Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Dendrittutløperne av pyramidale nevroner er nettstedene til de fleste eksitatoriske synapser i hjernen hos pattedyr cortex. Denne metoden beskriver en 3D kvantitativ analyse av ryggraden morfologi i menneskelige kortikale pyramide glutamaterge nevroner avledet fra induserte pluripotente stamceller.

Abstract

Dendrittutløperne er små fremspring som svarer til de post-synaptiske avdelinger av eksitatoriske synapser i sentralnervesystemet. De er fordelt langs de dendritter. Deres morfologi er i stor grad avhengig av neuronal aktivitet, og de er dynamiske. Dendrittutløperne glutamaterge uttrykker reseptorer (AMPA og NMDA-reseptorer) på deres overflate, og ved nivåene av postsynaptiske tettheter. Hver ryggrad gjør at nervecellen å kontrollere status og lokal aktivitet uavhengig. Spine morfologi har blitt omfattende studert i glutamaterge pyramidale celler i hjerne cortex ved bruk av både in vivo metoder og nevronale kulturer erholdt fra gnager vev. Neuropatologiske tilstander kan være forbundet til endret ryggraden induksjon og modning, slik det er vist i dyrkede nerveceller fra gnagere og en-dimensjonal kvantitativ analyse 1. Denne studien beskriver en protokoll for 3D kvantitativ analyse av ryggraden morfologi bruker menneskelige cortical nevroner avledet fra nevrale stamceller (sen kortikale forfedre). Disse cellene ble opprinnelig oppnådd fra induserte pluripotente stamceller. Denne protokollen tillater analyse av ryggraden morfologi ved forskjellige dyrkningsperioder, og med mulighet for sammenligning mellom induserte pluripotente stamceller fra kontrollpersoner med dem som ble oppnådd fra pasienter med psykiatriske sykdommer.

Introduction

Dendrittutløperne av kortikale nevroner pyramidale er små og tynne fremspring som er fordelt langs de basale og apikale dendritter av disse neuronale subtyper i gnagere, primater, og menneskelige hjerne. De er nettstedene til de fleste eksitatoriske synapser og vise nøkkelfunksjoner i læring og kognitive prosesser. De detaljerte strukturer av menneskelige dendrittutløperne har blitt teknisk undersøkt ved elektronmikroskopi 2. Imidlertid er en slik tilnærming tidkrevende og representerer tung arbeidsbelastning. Mer nylig har en tre-dimensjonal (3D) rekonstruksjon av morfologi dendrittutløperne blitt rapportert i humane hjerne cortex ved hjelp av spesiell programvare sammen til store manuell ryggrad analyse tre.

Grønn fluorescens protein (GFP) teknologi koblet til immunfluorescens representerer et nøyaktig verktøy for rygg identifisering og form måling av fluorescens mikroskopi. Denne tilnærmingen kan lett brukes på dyrkede nerveceller. However, har ingen data er rapportert på analyse av ryggraden modning og morfologi på menneskelige nevroner avledet fra induserte pluripotente stamceller (IPSC).

Formålet med denne studien var å beskrive en protokoll, som tillater dendritisk ryggrad avbildning fra dyrkede humane nerveceller in vitro. GFP merking, konfokal mikroskopi og 3D analyse med Filament Tracer modul av Imaris programvare ble brukt i denne protokoll. Kultur trinn som er nødvendig for å oppnå kortikale glutamaterge nevroner av lagene II til IV av nevrale stamceller (NSC) er også kort beskrevet her. Hele protokollen for menneskelig NSC produksjonen har allerede blitt publisert andre steder 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neuronal Culture

Merk: Fibroblast omprogrammering i pluripotente stamceller, forpliktelse til rygg telencephalon avstamning, avledning, forsterkning, og banking av sen kortikale stamfedre (LCP) ble beskrevet i Boissart et al fire. Neuronal differensiering av LCP-lignende celler, ble også utført i henhold til Boissart et al 4 med små modifikasjoner. Andre prosedyrer er blitt utviklet for direkte reprogrammering av fibroblaster til induserte pluripotente stamceller, etterfulgt av deres differensiering til neuroner. Denne protokollen ble bevart siden det tillater den selektive produksjon av glutamaterge nevroner pyramidale.

