. 3 डी की मात्रा

    नोट: निम्न वर्गों विशेष रूप से विश्लेषण के लिए Imaris सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन। वैकल्पिक कार्यान्वयन इसी तरह के परिणाम प्रदान कर सकते हैं जो NeuronStudio 15 या Metamorph 8, सहित मौजूद हैं।

    निम्न कुंजी सेटिंग्स का उपयोग करें:

    1. एक पूर्व प्रसंस्करण मंच के रूप में, सॉफ्टवेयर द्वारा की पेशकश की छवि प्रसंस्करण सुविधाओं के माध्यम से गाऊसी छानने का उपयोग करें। इमेज प्रोसेसिंग> Smoo के माध्यम से गाऊसी छानने प्रदर्शन करनाबात> गाऊसी फिल्टर। XY में पिक्सेल आकार के बराबर होने फिल्टर चौड़ाई सेट करें।
    2. सॉफ्टवेयर का रेशा अनुरेखक मॉड्यूल का उपयोग कर, dendrites के एक अर्द्ध स्वचालित ट्रेसिंग प्रदर्शन करते हैं।
      1. पहला, सॉफ्टवेयर की स्लाइस टैब में दूरी उपकरण का उपयोग करके, डेन्ड्राइट व्यास का अनुमान है।
      2. पार टैब में, फिलामेंट्स उपकरण पर क्लिक करें। एक बेहतर मजबूती के लिए, इस प्रोटोकॉल अर्द्ध स्वचालित ट्रैकिंग पर निर्भर करता है; स्किप स्वत: निर्माण पर क्लिक करें। मॉड्यूल इंटरफ़ेस अब ड्रा टैब दिखा रहा है। इधर, एक विधि, एक प्रकार के रूप में डेन्ड्राइट, और इनपुट का अनुमान डेन्ड्राइट व्यास के रूप में AutoPath का चयन करें।
      3. एक बॉक्स में कर्सर मोड़, सूचक का चयन मोड का उपयोग करें। डेन्ड्राइट प्रारंभिक बिंदु पर शिफ्ट-राइट क्लिक करें। नोट: सॉफ्टवेयर प्रारंभिक गणना करता है।
      4. डेन्ड्राइट साथ सूचक ले जाएँ। शुरुआती बिंदु से (प्रतिनिधित्वएक नीले क्षेत्र के रूप में ईडी), सबसे अधिक संभावना डेन्ड्राइट पथ का प्रतिनिधित्व एक पीले रंग की लाइन में दिखाया गया है। डेन्ड्राइट समापन बिंदु पर शिफ्ट-बाएँ क्लिक करें।
    3. स्वचालित कांटा विभाजन प्रदर्शन करते हैं। नोट: पता लगाया डेन्ड्राइट पर कांटा मॉड्यूल इंटरफेस द्वारा स्वचालित रूप से पाया जा रहे हैं।
      1. मॉड्यूल इंटरफ़ेस में, निर्माण टैब पर क्लिक करें। के पुनर्निर्माण बूंद-सूची में, डेन्ड्राइट व्यास के पुनर्निर्माण लेने और रखने के डेटा बॉक्स की जाँच करें। तब के पुनर्निर्माण पर क्लिक करें।
      2. खंडों मात्रा वास्तविक डेन्ड्राइट मात्रा से मेल खाती है, ताकि सीमा निर्धारित। एक एल्गोरिथ्म के रूप में,। दूरी मानचित्र से कम से कम दूरी का चयन करें अगला बटन पर क्लिक करें।
      3. छोटी से छोटी रीढ़ सिर व्यास और अधिकतम लम्बाई निर्धारित करते हैं, फिर सॉफ्टवेयर की स्लाइस टैब में दूरी उपकरण का उपयोग करके, फिर वापस पार टैब के लिए आते हैं और मानक दर्ज करें। एफया इस प्रोटोकॉल, 200 के आसपास मूल्यों - कम से कम व्यास के लिए 300 एनएम और अधिक से अधिक लंबाई के लिए 4 माइक्रोन अच्छा प्रारंभिक बिंदु होते हैं। अनुमति दें शाखा कांटा बॉक्स की जांच नहीं करते। अगला बटन पर क्लिक करें।
      4. कांटा का प्रतिनिधित्व नीले अंक वास्तविक रीढ़ सिर को स्थानीय बनाना है, ताकि बीज अंक दहलीज को समायोजित करें। अगला बटन पर क्लिक करें। नोट: कोर गणना अब किया जाता है और लंबा हो सकता है।
    4. मॉड्यूल इंटरफेस के उपकरण टैब पर जाकर कांटा वर्गीकृत। वर्गीकृत कांटा पर क्लिक करें। के लिए प्रेरित यूजर इंटरफेस में, के रूप में उनके आकृति विज्ञान द्वारा परिभाषित चार वर्गों, देखते हैं कि सुनिश्चित करें: ठूंठदार: लंबाई <1 माइक्रोन; मशरूम: लंबाई (रीढ़ की हड्डी)> 3 और अधिकतम चौड़ाई (सिर)> चौड़ाई (गर्दन) 2 एक्स मतलब है; लंबे पतले: मीन चौड़ाई (सिर) ≥ मतलब चौड़ाई (गर्दन); Filopodia की तरह: लंबाई ≤ 4 माइक्रोन (कोई सिर)।
      नोट: मोDule इंटरफेस वर्गीकरण के परिणामों से युक्त चार नए रेशा वस्तुओं उत्पन्न करता है।
    5. निर्यात सांख्यिकीय डेटा: इन चार वस्तु इंटरफेस में से किसी पर, सांख्यिकी टैब पर जाएँ।
      बटन फाइल में निर्यात सभी सांख्यिकी पर क्लिक करें।
      नोट: अन्य सांख्यिकीय मूल्यों डेन्ड्राइट के लिए निर्यात किया जा सकता है (।। जैसे, लंबाई, क्षेत्र, आदि व्यास, शाखा गहराई, शाखाओं में बंटी कोण, मात्रा, मतलब है), और कांटा (उदाहरण के लिए, सीधा, लगाव, लंबाई और अलग की मात्रा का क्षेत्र रीढ़ की हड्डी के कुछ हिस्सों, रीढ़ की हड्डी व्यास, घनत्व, आदि।)

