Summary
Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.
Abstract
As espinhas dendríticas são pequenas saliências que correspondem aos compartimentos pós-sinápticas das sinapses excitatórias no sistema nervoso central. Eles estão distribuídos ao longo dos dendritos. A sua morfologia é em grande parte dependente da actividade neuronal, e eles são dinâmicos. Espinhas dendríticas expressam receptores glutamatérgicos (receptores AMPA e NMDA) em sua superfície e nos níveis de densidade pós-sináptica. Cada coluna permite que o neurônio para controlar sua atividade estatal e local de forma independente. Spine morfologias têm sido extensivamente estudadas em células piramidais glutamatérgicos do córtex cerebral, usando ambas as abordagens in vivo e culturas neuronais obtidos a partir de tecidos de roedores. Condições neuropatológicas podem ser associados à indução da coluna alterada e maturação, como mostrado em roedores neurónios em cultura e análise quantitativa unidimensional 1. O presente estudo descreve um protocolo para a análise quantitativa 3D de morfologias coluna usando cortic humanoneurônios al derivadas de células estaminais neurais (progenitoras corticais final). Estas células foram inicialmente obtida a partir de células estaminais pluripotentes induzidas. Este protocolo permite a análise da morfologia da coluna vertebral em diferentes períodos de cultura, e com a possibilidade de comparação entre as células-tronco pluripotentes induzidas obtidas de indivíduos controle com aqueles obtidos de pacientes com doenças psiquiátricas.
Introduction
Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais corticais são pequenas e finas saliências que são distribuídos ao longo das dendrites basais e apicais de esses subtipos neuronais em roedores, primatas e cérebro humano. Eles são os sites da maioria das sinapses excitatórias e exibir funções-chave na aprendizagem e processos cognitivos. As estruturas detalhadas de espinhas dendríticas humanas foram tecnicamente estudada por microscopia eletrônica de 2. No entanto, tal abordagem é demorado e representa a carga de trabalho pesado. Mais recentemente, um (3D) reconstrução tridimensional da morfologia das espinhas dendriticas foi reportado no córtex do cérebro humano utilizando um software específico combinados para análise grande coluna Manual 3.
A tecnologia verde proteína fluorescente (GFP) acoplado a imunofluorescência representa uma ferramenta precisa para a identificação e medição espinha forma por microscopia de fluorescência. Esta abordagem pode ser facilmente aplicado a culturas de neurónios. However, há dados foram relatados na análise de maturação coluna e morfologia em neurônios humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC).
O objetivo deste estudo foi descrever um protocolo, que permite imagens espinha dendrítica de neurônios humanos cultivados in vitro. Rotulagem GFP, microscopia confocal e análise 3D com o módulo de software de Filamento Tracer Imaris foram utilizados no presente protocolo. Culturas etapas que são necessárias para obter neurónios glutamatérgicos do córtex das camadas II a IV a partir de células estaminais neurais (NSC) também são brevemente descritos aqui. Todo o protocolo para a produção NSC humano já foi publicado em outros lugares 4.
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Protocol
1. Cultura Neuronal
Nota: reprogramação de fibroblastos em células-tronco pluripotentes, o compromisso com a linhagem telencéfalo dorsal, derivação, amplificação e bancário de progenitores corticais final (LCP) foram descritas em Boissart et al 4. A diferenciação neuronal de células-LCP como também foi realizada de acordo com Boissart et ai 4 com ligeiras modificações. Outros procedimentos foram desenvolvidos para a reprogramação directa de fibroblastos em células estaminais pluripotentes induzidas seguido da sua diferenciação em neurónios. Este protocolo foi mantida, uma vez que permite a produção selectiva de neurónios glutamatérgicos piramidais.
- Tratar-6 placas de cultura com lamelas de vidro com poli-ornitina (diluído a 1/6 em DPBS, concentração de estoque de 0,01%) O / N, seguido por três lavagens em STDF. Em seguida, adicione a laminina (concentração de 1 mg / ml, diluído 500 vezes em DPBS) durante pelo menos 10 horas, sob a câmara de fluxo .