  1. Behandle 6-brønners kulturplater med dekkglass med poly-ornitin (fortynnet til 1/6 i DPBS, lager-konsentrasjon 0,01%) O / N, fulgt av tre vaskinger i DPBS. Deretter legger laminin (stock konsentrasjon 1 mg / ml, fortynnet 500 ganger i DPBS) i minst 10 timer under de strømningshette .
  2. Plate og sende NSC ved lav tetthet (50.000 celler / cm2) i 6-brønners kulturplater med dekkglass i 3 ml kulturmedium bestående av DMEM / F12 (500 ml), 2 ampuller (5 ml hver) av N2 supplement, 2 ampuller (10 ml hver) av B27 supplement, 10 ml Pen-Streptomycin (Penicillin = 10.000 enheter / ml og streptomycin = 10.000 enheter / ml), 1 ml 2-merkaptoetanol (Stamløsning: 50 mM) og laminin (1 / 500), uten vekstfaktorer. KRITISK STEP: Utfør dette trinnet nøye ved å legge til celler med langsomme roterende bevegelser for å redusere celle clustering.
  3. Fjerne kulturmediet. Legg N2B27 friskt medium inneholdende 2 ug / ml friskt laminin løsning for å holde nervecellen festet på dekkglass og unngå klumpdannelse. Endre medium hver 3 dager. Beholde noen av de resterende medium (200 pl) før tilsetning av friskt medium for å hindre at cellen fra tørking. Alternativt kan fortsette hurtig og endre det totale volumet (3 ml).
e_title "> 2. Lentiviral Transduksjon

Merk: GFP lentiviral vektorer ble vennlig levert av Dr. Uwe Maskos Laboratory ved Institut Pasteur (Paris) og fremstilt i henhold til protokoll som er publisert fem. GFP-ekspresjon drevet av mus fosfoglyceratkinase (PGK) promoter. For denne studien, viral titer var på 400 ng / mL (stamløsning i PBS 1x).

  1. Transduce humane IPSC-avledet neuroner på ethvert trinn av modning av viruspartikler ved tilsetning av 1 pl av stamløsning inneholdende 40 ng av GFP lentiviral vektor pr kulturen godt (6-brønns plater) og inkuberes i 48 timer i ferskt kulturmedium. Merk: For denne protokollen tillater inkubasjonsvarigheten en god merking av ryggraden strukturer.

3. Immunofluorescence

Merk: For å forbedre merking av hele ryggraden morfologi, ble utført ved anvendelse av immunfluorescens merkingen et anti-GFP-antistoff i permeabiliserte forhold.

  • Fjerne dyrkningsmedium og feste transduserte celler på dekkglass i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved RT, og deretter vaskes 3 ganger i 1 x PBS (10 min hver).
  • Immerge Dekk i PBS supplert med 0,05% Triton (100x) og 10% hesteserum i 1 time ved RT, deretter vaskes 3 ganger i 1 x PBS.
  • Tilsett 100 ul av 1 x PBS supplert med 4% hesteserum og primære antistoff (1/1000) dannet mot GFP og fortynnet med en faktor på 1000 på hver dekkglass. Inkuber i en mørk boks O / N ved 4 ° C, deretter vaskes 3 ganger med 1 x PBS.
  • Fortynn Alexa Fluor 488-konjugert antistoff (1/200) i PBS supplert med 0,5% Tween 20, og inkuberes i 1 time ved RT. Deretter vaskes 3 ganger i 1x PBS og montere Dekk på glassplater med monteringsmedium for fluorescens mikroskopi.
  • 4. Dendritic Spine Imaging

    1. Utfør confocal Imaging gjennom et konfokal laser-scanning mikroskop.
    2. Velg sunne nevroner med pyramide morfologi ennd en full dendrittiske arborization, og kvantifisere minst 10 nevroner per tilstanden fra separate forsøk. Kvantifisere 60 - 100 mikrometer per Dendritt.
    3. Erverve bilder med en 40X olje NA = 1.3 objektiv og en 488 nm laser linje for GFP eksitasjon, med en typisk toppeffekt på prøvenivå rundt 20 μW. Set pikselstørrelse rundt 80 nm til skikkelig prøve dendrittutløperne.
      Merk: Den påfølgende analyse oppfordring til et bilde der støy ikke kompromisse riktig segmentering av dendritter og pigger. Med de romlige prøvetaking og strøminnstillinger som er nevnt ovenfor, observerte vi at en piksel dwell-tid på 3,15 ps er tilstrekkelig til å samle nok fotoner å bygge et slikt bilde. For dim prøver, kan bildekvaliteten forbedres ved gjennomsnitt 2 til 4 skanninger. Oppkjøp av flere XY fliser kan være nødvendig for å dekke regionen av interesse, som deretter skal sys sammen før behandling.
    4. Å prøve hele nevron volum, få en Z-stack, meden Z avstands som strekker seg fra 150 nm til 300 nm, noe som ga 20 til 30 Z-skiver.
      Merk: lateral romlig oppløsning oppnås med disse innstillingene er 234 nm og den aksiale oppløsningen er 591 nm. Prøvetakingen valgt her er tilstrekkelig, men som den aksielle oppløsning er større enn den minste størrelse av de pigger som skal avbildes, favoriserer analysen av pigger som strekker seg sideveis fra de dendritter.