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    Representative Results

    वर्तमान अध्ययन IPSC से निकाली गई पिरामिड न्यूरॉन्स की सुसंस्कृत dendrites की रीढ़ मात्रा का ठहराव के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल रीढ़ मानव न्यूरॉन्स पर परिपक्वता और मानक कृंतक neuronal संस्कृतियों में कांटा की परिपक्वता के साथ ही में इन विवो पशु मॉडलों के साथ अपनी संभव तुलना के विश्लेषण की अनुमति देता है।

    चित्रा 1 ए कॉर्टिकल पिरामिड न्यूरॉन्स के उत्पादन की अनुमति है जो संस्कृति के विभिन्न चरणों की एक योजना का प्रतिनिधित्व करता है। इस तरह योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बेहतर कांटा की विभिन्न श्रेणियों के साथ संपन्न पिरामिड न्यूरॉन्स के उत्पादन का वैश्विक समय स्केलिंग को समझने के क्रम में प्रदान की जाती है। Reprogrammation कदम है, हालांकि, इस अध्ययन के दायरे से बाहर हैं और कहीं और 4 में वर्णित किया गया है। स्वस्थ न्यूरॉन्स 65 अप करने के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है -। 70 दिन चित्रा 1 बी इमेजिंग और कांटा के 3 डी मात्रा का ठहराव के कार्यप्रवाह दिखा।

    "ove_content> चित्रा 2A एक विरोधी बीटा III ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ लेबल मानव न्यूरॉन्स की संस्कृति को दिखाता है। यह आंकड़ा भी सेल क्लस्टरिंग की प्रवृत्ति से पता चलता है। चित्रा 2 बी 40 दिनों के बाद भेदभाव पर सतही cortical परतों की एक GFP लेबल पिरामिड न्यूरॉन से पता चलता है की देर कॉर्टिकल पूर्वज (LCP)।

    चित्रा -2 सी और चित्रा 3 परिपक्वता के विभिन्न चरणों में वृक्ष के समान कांटा के क्षेत्रों के 3D पुनर्निर्माण वर्णन। दो चयनित मानकों (रीढ़ की हड्डी घनत्व और रीढ़ की हड्डी के सिर मात्रा) के मात्रात्मक विश्लेषण चित्रा 3 बी में प्रतिनिधित्व किया है। हमारे परिणाम की उम्मीद के रूप में इन दो मापदंडों संस्कृति की अवधि में वृद्धि हुई है कि संकेत मिलता है।