- Placa e despachar NSC a baixa densidade (50.000 células / cm2) em 6 placas de cultura com lamelas de vidro em 3 ml de meio de cultura consistindo em DMEM / F12 (500 ml), 2 frascos (5 mL cada) de suplemento N2, 2 frascos para injectáveis (10 ml cada) de suplemento de B27, 10 ml de Pen-Estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades / ml e estreptomicina = 10.000 unidades / ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (da solução: 50 mM) e laminina (1 / 500), sem factores de crescimento. Passo crítico: Realizar este passo cuidadosamente pela adição de células com movimentos de rotação lentos, a fim de reduzir a agregação de células.
- Remover o meio de cultura. Adicionar meio fresco contendo N2B27 2 ug / ml de laminina solução fresca para manter o neurónio ligado nas lamelas de vidro e evitar aglomeração. Mudar o meio cada 3 dias. Manter algum do meio restante (200 uL) antes da adição de meio fresco, a fim de impedir que a célula de secagem. Alternativamente, proceder rapidamente e alterar o volume total (3 mL).
Nota: lentivirais GFP foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Uwe Maskos do laboratório no Instituto Pasteur (Paris) e preparado de acordo com o protocolo publicado 5. Expressão da GFP é dirigido pelo promotor de rato fosfoglicerato-quinase (PGK). Para este estudo, foi título viral de 400 ng / ul (solução estoque em PBS 1x).
- Transduzir neurónios iPSC derivados humanos em qualquer etapa de maturação por partículas virais através da adição de 1 ul da solução de estoque contendo 40 ng de vector lentiviral GFP por poço de cultura (placas de 6 poços) e incubar durante 48 horas em meio de cultura fresco. Nota: Para este protocolo, a duração da incubação permite uma boa rotulagem das estruturas da coluna vertebral.
3. Imunofluorescência
Nota: A fim de melhorar a rotulagem de toda a morfologia da coluna, imunofluorescência foi realizada utilizando um anticorpo anti-GFP em condições permeabilizadas.
4. dendríticas Spine Imagem
- Execute confocal de imagem através de um microscópio de varredura a laser confocal.
- Selecione neurônios saudáveis, com uma morfologia piramidalnd uma arborização dendrítica completo, e quantificar, pelo menos, 10 neurônios por condição de experiências separadas. Quantificar 60-100 mM por dendrite.
- Adquirir imagens usando um óleo 40X NA = 1,3 objetiva e uma linha de laser de 488 nm para excitação GFP, com uma potência de pico típica a nível amostra de cerca de 20 mW. Definir tamanho do pixel em torno de 80 nm para provar corretamente espinhas dendríticas.
Nota: A chamada análise posterior para uma imagem na qual o ruído não comprometa a segmentação adequada dos dendritos e espinhas. Com as definições de amostragem e de potência espaciais mencionadas acima, observamos que um pixel em tempo de permanência de 3,15 mS é suficiente para coletar fótons suficientes para construir tal imagem. Para amostras de dim, a qualidade da imagem pode ser melhorada por uma média de 2 a 4 varrimentos. Pode ser necessária a aquisição de vários azulejos XY para cobrir a região de interesse, o que, em seguida, devem ser costuradas antes do processamento. - Para provar todo o volume neurônio, adquirir uma pilha-Z, comZ um espaçamento que varia de 150 nm a 300 nm, obtendo-se 20 a 30 fatias Z.
Nota: A resolução espacial lateral, obtida com essas configurações é 234 nm ea resolução axial é 591 nm. A amostragem escolhida aqui é adequada, mas, como a resolução axial é maior do que o menor tamanho das espinhas a ser trabalhada, a análise favorece as espinhas que se estendem lateralmente a partir das dendrites.
5. 3D Quantificação de espinhas dendríticas
Nota: As secções que se seguem descrevem especificamente a utilização do software para análise Imaris. Existem implementações alternativas, incluindo NeuronStudio 15 ou Metamorph 8, que pode fornecer resultados semelhantes.
Use as seguintes configurações-chave:
- Como uma etapa de pré-processamento, usar a filtragem Gaussian através das instalações de processamento de imagens oferecidas pelo software. Executar filtragem Gaussian através do Processamento de Imagem> Smoocoisa> Filtro de Gauss. Definir a largura do filtro para ser igual ao tamanho do pixel em XY.
- Execute um traçado semi-automática de dendrites, utilizando o módulo de Filament Tracer do software.
- Em primeiro lugar, calcular o diâmetro dendrite, usando a função da distância no separador Fatia do software.
- Na guia Ultrapasse, clique na ferramenta filamentos. Para uma melhor robustez, este protocolo se baseia em rastreamento semi-automática; clique em Ir criação automática. O módulo de interface agora está mostrando a guia Draw. Aqui, selecione autopath como um método, Dendrite como um tipo, e introduzir o diâmetro estimado dendrite.
- Use o modo Selecção do ponteiro, virando o cursor em uma caixa. Shift-botão direito do mouse sobre o ponto de partida dendrite. Nota: o software realiza cálculos iniciais.
- Mova o ponteiro ao longo da dendrite. Desde o ponto de partida (representamed como uma esfera azul), é mostrada uma linha amarela que representa o caminho dendrite mais provável. Shift-esquerdo do mouse sobre o ponto final dendrite.
- Execute o espinhos segmentação automática. Nota: Os espinhos sobre a dendrite rastreada encontram-se automaticamente pelo módulo de interface.
- Na interface do módulo, clique na guia Criação. Na lista drop-Reconstruir, escolher Rebuild Dendrite Diâmetro e marque a caixa de dados Fortaleza. Em seguida, clique em Reconstruir.
- Definir o limite para que o volume segmentado corresponde ao volume dendrite real. Como um algoritmo, selecione Shortest Distância do Mapa distância. Clique no botão Avançar.
- Determine o menor diâmetro da cabeça da coluna eo comprimento máximo, novamente usando a ferramenta distância na guia Fatia do software, em seguida, voltar para a guia Ultrapasse e inserir os parâmetros. Fou este protocolo, valores em torno de 200-300 nm para o diâmetro mínimo e 4 mm de comprimento máximo são bons pontos de partida. Não marque a caixa Permitir ramo de espinhos. Clique no botão Avançar.
- Ajustar o Limiar Pontos de sementes de modo a que os pontos azuis representam espinhas localizar a cabeça da coluna reais. Clique no botão Avançar. Nota: O cálculo do núcleo é feito agora e pode ser demorado.
- Classificar espinhas, indo para a aba Ferramentas da interface do módulo. Clique em Classificar espinhos. Na interface do usuário for solicitado, certifique-se de que existem quatro classes, definidas pela morfologia da seguinte forma: Stubby: comprimento <1 mm; Cogumelo: Comprimento (espinha)> 3 e largura Max (cabeça)> largura média (pescoço) x 2; Longo e fino: A média de largura (cabeça) ≥ largura média (pescoço); Filopodia-like: Comprimento ≤ 4 mm (sem cabeça).
Nota: O moInterface dule gera quatro novos objetos filamentos contendo os resultados da classificação. - Exportação de dados estatísticos: em qualquer um desses quatro interfaces de objeto, vá para a guia Estatísticas.
Clique sobre a exportação todas as Estatísticas botão para arquivo.
Nota: Outros valores estatísticos podem ser exportados para dendrites (. Por exemplo, comprimento, área, diâmetro, profundidade ramo, ramificação ângulo, volume, etc dizer.), E por espinhas (por exemplo, retidão, a área de ligação, comprimento e volume de distintas partes da espinha, espinha de diâmetro, densidades, etc.)
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Representative Results
O presente estudo descreve um protocolo padronizado para a coluna quantificação das dendrites cultura de neurônios piramidais derivadas da IPSC. Este protocolo permite a análise de maturação coluna sobre neurónios humanos e sua possível comparação com a maturação das espinhas em culturas neuronais de roedores normais, bem como em modelos animais in vivo.
A Figura 1A representa um esquema dos diferentes passos de cultura que permitem a produção de neurónios piramidais corticais. Tal representação esquemática é fornecido a fim de melhor compreender a escala da produção de neurônios piramidais dotados de diferentes categorias de espinhos tempo global. Reprogramação passos, no entanto, estão fora do âmbito do presente estudo e foram descritos noutro local 4. Neurônios saudáveis podem ser mantidos em cultura até 65 -. 70 dias Figura 1B mostram o fluxo de trabalho de criação de imagens e quantificação em 3D de espinhos.
ove_content "> A Figura 2A ilustra a cultura de neurónios humano marcados com um anticorpo tubulina anti-beta-III. Esta figura mostra também a tendência de agregação de células. A Figura 2B mostra uma piramidal neurónio marcado com GFP das camadas corticais superficiais aos 40 dias pós diferenciação progenitores corticais de atraso (LCP).Figura 2C e 3A ilustram Figura reconstrução 3D de segmentos de espinhas dendriticas, em diferentes estádios de maturação. A análise quantitativa de dois parâmetros selecionados (densidades de coluna e cabeça de volume da coluna) é representada na Figura 3B. Os nossos resultados indicam que estes dois parâmetros aumentar ao longo do período de cultura, como esperado.
Figura 1. (A) Visão geral da escala de tempo de diff neuronal erentiation. Esta representação esquemática descreve as três etapas da diferenciação neuronal. O protocolo é adaptado de Boissart et al. 4. No passo 1, iPSC humana são derivados de células progenitoras corticais iniciais (isto é., As células neuro-epiteliais precoces do telencéfalo dorsal) seguida por transformação para células progenitoras corticais final (LCP). LCP são então amplificados para bancos de células em azoto líquido. No passo 2, a diferenciação neuronal é alcançada dentro de duas semanas. Passo 3 corresponde a manutenção dos neurónios em cultura por longos períodos, a fim de seguir espinha crescimento e maturação progressiva. Sob as condições de cultura, os neurônios saudáveis pode ser mantida até 65 -. 70 dias (B) Fluxo de trabalho das diferentes etapas para a criação de imagens e quantificação em 3D de espinhos. (IF: imunofluorescência). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Células positivas Figura 2. (A) Beta tubulina III revelado por imunofluorescência usando o mesmo protocolo, tal como descrito, e um anticorpo anti-beta-tubulina III policlonal utilizado a uma diluição de 1 / 1.000. (B) ramificação dendrítica primário e secundário de um GFP marcado com neurônio piramidal cultivadas 40 dias após a fase LCP. Na inserção, o mesmo neurónio é representado com uma ampliação menor, com corpo da célula aparente. Reconstrução (C) 3D de duas categorias de espinhos sobre um segmento de um dendrito secundário. Barras de escala:. 250 mm (A), 100 mm (B), 40 mm (B), inserção de 1,5 mm (C) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura reconstrução 3. (A) 3D das espinhas dendríticas (cor azul) com ilustradas segmentos de dendrites secundárias (cor cinza), em duas fases diferentes de cultura (25 e 45 dias pós-diferenciação de LCP). (B) Análise quantitativa da coluna vertebral densidades e morfologias com dois parâmetros selecionados, como a densidade espinha ao longo dendrite e cabeça espinha volume e em dois períodos de cultura. Os resultados são apresentados como média ± SEM de pelo menos 10 segmentos neuronais distintos obtidos de dendritos secundárias fotografadas por microscopia confocal. A análise estatística foi realizada utilizando um teste de Mann-Whitney (* p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A quantificação das características morfológicas dos neurônios piramidais contou com o software. A interface Filament Tracer foi utilizada para a segmentação de neurônios e espinhos, eo módulo XT foi utilizado para suas análises.
Para analisar a precisão da nossa técnica, primeiro comparou os parâmetros morfológicos medidos (comprimento, área e volume total de espinha quando aplicável), com os publicados usando ratos neurônios piramidais maduros na cultura 6, 7 e tecidos cerebrais humanos 3. As densidades foram comparáveis em todos os casos. Não há dados de volume foram descritos em neurônios de rato (a análise 2D foi relatado com o software usado pelos autores), enquanto volume total da coluna foi ligeiramente reduzido em comparação com nossos dados, no estudo de Benavides-Piccione 3 usando seu próprio protocolo para a reconstrução de volume em espinhas selecionados. Tais diferenças também poderia ser explicado pela origem regional de células e o corante fluorescente utilizado para a suamarcação.
Alguns pontos críticos deve ser sublinhado em nosso protocolo, que se referem principalmente a definições de limites para a qualidade confocal de imagens e quantificações subsequentes. O acoplamento da transdução de um vector lentiviral-GFP com a imunofluorescência anti-GFP assegura uma boa etiquetagem e visualização das estruturas da coluna inteiras. Nós não fomos capazes de rotular a arborização dendrítica completo por transfecção de células reprogramadas com vetores GFP e por protocolos convencionais. Normalmente, 70 - 80% são transduzidas sob nossas condições experimentais. Esta percentagem é muito maior do que o observado utilizando protocolos de transfecção com plasmídeos GFP (15% de neurónios transfectadas nos nossos testes).
Dependendo da eficiência e especificidade de rotulagem, a filtragem gaussiana ou desconvolução pode ser útil como uma fase de pré-processamento para diminuir o ruído. Nós também testamos a reconstrução da imagem 3D e quantificação após deconvolução. Este process era esperado para ser útil porque, mesmo com imagem confocal, deconvolution melhora consideravelmente a qualidade da imagem e limites efeito tremido causado pelo difração. Deconvolution no entanto, coloca uma grande pressão sobre a etapa de criação de imagens, a imposição de amostragem espacial dura em todas as três direções. Com uma configuração óptico utilizado neste protocolo, o tamanho do pixel desejado para deconvolution é de cerca de 40 nm, enquanto que estabelecemos para cerca de 80 nm para as imagens aqui apresentadas. Movendo-se para 40 nm iria quadruplicar o tempo de aquisição, e diminuir o pixel rendimento fóton. Além disso, sob as condições experimentais, nenhuma melhoria significativa nos resultados de segmentação foi observada em comparação com os resultados, que podem ter sido obtidas com a filtragem gaussiana. Por conseguinte, o protocolo baseia-se esta etapa de pós-processamento simples e relaxou as restrições de amostragem Z durante o exame. Isto por sua vez diminui o tempo de aquisição e de branqueamento da amostra.
O módulo do filamento Tracer oferece uma totalmente automsegmentação Temática. No entanto, neste tipo de cultura, os neurônios são muitas vezes densa, cruzar uns sobre os outros, e são gravadas a partir de um fundo forte. Isto afeta adversamente a precisão de segmentação automática. A segmentação semi-automática levaram a resultados mais robustos e processamento eficiente. Esta consiste num rastreio guiada de dendritos do corpo basal do neurónio, seguido por uma segmentação 3D automática ao longo de espinhas dendritos seleccionados.
O nosso método pode ser usado para realizar imagiologia de lapso de tempo de maturação e gravar directamente em coluna de neurónios primários de rato neurónios corticais vivo, como anteriormente descrito 8.
IPSC neurônios derivados de humanos têm atraído a atenção dos cientistas e houve tentativas recentes para modelar desordens do desenvolvimento neurológico, incluindo transtornos do espectro do autismo 9-14. Em circuitos corticais, espinhas dendriticas desempenham um papel importante no estabelecimento de sinapses excitatórias, mas a suaanálise quantitativa foi pouco documentada em humanos com perturbações do desenvolvimento neurológico. Durante o desenvolvimento e durante toda a vida, as densidades de espinhos e suas morfologias são críticos para a conectividade dos circuitos neuronais. Em patologias com causas genéticas, a utilização de neurónios iPSC derivadas de biópsias de pacientes (por exemplo., Fibroblastos) permite a análise do desenvolvimento de circuitos entre os neurónios que expressam o gene (s) mutado que poderiam ser responsáveis por estados de doença. Este protocolo representa uma abordagem poderosa para a extensa análise em vitro de spinogenesis dentro de uma população de neurônios mutantes e comparação de fenótipos com neurônios reprogramadas a partir de indivíduos controle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Penicillin-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
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