    5. 3D Kvantifisering av dendrittutløperne

    Merk: De følgende avsnittene beskriver spesielt anvendelse av Imaris programvare for analyse. Alternative implementeringer eksisterer, inkludert NeuronStudio 15 eller Metamorph 8, som kan gi lignende resultater.

    Bruk følgende nøkkelinnstillinger:

    1. Som en pre-prosessering scenen, bruker Gaussian filtrering gjennom bildebehandling fasilitetene som tilbys av programvaren. Utfør Gaussian filtrering via Bildebehandling> Smooting> Gaussian filter. Angi at filteret bredde til å være lik den pikselstørrelsen i XY.
    2. Utfør en Semi-automatisk sporing av dendritter, ved hjelp av Filament Tracer modulen av programvaren.
      1. Først anslå Dendritt diameter, ved hjelp av avstand verktøy i kategorien Slice av programvaren.
      2. I overgå fanen, klikk på Filaments verktøyet. For en bedre robusthet, er avhengig av denne protokollen på semi-automatisert sporing; klikk på Skip automatisk oppretting. Modulen grensesnittet viser nå fanen Draw. Her velger AutoPath som metode, DENDRITE som en type, og innspill estimert dendrite diameter.
      3. Bruk Velg modusen for pekeren, snu markøren inn i en boks. Shift-høyreklikk på dendrite utgangspunkt. Merk: programvaren utfører innledende beregninger.
      4. Flytt pekeren langs dendrite. Fra startpunktet (representerersert som en blå kule), blir en gul linje som representerer den mest sannsynlige bane dendritt vist. Shift-venstre-klikk på dendrite endepunkt.
    3. Utfør automatiserte pigger segmentering. Merk: De pigger på den spores dendritt finnes automatisk av modulen grensesnittet.
      1. I modulen grensesnittet, klikk på fanen Creation. I Gjenoppbygg drop-liste, plukke gjenoppbygge DENDRITE Diameter og sjekk Keep Data-boksen. Deretter klikker du på Gjenoppbygg.
      2. Sett terskel, slik at det segmenterte volumet tilsvarer den faktiske dendrite volum. Som en algoritme, velg Korteste avstand fra Avstand kart. Klikk Neste.
      3. Bestem den minste ryggrad hodet diameter og maksimal lengde, igjen ved hjelp av avstand verktøy i kategorien Slice av programvaren, og deretter komme tilbake til overgå fanen og angi parametere. Feller denne protokollen, verdier rundt 200-300 nm for minimal diameter og 4 mikrometer for maksimal lengde er gode utgangspunkt. Ikke sjekk Tillat Branch Pigger boks. Klikk Neste.
      4. Juster kimpunkter terskel, slik at de blå punktene representerer pigger lokalisere til selve ryggraden hoder. Klikk Neste. Merk: Kjernen Beregningen er gjort nå, og kan bli langvarig.
    4. Klassifisere pigger ved å gå til Verktøy-kategorien i modulgrensesnittet. Klikk på Gi Pigger. I bedt om brukergrensesnittet, sørg for at det er fire klasser, definert av deres morfologi som følger: Stubby: lengde <1 mikrometer; Mushroom: Lengde (ryggraden)> 3 og Max bredde (hode)> bety bredde (nakke) x 2; Lang tynn: Mean bredde (hode) ≥ Mean bredde (nakke); Filopodia-like: Lengde ≤ 4 mikrometer (uten hode).
      Merk: module grensesnitt genererer fire nye Filament objekter som inneholder resultatene av klassifiseringen.
    5. Eksport Statistiske data: på noen av disse fire objektgrensesnitt, gå til kategorien statistikk.
      Klikk på Export all statistikk til fil-knappen.
      Merk: Andre statistiske verdier kan eksporteres for dendritter (. F.eks lengde, areal, mener diameter, gren dybde, forgrening vinkel, volum, osv.), Og for pigger (f.eks retthet, område av vedlegg, lengde og volum av distinkte ryggrad deler, spine diameter, tettheter, osv.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Denne studien beskriver en standardisert protokoll for rygg kvantifisering av dyrkede dendritter av pyramidale nevroner avledet fra IPSC. Denne protokollen tillater analyse av ryggraden modning på humane nerveceller og dens mulige sammenligning med modning av pigger i standard gnager nevronale kulturer, så vel som i in vivo dyremodeller.