    चित्र 1
    न्यूरोनल रचनाकार की समयमान वेतनमान की चित्रा 1 (ए) अवलोकन erentiation। यह योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व neuronal भेदभाव के तीन चरणों का वर्णन है। प्रोटोकॉल Boissart एट अल। 4 से अनुकूलित है। चरण 1 में, मानव IPSC जल्दी cortical पूर्वज में प्राप्त कर रहे हैं (यानी।, पृष्ठीय telencephalon से जल्दी न्यूरो उपकला कोशिकाओं) देर कॉर्टिकल पूर्वज (LCP) करने के लिए परिवर्तन द्वारा पीछा किया। LCP फिर तरल नाइट्रोजन में सेल बैंकिंग के लिए परिलक्षित कर रहे हैं। चरण 2 में, तंत्रिका भेदभाव दो सप्ताह के भीतर हासिल की है। चरण 3 से बढ़ रीढ़ की हड्डी और प्रगतिशील परिपक्वता का पालन करने के क्रम में, लंबी अवधि के लिए संस्कृति में न्यूरॉन्स को बनाए रखने के लिए मेल खाती है। । संस्कृति शर्तों के तहत, स्वस्थ न्यूरॉन्स 65 तक रखा जा सकता है - 70 दिन इमेजिंग और कांटा के 3 डी मात्रा का ठहराव के लिए अलग-अलग चरणों में से (बी) कार्यप्रवाह। (यदि: इम्यूनोफ्लोरेसेंस)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    ove_content "के लिए: रख-together.within-पेज =" हमेशा "> चित्र 2
    वर्णित के रूप में चित्रा 2 (ए) बीटा III ट्यूबिलिन सकारात्मक कोशिकाओं को एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पता चला है, और एक पॉलीक्लोनल विरोधी बीटा III ट्यूबिलिन एंटीबॉडी 1/1000 के कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया। (बी) के एक GFP के प्राथमिक और माध्यमिक वृक्ष के समान उपशाखा -labeled पिरामिड न्यूरॉन 40 दिनों LCP चरण पोस्ट सुसंस्कृत। इनसेट में, एक ही न्यूरॉन स्पष्ट सेल शरीर के साथ एक कम बढ़ाई प्रतिनिधित्व किया है। कांटा की दो श्रेणियों में से (सी) 3 डी पुनर्निर्माण एक माध्यमिक डेन्ड्राइट के एक खंड पर। स्केल सलाखों:। 250 माइक्रोन (ए), 100 माइक्रोन (बी), 40 माइक्रोन (बी इनसेट), 1.5 माइक्रोन (सी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


    दो अलग-अलग संस्कृति चरणों (25 और 45 दिनों के LCP से पोस्ट-भेदभाव) पर माध्यमिक डेन्ड्राइट (ग्रे रंग), का सचित्र क्षेत्रों के साथ वृक्ष के समान कांटा (नीला रंग) की चित्रा 3 (ए) 3 डी पुनर्निर्माण। (बी) के लिए रीढ़ की हड्डी के मात्रात्मक विश्लेषण ऐसे डेन्ड्राइट और रीढ़ की हड्डी सिर मात्रा के साथ रीढ़ की हड्डी घनत्व के रूप में और दो संस्कृति अवधि में दो चयनित मानकों के साथ घनत्व और morphologies। परिणाम ± SEM के confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged माध्यमिक डेन्ड्राइट से प्राप्त कम से कम 10 अलग न्यूरॉन क्षेत्रों के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण एक मान व्हिटनी परीक्षण (* पी <0.05) का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    पिरामिड न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान की मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर पर भरोसा किया। रेशा अनुरेखक इंटरफेस न्यूरॉन्स और कांटा के विभाजन के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक्सटी मॉड्यूल उनके विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था।

    हमारी तकनीक की सटीकता का विश्लेषण करने के लिए, हम पहले संस्कृति 6, 7 और मानव मस्तिष्क के ऊतकों 3 में चूहे परिपक्व पिरामिड न्यूरॉन्स का उपयोग कर प्रकाशित उन के साथ मापा शब्द के भागों मानकों (लंबाई, क्षेत्र, और कुल रीढ़ मात्रा जब लागू हो), की तुलना में। घनत्व सभी मामलों में बराबर थे। कोई मात्रा डेटा मात्रा पुनर्निर्माण के लिए अपने स्वयं के प्रोटोकॉल का उपयोग Benavides-Piccione 3 के अध्ययन में, थोड़ा हमारे डेटा की तुलना में कम हो गया था कुल रीढ़ मात्रा जबकि (एक 2 डी विश्लेषण लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ सूचित किया गया था) चूहा न्यूरॉन्स में वर्णित किया गया चयनित कांटा पर। इस तरह के मतभेद के लिए भी इस्तेमाल किया कोशिकाओं के क्षेत्रीय मूल और फ्लोरोसेंट डाई से समझाया जा सकता है उनकेलेबलिंग।

    कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं मुख्य रूप से छवियों और बाद quantifications के confocal गुणवत्ता के लिए सीमा परिभाषाएँ करने का उल्लेख है, जो हमारे प्रोटोकॉल में रेखांकित किया जाना चाहिए। विरोधी GFP इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ एक GFP-lentiviral वेक्टर के पारगमन की युग्मन पूरे रीढ़ की हड्डी संरचनाओं का एक अच्छा लेबलिंग और दृश्य को सुनिश्चित करता है। हम GFP वैक्टर के साथ reprogrammed कोशिकाओं transfecting द्वारा और पारंपरिक प्रोटोकॉल द्वारा पूर्ण वृक्ष के समान द्रुमायण लेबल करने में सक्षम नहीं थे। आमतौर पर, 70 - 80% हमारे प्रयोगात्मक परिस्थितियों में transduced कर रहे हैं। ऐसी प्रतिशत हम अभिकर्मक GFP plasmids के साथ प्रोटोकॉल (हमारे परीक्षणों में ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स की 15%) का उपयोग कर मनाया मुकाबले काफी अधिक है।

    एक पूर्व प्रसंस्करण चरण शोर कम करने के रूप में दक्षता और लेबलिंग की विशिष्टता पर निर्भर करता है, गाऊसी छानने या deconvolution के लिए उपयोगी हो सकता है। हम यह भी deconvolution के बाद 3 डी छवि पुनर्निर्माण और मात्रा का ठहराव का परीक्षण किया। इस प्रक्रियाएसएस भी confocal इमेजिंग के साथ, deconvolution काफी छवि गुणवत्ता में सुधार और सीमा विवर्तन की वजह से धुंधला, क्योंकि उपयोगी होने की उम्मीद थी। Deconvolution हालांकि, सभी तीन दिशाओं में कठोर स्थानिक नमूना लगाने, इमेजिंग कदम पर एक बड़ा दबाव डालता है। हम यहाँ प्रस्तुत छवियों के लिए लगभग 80 एनएम के लिए निर्धारित है, जबकि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल ऑप्टिकल सेटअप के साथ, deconvolution के लिए वांछित पिक्सेल आकार, लगभग 40 समुद्री मील दूर है। 40 एनएम के लिए चल रहा अधिग्रहण समय चौगुनी, और फोटोन उपज पिक्सेल कम होगा। इसके अलावा, प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, विभाजन के परिणाम में कोई उल्लेखनीय सुधार गाऊसी छानने के साथ प्राप्त किया गया हो सकता है जो परिणामों की तुलना के रूप में मनाया गया था। प्रोटोकॉल इसलिए इस सरल बाद के प्रसंस्करण के कदम पर निर्भर करता है और इमेजिंग के दौरान जेड नमूने की कमी आराम। यह बदले में अधिग्रहण के समय और नमूना विरंजन कम हो गई।

    रेशा अनुरेखक मॉड्यूल एक पूरी तरह से autom प्रदान करता हैatic विभाजन। हालांकि संस्कृति के इस प्रकार में, न्यूरॉन्स, अक्सर घने हैं एक दूसरे को पार, और एक मजबूत पृष्ठभूमि से imaged हैं। इस पर प्रतिकूल स्वचालित विभाजन की सटीकता को प्रभावित करता है। अर्द्ध स्वचालित विभाजन और अधिक मजबूत परिणाम और कुशल प्रसंस्करण के लिए नेतृत्व किया। यह चयनित dendrites साथ कांटा के एक स्वत: 3 डी विभाजन के द्वारा पीछा न्यूरॉन के बेसल शरीर से dendrites के एक निर्देशित ट्रेसिंग के होते हैं।

    पहले 8 वर्णित के रूप में हमारे विधि, समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन और सीधे प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स से न्यूरॉन्स जीने में रीढ़ की हड्डी परिपक्वता रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    मानव IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स वैज्ञानिकों का ध्यान आकृष्ट किया है और आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों 9-14 सहित neurodevelopmental विकारों मॉडल करने के लिए हाल के प्रयास किए गए हैं। Cortical सर्किट में, वृक्ष के समान कांटा उत्तेजक synapses की स्थापना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन उनकीमात्रात्मक विश्लेषण खराब neurodevelopmental विकार के साथ मानव में दर्ज किया गया है। विकास और जीवन भर के दौरान, कांटा के घनत्व और उनके morphologies neuronal सर्किट की कनेक्टिविटी के लिए महत्वपूर्ण हैं। आनुवंशिक कारणों के साथ विकृतियों में, रोगी बायोप्सी से IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (उदाहरण के लिए।, Fibroblasts) के उपयोग के रोग राज्यों के लिए जिम्मेदार हो सकता है कि उत्परिवर्तित जीन (एस) व्यक्त न्यूरॉन्स के बीच सर्किट के विकास के विश्लेषण की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल उत्परिवर्तित न्यूरॉन्स और नियंत्रण व्यक्तियों से reprogrammed न्यूरॉन्स के साथ phenotypes के तुलना की आबादी के भीतर spinogenesis की इन विट्रो विश्लेषण में व्यापक के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

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    References

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    मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न पिरामिड न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के तीन आयामी मात्रा
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    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

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