Summary
錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。
Abstract
樹状突起棘は、中枢神経系の興奮性シナプスのシナプス後の区画に対応して小さな突起があります。これらは、樹状突起に沿って分布しています。その形態は、神経活動に大きく依存している、と彼らは動的です。樹状突起棘は、その表面上およびシナプス後密度のレベルでグルタミン酸受容体（AMPAおよびNMDA受容体）を発現します。各脊椎は、ニューロンが独立して、その状態や地域活性を制御することができます。脊椎形態は広範囲のin vivoアプローチやげっ歯類組織より得られた神経細胞培養の両方を使用して、脳皮質のグルタミン酸作動錐体細胞で研究されています。齧歯類培養ニューロンと一次元の定量分析1に示すように、神経病理学的条件は、変更された脊椎誘導および成熟に関連することができます。本研究は、人間corticを使用して、脊椎の形態の3次元定量分析のためのプロトコルについて説明しアルニューロンは、神経幹細胞（後期皮質前駆細胞）に由来します。これらの細胞は、最初に誘導された多能性幹細胞から得ました。このプロトコルは、異なる培養期間での脊椎形態の分析を可能にし、精神疾患を有する患者から得られたものと対照個体から得られた人工多能性幹細胞との間の比較可能性を有します。
Introduction
皮質錐体ニューロンの樹状突起棘は、げっ歯類、霊長類、およびヒトの脳におけるこれらのニューロンのサブタイプの基礎と先端樹状突起に沿って分布している小型・薄型の突起があります。彼らは、ほとんどの興奮性シナプスのサイトであり、学習や認知過程における重要な機能を表示します。ヒト樹状突起棘の詳細な構造は、技術的には、電子顕微鏡2によって研究されています。しかし、このようなアプローチは、時間がかかり、重いワークロードを表します。より最近では、樹状突起棘の形態の三次元（3D）再構成は、大きな手動脊椎分析3に合わせた特定のソフトウェアを使用してヒト脳皮質において報告されています。
免疫蛍光に結合された緑色蛍光タンパク質（GFP）技術は、蛍光顕微鏡によって脊椎の識別および形状測定のための正確なツールを表します。このアプローチは、容易に培養されたニューロンに適用することができます。ハウ版、データは人工多能性幹細胞（iPS細胞）由来のヒト神経細胞のスパインの成熟と形態の分析に報告されていません。
本研究の目的は 、in vitroで培養したヒトの神経細胞からの樹状突起棘のイメージングを可能にするプロトコルを記述するためでした。 IMARISソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールとGFP標識、共焦点顕微鏡および三次元解析は、本プロトコールに使用しました。神経幹細胞（NSC）からIVへの層IIの皮質グルタミン酸作動性ニューロンを得るために必要な培養ステップはまた、ここで簡単に説明されています。人間NSCの生産のためのプロトコル全体は、すでに他の場所で4公開されています。
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Protocol
1.神経文化
注：線維芽細胞の多能性幹細胞におけるリプログラミング、背側終脳の系統へのコミットメント、導出、増幅、及び後期皮質前駆細胞（LCP）の銀行がBoissart ら 4で説明しました。 LCP様細胞の神経分化はまた、わずかな修正を加えたBoissart ら 4に従って行きました。他の手順は、ニューロンへの分化に続いて誘導多能性幹細胞への線維芽細胞の直接再プログラミングのために開発されています。それはピラミッド型グルタミン酸作動性ニューロンの選択的な製造を可能にするため、このプロトコルを保持しました。
- ポリオルニチン（DPBSで1/6に希釈し、原液濃度0.01％）、DPBSで3回洗浄し、O / Nでカバーガラスを6ウェル培養プレートを扱います。その後流フードの下で少なくとも10時間（ストック濃度1mg / mlの、DPBS中で500倍に希釈）ラミニンを追加 。
- DMEM / F12からなる培地3mlの（500 ml）を、N2サプリメントの2バイアル（各5ml）中のガラスカバースリップで6ウェル培養プレート（50,000細胞/ cm 2）低密度でNSCをプレートし、派遣、 B27サプリメントの2バイアル（各10ml）、ペン - ストレプトマイシン（ペニシリン= mlおよびストレプトマイシン= 10,000単位/ mlの10,000単位/）、2-メルカプトエタノール（ストック液：50 mM）の1mlを10ミリリットルとラミニン（1 / 500）、成長因子を含みません。重要なステップ：細胞クラスタリングを減少させるためにゆっくり回転運動を細胞に添加することによって慎重にこの工程を行います。
- 培地を除去します。カバーガラスに付着した神経細胞を維持し、凝集を回避するために、新鮮なラミニン溶液を2μg/ mlを含む新鮮なN2B27培地を追加します。 3日ごとに培地を変更します。乾燥から細胞を防ぐために、新鮮な培地を添加する前に、残りの培地（200μL）の一部を保管してください。また、急速に進行し、全体積（3ml）に変更します。
注意：GFPレンチウイルスベクターは、親切にパスツール研究所（パリ）で博士ウーヴェMaskos研究所によって提供され、公表されたプロトコール5に従って調製しました。 GFP発現は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターにより駆動されます。この研究では、ウイルス力価は、400 ngの/μL（PBS 1Xで原液）でした。
- 文化ごとのGFPレンチウイルスベクターウェル（6ウェルプレート）の40 ngのを含むストック溶液1μlを追加することにより、ウイルス粒子による成熟のいずれかの段階で人間のiPS細胞由来の神経細胞を形質導入し、新鮮な培養培地中で48時間インキュベートします。注：このプロトコルでは、インキュベーションの期間は、脊椎構造の良好なラベル付けを可能にします。
3.免疫蛍光
注：全脊椎の形態の標識化を改善するために、免疫蛍光標識は、透過処理条件下で、抗GFP抗体を用いて行きました。
4.樹状突起棘イメージング
- 共焦点レーザー走査顕微鏡で共焦点イメージングを実行します。
- ピラミッド型の形態Aとの健全なニューロンを選択NDフル樹状樹枝状分岐し、別々の実験からの条件当たり少なくとも10のニューロンを定量化します。デンドライトあたり100ミクロン - 60を定量化します。
- 目的とGFPの励起のための488nmレーザーライン、20μWの周りのサンプルレベルでの典型的なピークパワーで40X油NA = 1.3を使用して画像を取得します。 80nmの周りにピクセルサイズが適切に樹状突起棘をサンプリングします。
注意：ノイズは樹状突起と棘の適切なセグメント化を妥協しないで画像の後続の解析コールを。前述の空間サンプリングおよび電力設定では、我々は3.15マイクロ秒の画素滞留時間は、そのようなイメージを構築するのに十分な光子を収集するのに十分であることを観察しました。薄暗いサンプルについては、画質が2〜4のスキャンを平均することによって改善することができます。いくつかのXYタイルの獲得は、処理の前に縫合しなければならない関心領域をカバーするために必要とされ得ます。 - に、Zスタックを取得し、全ニューロンの量を試料にZは20〜30のZスライスを得、150ナノメートルから300ナノメートルの範囲でスペーシング。
注：これらの設定で達成横方向の空間分解能は234 nmであると軸方向分解能は591 nmです。ここで選択されたサンプリングは十分であるが、軸方向の解像度が画像化される脊柱の最小サイズよりも大きいように、分析は、樹状突起から側方に延びて棘を好みます。
樹状突起棘の5 3D定量
注：以下のセクションでは、具体的には、分析のためのIMARISソフトウェアの使用を記載しています。代替の実装では、同様の結果を提供することができますNeuronStudio 15またはをMetamorph 8、を含む、存在します。
次のキー設定を使用します。
- 前処理段階として、ソフトウェアが提供する画像処理施設を通じてガウスフィルタを使用。 画像処理> Smoo経由でガウスフィルタ処理を実行します事>ガウスフィルタ。 X-Yの画素サイズに等しくなるように、フィルタの幅を設定します。
- ソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールを使用して、樹状突起の半自動トレースを実行します。
- まず、ソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用することにより、樹状突起の直径を推定します。
- サーパスタブで、 フィラメントのツールをクリックしてください。優れた堅牢性のために、このプロトコルは、半自動追跡に依存しています。 スキップ自動作成をクリックしてください。モジュールインターフェイスは現在、 描画]タブを示しています。ここでは、タイプ、および入力の方法、 デンドライトと推定デンドライト直径てAutoPathを選択します。
- ボックスにカーソルを回し、ポインタの選択モードを使用します。樹状突起の出発点に、Shiftキーを押しながら右クリックします。注：このソフトウェアは、最初の計算を実行します。
- 樹状突起に沿ってポインタを移動します。出発点から（表します青い球のようにED）、最も可能性の高い樹状突起のパスを表す黄色の線が示されています。樹状突起のエンドポイントで、Shiftキーを押しながら左クリックします。
- 自動化された棘のセグメンテーションを行います。注：トレース樹状突起上の棘は、モジュールインタフェースによって自動的に発見されることになります。
- モジュールインターフェイスでは、 作成タブをクリックします。 リビルドドロップダウンリストでは、 デンドライトの直径を再構築し、キープデータ ]チェックボックスをオンに選びます。 [再構築]をクリックします。
- セグメント化されたボリュームは実際の樹状突起のボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして 、 距離マップからの最短距離を選択します。[次へ]ボタンをクリックします。
- 最小の背骨の頭の直径と最大長を決定し、再びソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用して、その後突破タブに戻ってくるとパラメータを入力します。 Fあるいはこのプロトコルは、200の周り値 - 最小の直径が300nmであり、最大長さ4μmのは良い出発点です。 許可支店棘ボックスをチェックしないでください。 [次へ]ボタンをクリックします。
- 棘を表す青色の点は、実際の背骨の頭に局在するように、 シード点のしきい値を調整します。 [次へ]ボタンをクリックします。注：コアの計算は、現在行われていると長くなる可能性があります。
- モジュールインターフェイスの[ツール]タブに移動して、棘を分類します。 分類棘をクリックします。プロンプトが表示され、ユーザインタフェースでは、次のようにその形態によって定義された4つのクラスが存在することを確認してください：スタビー：長さ<1μmで、キノコ：長さ（背骨）> 3、最大幅（ヘッド）>（首）の幅を意味する×2。ロング薄い：平均幅（ヘッド）≥平均幅（首）;糸状仮足のような：長さ≤4ミクロン（無頭）。
注：MOduleインターフェースは、分類の結果を含む4新しいフィラメントのオブジェクトを生成します。 - エクスポート統計データ：これらの4オブジェクトインタフェースのいずれかで、[統計]タブに移動します。
ボタンをファイルにエクスポートすべての統計情報をクリックします。
注意：他の統計値は、樹状突起のためにエクスポートすることができます（ 例えば 、長さ、面積、角度、ボリュームを分岐、直径、枝の深さを意味する、 など 。）、および棘のために（明確なの例えば、真直度、添付ファイルの面積、長さとボリューム脊椎部、脊椎直径、密度、 など 。）
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Representative Results
本研究は、iPS細胞由来錐体ニューロンの培養樹状突起のスパイン・定量化のための標準化されたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、脊椎の人間の神経細胞の成熟と標準的なげっ歯類の神経細胞培養におけるスパインの成熟などにおける in vivo動物モデルとの比較可能性の分析を可能にします。
図1Aは、皮質錐体ニューロンの生成を可能にする培養物の種々のステップの概要を表します。このような略図をより良く棘の異なるカテゴリに恵まれ錐体ニューロンの生成のグローバルタイムスケーリングを理解するために提供されます。 Reprogrammation工程は、しかしながら、本研究の範囲外であり、他の場所4に記載されています。健康なニューロンは、65までの培養中に保持することができる- 。70日図1Bは、イメージングおよび棘の3D定量のワークフローを示しています。
「ove_content> 図2Aは、抗ベータIIIチューブリン抗体で標識ヒトニューロンの文化を示している。この図はまた、細胞クラスタリングの傾向を示している。 図2Bは、40日後の分化における表在皮質層のGFP標識錐体ニューロンを示しています後期皮質前駆細胞（LCP）。図2Cおよび図3Aは、成熟の異なる段階で樹状突起棘のセグメントの3D再構成を説明します。 2つの選択されたパラメータ（脊椎密度および脊椎ヘッド体積）の定量分析を 、図3Bに示されています。我々の結果は、予想されるように、これらの2つのパラメータは、培養期間にわたって増加することを示します。
神経差分の時間スケールの図1（A）の概要 erentiation。この略図は、神経分化の3つの手順を説明します。プロトコルはBoissart ら 4から適合されます。ステップ1において、ヒトiPS細胞が初期の皮質前駆細胞で導出されている（ すなわち、背側終脳からの早期神経上皮細胞）は、後期皮質前駆細胞（LCP）への変換が続きます。 LCPは、その後、液体窒素中で細胞バンクのために増幅されます。ステップ2では、神経分化は、2週間以内に達成されます。ステップ3は、成長脊椎および進行成熟に追従するために、長期間の培養中のニューロンの維持に相当します。培養条件の下では、健康的なニューロンは、65の状態に維持することができます- 。70日イメージングと棘の3Dの定量化のための異なる工程の（B）のワークフロー。 （IF：免疫蛍光）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2記載されたのと同じプロトコルを用いて免疫することによって明らかにした（A）ベータIIIチューブリン陽性細胞を、1/1000希釈で使用し、ポリクローナル抗ベータIIIチューブリン抗体（B）一次およびGFPの二次樹状分岐標識錐体ニューロンは、40日後のLCP段階を培養しました。挿入図では、同じニューロンは、見かけ上の細胞体と低倍率で表現されている。二次デンドライトのセグメント上の棘の2つのカテゴリ（C）3D再構成。スケールバー：250μmの（A）、100ミクロン（B）、40ミクロン（Bの挿入図）、1.5ミクロン（C） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
背骨の図3.二つの異なる文化の段階で二次デンドライト（グレー色）の図示されたセグメントを持つ樹状突起棘（青色）の（A）は、3D再構成、（25、45日、LCPから分化後）。（B）定量分析このような樹状突起と棘ヘッド体積に沿って2つの培養期間での脊椎密度として選択した2つのパラメータを持つ密度および形態。結果は、共焦点顕微鏡により撮像された二次デンドライトから得られる少なくとも10の異なるニューロン・セグメントの平均±SEMとして提示されています。統計解析は、マンホイットニー検定（* P <0.05）を用いて行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
錐体ニューロンの形態学的特徴の定量化は、ソフトウェアに依存していました。フィラメントトレーサーインタフェースはニューロンおよび棘の分割のために使用し、XTモジュールは、それらの分析に使用しました。
私たちの技術の精度を分析するには、まず文化6、7、ヒト脳組織3ラット成熟錐体ニューロンを使用して発行されていると測定された形態学的パラメータ（長さ、面積、および全脊椎ボリューム該当）を、比較しました。密度は、全ての場合において同等でした。総脊椎ボリュームが少し私たちのデータと比較して減少したのに対しませボリュームデータは、ボリュームの再構築のために独自のプロトコルを使用してベナビデス-Piccione 3の研究では、（2次元解析は著者によって使用されるソフトウェアで報告された）ラットの神経細胞に記載されませんでした選択された棘上。このような差異は、細胞の地域の起源とそのために使用される蛍光色素によって説明することができますラベリング。
いくつかの重要なポイントは、主に画像やその後の定量化の共焦点品質のしきい値の定義を参照してください私たちのプロトコル、下線されるべきです。抗GFP免疫蛍光とGFP-レンチウイルスベクターの形質導入のカップリングは、全体の背骨構造の良好な標識および可視化を実現します。我々は、GFPベクターでの再プログラミングされた細胞をトランスフェクションすることにより、通常のプロトコルによって完全樹状樹枝状分岐をラベルすることができませんでした。一般的に、百分の70から80は、当社の実験条件下で形質導入されています。このような割合は、我々は、GFPプラスミド（我々のテストでトランスフェクトされたニューロンの15％）でのトランスフェクションプロトコールを用いて観察されたものよりもはるかに大きいです。
標識、ガウシアンフィルタリングまたはデコンボリューションの効率および特異性に応じてノイズを低減する前処理段階として有用であり得ます。また、デコンボリューション後の3次元画像再構成および定量をテストしました。このproceSSがあっても、共焦点イメージングを用いて、デコンボリューションが著しく画質や回折によって引き起こされるぼけの限界を改善する、ために有用であると予想されました。デコンボリューションは、しかし、すべての3つの方向に過酷な空間サンプリングを課すと、撮像ステップに大きな負担をかけます。我々はここに提示される画像のための約80nmに設定しながら、このプロトコルで使用される光学セットアップを、デコンボリューションのための所望の画素サイズは、約40 nmです。 40 nmまで移動すると、取得時間を4倍、および光子収量のピクセルを下げることになります。また、実験条件下で、セグメンテーション結果に有意な改善が、ガウスフィルタを用いて得られていることができる結果と比較して観察されませんでした。プロトコルは、したがって、この簡単な後処理工程に依存し、撮像中Zサンプリングの制約を緩和します。これにより、取得時間とサンプル漂白を減少しました。
フィラメントトレーサモジュールは、完全にAUTOMを提供していますATICセグメンテーション。しかし、文化のこのタイプでは、ニューロンが互いに交差し、しばしば密集しており、強力なバックグラウンドから画像化されます。これは、悪の自動セグメンテーションの精度に影響を与えます。半自動セグメンテーションは、より堅牢な結果と効率的な処理につながりました。これは、選択された樹状突起に沿って棘の自動3Dセグメンテーションに続く神経細胞の基底体から樹状突起のガイド付きトレース、から構成されています。
先に説明したように8本手法は、タイムラプス撮影を行うと直接初代ラット皮質ニューロンからニューロンを生きに 脊椎成熟を 記録するために使用することができます。
ヒトiPS細胞由来のニューロンは、科学者の注目を集めており、自閉症スペクトラム障害を含む神経発達障害9-14をモデル化しようとする最近の試 みがなされてきました。皮質回路では、樹状突起棘は、興奮性シナプスの確立に大きな役割を果たしているが、その定量的な分析が不十分な神経発達障害を有するヒトで報告されています。開発と寿命を通じての間に、棘の密度とその形態は神経回路の接続性のために重要です。遺伝的原因と病状では、患者の生検からのiPS細胞由来の神経細胞（ 例えば 、線維芽細胞）の使用は、疾患状態の原因である可能性が変異した遺伝子を発現するニューロン間の回路開発の分析を可能にします。このプロトコルは、突然変異したニューロンおよび対照個体からの再プログラムされたニューロンと表現型の比較の集団内spinogenesisの大規模なインビトロ分析のための強力なアプローチを表します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Penicillin-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
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