    Figur 1A viser et skjema over de forskjellige trinnene i kultur som tillater produksjon av kortikale pyramidale neuroner. En slik skjematisk representasjon er gitt for bedre å forstå den globale tidsskalerings av produksjonen av pyramidale neuroner utrustet med forskjellige kategorier av pigger. Reprogrammation trinn, men er ute av omfanget av denne studien, og har blitt beskrevet andre steder 4. Sunn nevroner kan holdes i kultur opp til 65 -. 70 dager Figur 1B viser arbeidsflyten for bildebehandling og 3D kvantifisering av pigger.

    ove_content "> Figur 2A illustrerer kultur av humane nerveceller merket med et anti-beta III-tubulin-antistoffet. Denne figur viser også tendensen av celleklynger. Figur 2B viser et GFP-merket pyramideformet neuron av overfladiske kortikale lag 40 dager etter differensiering sene kortikale stamfedre (LCP).

    Figur 2C og figur 3A illustrere 3D rekonstruksjon av segmenter av dendrittutløperne på ulike stadier av modning. Den kvantitative analyse av to valgte parametre (spine tettheter og ryggrad hode volum) er vist i figur 3B. Våre resultater tyder på at disse to parametrene øker over hele dyrkningsperioden som forventet.

    Figur 1
    Figur 1. (A) Oversikt over tidsskala av nevronale diff differensieringen. Denne skjematiske representasjonen beskriver de tre trinnene av neuronal differensiering. Protokollen er tilpasset fra Boissart et al. 4. I trinn 1, blir menneskelig IPSC utledet i tidlige kortikale stamfedre (ie., Tidlige nevro-epitelceller fra rygg telencephalon) etterfulgt av transformasjon til slutten av kortikale stamfedre (LCP). LCP blir så forsterket for cellebank i flytende nitrogen. I trinn 2, blir neural differensiering oppnådd i løpet av to uker. Trinn 3 tilsvarer opprettholde nerveceller i kultur for lengre perioder, for å følge ryggraden voksende og progressiv modning. Under betingelsene kultur, kan friske nevroner holdes opp til 65 -. 70 dager (B) Arbeidsflyt av de ulike trinnene for bildebehandling og 3D kvantifisering av pigger. (IF: immunfluorescens). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    ove_content "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 2
    Figur 2 (A) beta III tubulin-positive celler viste ved immunofluorescens ved anvendelse av samme protokoll som beskrevet, og et polyklonalt anti-beta-tubulin III-antistoff som brukes i en fortynning på 1 / 1,000. (B) Primær og sekundær dendritisk forgrening av et GFP -merket pyramide nevron dyrket 40 dager etter LCP scenen. I det innfelte, er den samme neuron representert ved lavere forstørrelse med tilsynelatende cellekroppen. (C) 3D rekonstruksjon av to kategorier av pigger på et segment av en sekundær dendritt. Skala barer:. 250 mikrometer (A), 100 mikrometer (B), 40 mikrometer (B innfelt), 1,5 mikrometer (C) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


    Figur 3. (A) 3D rekonstruksjon av dendrittutløperne (blå farge) med illustrerte segmenter av sekundære dendritter (grå farge), på to forskjellige kulturstadier (25 og 45 dager etter differensiering fra LCP). (B) Kvantitativ analyse av ryggraden tettheter og morfologi med to utvalgte parametre som ryggrad tetthet langs Dendritt og ryggrad hodet volum og på to kultur perioder. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av minst 10 forskjellige nervecellen segmenter hentet fra videregående dendritter fotografert av konfokalmikroskopi. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en Mann-Whitney test (* p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Kvantifisering av de morfologiske trekk ved pyramidale nevroner avhengig av programvaren. Filamentet Tracer Grensesnittet ble anvendt for segmentering av neuroner og pigger, og XT-modulen ble brukt for sin analyse.

    Å analysere nøyaktigheten av vår teknikk, vi først sammenlignet de målte morfologiske parametere (lengde, areal, og totalt ryggrad volum når gjeldende), med det som er publisert ved hjelp av rotte modne pyramidale nevroner i kultur 6, 7 og menneskelige hjernen vev 3. Tettheter var sammenlignbare i alle tilfeller. Ingen volumdata ble beskrevet i rotte nevroner (en 2D-analyse ble rapportert med programvaren som brukes av forfatterne), mens total ryggrad volum ble noe redusert i forhold til våre data, i studiet av Benavides-Piccione tre ved hjelp av sin egen protokoll for volumoppbyggingen på utvalgte pigger. Slike forskjeller kan også forklares ved den regionale opprinnelsen av celler og det fluorescerende fargestoff som brukes for sittmerking.

    Noen kritiske punkter bør understreket i vår protokoll, som i hovedsak refererer til terskel definisjoner for konfokal kvaliteten på bildene og påfølgende quantifications. Koblingen av transduksjon av et GFP-lentiviral vektor med anti-GFP immunfluorescens sikrer en god merking og visualisering av hele ryggraden strukturer. Vi var ikke i stand til å merke den fulle dendrittiske arborization ved trans omprogrammeres celler med GFP vektorer og ved vanlige protokollene. Typisk 70 - 80% er omformet under vårt eksperimentelle forhold. Slik prosentandelen er mye større enn hva vi har observert ved hjelp av transfeksjon protokoller med GFP plasmider (15% av transfekterte neuroner i våre tester).

    Avhengig av effektiviteten og spesifisiteten av merking, kan Gaussian filtrering eller deconvolution være nyttig som en pre-prosesstrinn for å redusere støy. Vi har også testet 3D-bildet rekonstruksjon og kvantifisering etter dekonvolvering. Dette behss var ventet å være nyttig fordi, selv med konfokalt avbildnings, dekonvolvering betraktelig forbedrer bildekvaliteten og rammer uskarphet forårsaket av diffraksjon. Dekonvolvering imidlertid setter en stor belastning på bilde trinnet, imponerende tøffe romlig sampling i alle tre retninger. Med optisk oppsett som brukes i denne protokollen, er det pikselstørrelse ønsket for dekonvolvering rundt 40 nm, mens vi satt i ca 80 nm for bildene som presenteres her. Flytte til 40 nm vil firedoble oppkjøpet tid, og senk foton utbyttet piksel. I tillegg, under de eksperimentelle betingelser, ble det ingen signifikant forbedring i segmenterings resultatene observert sammenlignet med de resultater, som kan ha vært oppnådd med Gaussisk filtrering. Protokollen er avhengig derfor på dette enklere etterbehandlingstrinn og slappet av Z prøvetakings begrensninger under bildebehandling. Dette i sin tur redusert oppkjøpet tid og prøve bleking.

    Den Filament Tracer modulen tilbyr et fullt automatic segmentering. Men i denne type kultur, nervecellene er ofte tett, krysse over hverandre, og er fotografert fra en sterk bakgrunn. Dette påvirker nøyaktigheten av automatiske segmentering. Den semi-automatisk segmentering ført til mer robuste resultater og effektiv behandling. Denne består av en styrt sporing av dendritter fra basal kroppen av nervecellen, etterfulgt av en automatisk segmentering av 3D pigger langs utvalgte dendritter.

    Vår metode kan brukes til å utføre time-lapse bildebehandling og direkte opp ryggraden modning i levende nerveceller fra primær rotte kortikale nevroner, som tidligere beskrevet åtte.

    Menneske IPSC-avledet nevroner har trukket oppmerksomheten til forskere og det har vært siste forsøk på å modellere nevrologiske lidelser inkludert autismespekterforstyrrelser 9-14. I cortical kretser, dendrittutløperne spille en viktig rolle i etableringen av eksitatoriske synapser, men dereskvantitativ analyse har blitt dårlig dokumentert hos mennesker med nevrologiske lidelser. I løpet av utvikling og i hele levetiden, tettheten av pigger og deres morfologi er kritiske for tilkobling av neuronal kretser. I patologier med genetiske årsaker, tillater bruk av IPSC-avledet nerveceller fra pasienter biopsier (f.eks. Fibroblaster,) analyse av kretsene utvikling mellom nerveceller som uttrykker det muterte genet (er) som kan være ansvarlig for sykdomstilstander. Denne protokollen representerer en kraftig tilnærming for omfattende in vitro analyse av spinogenesis innen en populasjon av muterte nevroner og sammenligning av fenotyper med omprogrammerte nerveceller fra kontrollpersoner.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter