Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Dendritutskotten av pyramidala nervceller är platserna för de flesta excitatoriska synapser i däggdjurs hjärnbarken. Denna metod beskriver en 3D kvantitativ analys av rygg morfologier i humana kortikala pyramidala glutamaterga neuroner som härrör från inducerade pluripotenta stamceller.

Abstract

Dendritutskotten är små utsprång som motsvarar de postsynaptiska fack excitatoriska synapser i det centrala nervsystemet. De är fördelade längs dendriter. Deras morfologi är till stor del beroende av neuronal aktivitet, och de är dynamiska. Dendritutskotten uttrycker glutamaterga receptorer (AMPA och NMDA-receptorer) på sin yta och med den grad av postsynaptiska tätheter. Varje ryggraden gör neuron att kontrollera dess tillstånd och lokal verksamhet självständigt. Spine morfologier har i stor omfattning studerats i glutamaterga pyramidala celler i hjärnbarken, använder både in vivo tillvägagångssätt och neuronala kulturer från gnagare vävnader. Neuropatologiska tillstånd kan vara associerade till förändrad ryggraden induktion och mognad, såsom visas i gnagare odlade neuroner och en-dimensionell kvantitativ analys 1. Den aktuella studien beskriver ett protokoll för 3D-kvantitativ analys av ryggraden morfologier användning av humant cortical neuroner härledda från neurala stamceller (sena kortikala stamceller). Dessa celler ursprungligen erhölls från inducerade pluripotenta stamceller. Detta protokoll möjliggör analys av ryggraden morfologier på olika odlingsperioder, och med eventuell jämförelse mellan inducerade pluripotenta stamceller som erhållits från kontrollindivider med de som erhållits från patienter med psykiatriska sjukdomar.

Introduction

Dendritutskotten av kortikala pyramidala nervceller är små och tunna utsprång som är fördelade längs basala och apikala dendriter av dessa neuronala subtyper hos gnagare, primater och mänskliga hjärnan. De är platserna för de flesta excitatoriska synapser och visa viktiga funktioner i lärande och kognitiva processer. De detaljerade strukturer mänskliga Dendritutskotten har tekniskt studerats genom elektronmikroskopi 2. Men är sådant tillvägagångssätt tidskrävande och representerar hög arbetsbelastning. På senare tid har en tredimensionell (3D) rekonstruktion av morfologi Dendritutskotten rapporterats i mänskliga hjärnan cortex använder särskild programvara kombineras till stora manuell rygg analys 3.

Fluorescerande protein (GFP) teknologi Grön kopplad till immunofluorescens utgör en korrekt verktyg för ryggraden identifiering och form mätning genom fluorescensmikroskopi. Detta tillvägagångssätt kan lätt appliceras på odlade neuroner. However, har inga uppgifter rapporterats på en analys av ryggraden mognad och morfologi om mänskliga nervceller härrör från inducerade pluripotenta stamceller (IPSC).

Syftet med denna studie var att beskriva ett protokoll, vilket gör att dendritiska ryggraden avbildning från odlade humana neuroner in vitro. GFP märkning, konfokalmikroskopi och 3D-analys med glödlamporna Tracer-modulen i Imaris programvara användes i detta protokoll. Kultur steg som är nödvändiga för att erhålla kortikala glutamaterga neuroner i skikt II-IV från neurala stamceller (NSC) är också beskrivs kortfattat här. Hela protokollet för human NSC produktion har redan publicerats på annat håll 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neuronala Kultur

Obs: Fibroblast omprogrammering i pluripotenta stamceller, engagemang för rygg telencephalon härstamning, härledning, förstärkning samt bank av sena kortikala stamceller (LCP) beskrevs i Boissart et al 4. Neuronal differentiering av LCP-liknande celler utfördes även enligt Boissart m fl 4 med smärre ändringar. Andra förfaranden har utvecklats för direkt omprogrammering av fibroblaster i inducerade pluripotenta stamceller följt av deras differentiering till neuroner. Detta protokoll behölls eftersom den tillåter selektiv framställning av pyramidala glutamaterga nervceller.

  1. Behandla 6-brunnars odlingsplattor med täckglas med poly-ornitin (utspädd till 1/6 i DPBS, förrådskoncentration 0,01%) O / N, följt av tre tvättningar i DPBS. Sedan till laminin (stamkoncentration 1 mg / ml, späddes 500 gånger i DPBS) i minst 10 timmar under flöde huva .
  2. Plate och sända NSC vid låg densitet (50000 celler / cm 2) i 6-brunnars odlingsplattor med täckglas i 3 ml odlingsmedium bestående av DMEM / F12 (500 ml), 2 ampuller (5 ml vardera) av N2-supplement, 2 injektionsflaskor (10 ml vardera) av B27 tillskott, 10 ml Pen-streptomycin (Penicillin = 10.000 enheter / ml och streptomycin = 10.000 enheter / ml), 1 ml av 2-merkaptoetanol (Stamlösning: 50 mM) och laminin (1 / 500), utan tillväxtfaktorer. Avgörande steg: Genomför detta steg noggrant genom att lägga till celler med långsamma roterande rörelser för att minska cell klustring.
  3. Avlägsna odlingsmediet. Lägg färskt N2B27 medium innehållande 2 pg / ml färskt laminin lösning för att hålla neuron fäst på glastäckglas och undvika klumpning. Ändra medium var 3 dagar. Behålla en del av det återstående mediet (200 | j, l) före tillsats av färskt medium för att förhindra cellen från att torka. Alternativt, sker snabbt och ändra den totala volymen (3 ml).
e_title "> 2. Lentiviral Transduction

Obs: GFP lentivirusvektorer tillhandahölls vänligen av Dr. Uwe Maskos Laboratory vid Institut Pasteur (Paris) och framställd enligt publicerade protokoll 5. GFP-expression drivs av den mus-fosfoglyceratkinas (PGK) -promotorn. För denna studie virustiter var av 400 ng / ul (stamlösning i PBS 1 x).

  1. Transducera humana iPSC-härledda neuroner vid varje steg av mognad av viruspartiklar genom att tillsätta 1 ^ il av förrådslösningen innehållande 40 ng av GFP lentivirusvektor per odlingsbrunn (6-brunnsplattor) och inkubera under 48 h i färskt odlingsmedium. Obs! För detta protokoll, den tid inkubation tillåter en bra märkning av ryggstrukturer.

3. Immunofluorescens

Obs: För att förbättra märkningen av hela ryggraden morfologi, var immunofluorescens märkning utförs med hjälp av en anti-GFP-antikropp i permeabilized förhållanden.

  • Avlägsna odlingsmediet och fixa transducerade celler på täckglas i 4% paraformaldehyd under 10 min vid RT, sedan tvätta 3 gånger i 1 x PBS (10 min vardera).
  • Immerge täckglas i PBS kompletterad med 0,05% Triton (100x) och 10% hästserum under 1 timme vid RT, sedan tvätta 3 gånger i 1 x PBS.
  • Tillsätt 100 ni 1x PBS kompletterad med 4% hästserum och primär antikropp (1/1000) rest mot GFP och späddes med en faktor av 1000 på varje täckglas. Inkubera i en mörk låda O / N vid 4 ° C, tvätta sedan 3 gånger med 1 x PBS.
  • Späd Alexa Fluor 488-konjugerad antikropp (1/200) i PBS supplementerat med 0,5% Tween 20 och inkubera under 1 h vid RT. Tvätta sedan 3 gånger i 1x PBS och montera täck på objektglas med monteringsmedel för fluorescensmikroskopi.
  • 4. dendritiska ryggraden Imaging

    1. Utför konfokala Imaging genom en konfokala laserskanning mikroskop.
    2. Välj friska nervceller med pyramidal morfologi and en fullständig dendritiska arborization och kvantifiera minst 10 neuroner per tillstånd från separata experiment. Kvantifiera 60-100 um per dendrit.
    3. Förvärva bilder med hjälp av en 40X olja NA = 1,3 objektiv och en 488 nm laserlinjen för GFP excitation, med en typisk toppeffekt på prov nivå kring 20 iW. Ställ in pixelstorlek omkring 80 nm till ordentligt prov Dendritutskotten.
      Obs: Den efterföljande samtal analys för en bild där ljudet inte äventyrar korrekt segmentering av dendriter och ryggar. Med den rumsliga provtagning och effektinställningar som nämnts ovan, konstaterade vi att en pixel uppehållstid på 3,15 us är tillräcklig för att samla in tillräckligt fotoner för att bygga en sådan bild. För dim prover, kan bildkvaliteten förbättras genom genomsnitt 2 till 4 skanningar. Förvärvet av flera XY plattor kan behövas för att täcka regionen av intresse, som då måste sys ihop innan bearbetning.
    4. Ta prov på hela neuron volymen, skaffa en Z-stack, meden Z spacing varierande från 150 nm till 300 nm, vilket gav 20 till 30 Z skivor.
      Obs: Den laterala rumsliga upplösningen uppnås med dessa inställningar är 234 nm och den axiella resolutionen 591 nm. Provtagningen valts här är tillräcklig, men som den axiella upplösningen är högre än den minsta storleken på de ryggar som skall avbildas, gynnar analysen ryggarna som sträcker sig i sidled från dendriterna.

    5. 3D Kvantifiering av Dendritutskotten

    Obs: Följande avsnitt beskriver särskilt användningen av Imaris programvara för analys. Alternativa implementeringar finns, inklusive NeuronStudio 15 eller metamorfa 8, som kan ge liknande resultat.

    Använd följande viktiga inställningar:

    1. Som en pre-behandlingssteg, använd Gaussisk filtrering genom bildbehandlings möjligheter som erbjuds av programmet. Utför Gaussisk filtrering via Bildbehandling> Smoosak> Gaussisk filter. Ställ in filterbredden vara lika med pixelstorleken i XY.
    2. Utför en halvautomatisk spårning av dendriter, med hjälp av glödlampor Tracer-modulen av programvaran.
      1. Först uppskatta Dendrite diameter, med hjälp av distansverktyget på fliken Skiva av programvaran.
      2. På fliken Surpass, klicka på Filaments verktyget. För en bättre robusthet, bygger detta protokoll på halvautomatisk spårning; klicka på Fortsätt automatiska skapandet. Modulen gränssnittet visar nu fliken Draw. Här väljer AutoPath som metod, Dendrite som en typ, och mata den uppskattade Dendrite diameter.
      3. Använd Välj läge för pekaren, vrida markören i en låda. Shift-högerklicka på dendritliknande utgångspunkten. Obs: programvara utför initiala beräkningar.
      4. Flytta pekaren längs Dendrite. Från startpunkten (representeraed som en blå sfär), visas en gul linje som representerar den mest sannolika Dendrite väg visas. Shift-vänsterklicka på dendritliknande slutpunkt.
    3. Utför automatiska ryggar segmentering. Anm: De taggar på den spårade dendritliknande återfinns automatiskt av modulgränssnittet.
      1. I modulgränssnittet, klicka på fliken skapelsen. I Bygg drop-listan, plocka Rebuild Dendrite Diameter och kontrollera Keep inforutan. Klicka sedan på Återskapa.
      2. Ställ tröskeln så att den segmenterade volymen motsvarar den faktiska Dendrite volymen. Som en algoritm väljer Shortest Avstånd från Avstånd Karta. Klicka på Nästa.
      3. Bestäm minsta ryggraden huvudet diameter och den maximala längden, återigen med hjälp av distansverktyget på fliken Skiva av programvaran och sedan komma tillbaka till fliken Surpass och ange parametrarna. Feller detta protokoll, värden runt 200-300 nm för minimal diameter och 4 pm för maximal längd är bra utgångspunkter. Kontrollera inte Tillåt Branch Ryggar rutan. Klicka på Nästa.
      4. Justera groddpunkter Threshold så att de blå punkter som representerar ryggar lokalisera faktiska ryggraden huvuden. Klicka på Nästa. Obs: Kärnan Beräkningen görs nu och kan ta lång tid.
    4. Klassificera ryggar genom att gå till fliken Verktyg modulens gränssnitt. Klicka på Classify ryggar. I den uppmanas användargränssnittet, se till att det finns fyra klasser, som definieras av sin morfologi enligt följande: Stubby: längd <1 pm; Svamp: Längd (rygg)> 3 och Max bredd (huvud)> menar bredd (nacken) x 2; Lång tunn: Mean bredd (huvud) ≥ Mean bredd (nacken); Filopodia-like: Längd ≤ 4 pm (inget huvud).
      Anmärkning: module gränssnitt genererar fyra nya Glödlampor objekt som innehåller resultaten av klassificeringen.
    5. Exportera Statistisk information om någon av dessa fyra gränssnitt objekt, gå till fliken Statistik.
      Klicka på Exportera all statistik till fil.
      Obs: Andra statistiska värden kan exporteras för dendriter (. T.ex. längd, område, medeldiameter, filial djup, förgreningsvinkel, volym, osv.), Och för ryggar (t.ex. rakhet, område fäst, längd och volym distinkt ryggraden delar, ryggrad diameter, täthet, osv.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Föreliggande studie beskriver ett standardiserat protokoll för ryggrad kvantifiering av odlade dendriterna i pyramidala neuron härledda från iPSC. Detta protokoll möjliggör analys av ryggraden mognad om mänskliga nervceller och dess eventuella jämförelse med mognaden av taggar i standard gnagare neuronala kulturer samt i in vivo djurmodeller.

    Figur 1A representerar ett schema för de olika stegen i kultur som medger produktion av kortikala pyramidala nervceller. En sådan schematiskt ges för att bättre förstå den globala tidsskalningen av produktionen av pyramidala nervceller utrustade med olika typer av ryggar. Omdirigering steg, dock utanför ramen för denna studie och har beskrivits på annat håll 4. Friska nervceller kan hållas i kultur upp till 65 -. 70 dagar Figur 1B visar arbetsflödet för bildframställning och 3D kvantifiering av ryggar.

    ove_content "> Figur 2A illustrerar odling av humana neuroner märkta med en anti-beta-III-tubulin-antikropp. Denna figur visar även tendensen av cellklusterbildning. Figur 2B visar en GFP-märkt pyramidala neuron av de ytliga kortikala skikt på 40 dagar efter differentiering sena kortikala stamceller (LCP).

    Figur 2C och Figur 3A visar 3D-rekonstruktion av delar av Dendritutskotten i olika skeden av mognad. Kvantitativ analys av två utvalda parametrar (ryggrad densiteter och ryggrad huvudet volym) representeras i figur 3B. Våra resultat visar att dessa två parametrar ökar under odlingsperioden som förväntat.

    Figur 1
    Figur 1. (A) Översikt över tidsplanen för neuronal diff erentiation. Denna schematisk representation beskriver de tre stegen av neuronal differentiering. Protokollet är anpassad från Boissart et al., 4. I steg 1, är human iPSC härrör i tidiga kortikala stamceller (dvs.. Tidiga neuro epitelceller från rygg telencephalon) följt av omvandling till sena kortikala stamceller (LCP). LCP förstärks sedan för cell banking i flytande kväve. I steg 2, är neural differentiering uppnås inom två veckor. Steg 3 motsvarar att upprätthålla nervceller i odling under längre perioder, för att följa ryggraden växer och progressiv mognad. Under odlingsbetingelserna, kan friska nervceller hållas upp till 65 -. 70 dagar (B) arbetsflöde av de olika stegen för avbildning och 3D kvantifiering av ryggar. (IF: immunofluorescens). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 2
    Figur 2. (A) Beta III tubulin positiva celler avslöjas av immunofluorescens med användning av samma protokoll som beskrivits, och en polyklonal anti-beta III tubulin antikropp som användes vid en utspädning av 1/1000. (B) Primär och sekundär dendritiska förgrening av en GFP -märkt pyramidala neuron odlade 40 dagar efter LCP skede. I insatsen är samma neuron representerade på en lägre förstoring med uppenbar cellkroppen. (C) 3D-rekonstruktion av två kategorier av ryggar på ett segment av en sekundär dendrit. Skala barer:. 250 m (A), 100 m (B), 40 pm (B infälld), 1,5 pm (C) Klicka här för att se en större version av denna siffra.


    Figur 3. (A) 3D rekonstruktion av Dendritutskotten (blå färg) med illustrerade segment av sekundära dendriter (grå färg), vid två olika odlingssteg (25 och 45 dagar efter differentiering från LCP). (B) Kvantitativ analys av ryggraden tätheter och morfologier med två valda parametrar såsom ryggraden densitet längs dendrit och ryggrad huvudet volym och vid två odlingsperioder. Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM av åtminstone 10 separata neuron segment erhållna från sekundära dendriter avbildas genom konfokal mikroskopi. Statistisk analys utfördes med hjälp av en Mann-Whitney-test (* p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den kvantifiering av de morfologiska egenskaperna hos pyramidala nervceller förlitat sig på programvaran. Glöd Tracer gränssnitt användes för segmentering av nervceller och ryggar, och XT-modul användes för sin analys.

    För att analysera riktigheten i vår teknik, vi först jämfört de uppmätta morfologiska parametrar (längd, area och total rygg volym i förekommande fall), med de som publicerats med hjälp av råtta mogna pyramidala nervceller i odling 6, 7 och mänskliga hjärnvävnader 3. Densiteter var jämförbara i samtliga fall. Inga volymuppgifter beskrevs i rått neuroner (en 2D analys rapporterades med den programvara som används av författarna), medan den totala ryggrad volymen minskade något jämfört med våra data, i studien av Benavides-Piccione 3 med hjälp av egna protokoll för volym rekonstruktion på utvalda ryggar. Sådana skillnader kan också förklaras av den regionala ursprung celler och det fluorescerande färgämne som används för derasmärkning.

    Vissa kritiska punkter bör betonas i våra protokoll, som främst avser tröskeldefinitioner för konfokala bildkvalitet och efterföljande kvantifieringar. Kopplingen av transduktion av en GFP-lentivirusvektor med anti-GFP-immunfluorescens säkerställer en god märkning och visualisering av hela ryggraden strukturerna. Vi kunde inte märka hela dendritiska arborization genom transfektion omprogrammerade celler med GFP vektorer och konventionella protokoll. Typiskt, 70 - är 80% omvandlas enligt våra experimentella betingelser. Denna procentandel är mycket större än vad vi observerade använder transfektion protokoll med GFP plasmider (15% av transfekterade nervceller i våra tester).

    Beroende på effektivitet och specificitet märkning kan Gaussisk filtrering eller deconvolution vara användbar som en pre-behandlingssteg för att minska bullret. Vi testade även 3D bildrekonstruktion och kvantifiering efter deconvolution. Detta förfass förväntades vara användbart eftersom, även med konfokal avbildning, deconvolution avsevärt förbättrar bildkvaliteten och begränsar oskärpa som orsakas av diffraktion. Avfaltning dock sätter en stor påfrestning på bild steget, införande av hårda spatial stickprovs i alla tre riktningar. Med optisk inställning som används i detta protokoll, den önskade pixelstorleken för deconvolution är cirka 40 nm, medan vi satt för ca 80 nm för bilderna som presenteras här. Flytta till 40 nm skulle fyrdubbla förvärvstiden och sänk fotonavkastnings pixel. Dessutom under de experimentella betingelser var ingen signifikant förbättring av segmente resultat observer jämfört med resultaten, som kan ha erhållits med Gauss filtrering. Protokollet bygger därför på denna enklare efterbehandling steg och avslappnad begränsningar Z provtagning under avbildning. Detta i sin tur minskade förvärvstiden och prov blekning.

    Glöd Tracer-modulen erbjuder ett fullt automatic segmentering. Men i denna typ av odling, nervceller är ofta täta, korsar varandra, och avbildas från en stark bakgrund. Detta påverkar negativt noggrannhet automatisk segmentering. Den halvautomatiska segmente lett till mer robusta resultat och effektiv bearbetning. Denna består av en guidad spåra dendriter från den basala kroppen av neuron, följt av en automatisk 3D segmentering av ryggar längs utvalda dendriter.

    Vår metod kan användas för att utföra tidsförlopp imaging och spela in direkt ryggraden mognad i levande nervceller från primär råtta kortikala neuroner, som beskrivits tidigare 8.

    Human iPSC-härledda nervceller har uppmärksammat av forskarna och det har förekommit de senaste försök att modellera nervsystemets sjukdomar, inklusive autismspektrumstörningar 9-14. I kortikala kretsar, Dendritutskotten spela en viktig roll i etableringen av excitatoriska synapser, men deraskvantitativ analys har dåligt dokumenterade hos människor med nervsystemets sjukdomar. Under utveckling och hela livslängd, tätheten av ryggar och deras morfologier är kritiska för anslutning av neuronala kretsar. Vid patologier med genetiska orsaker, användning av iPSC-härledda neuroner från patientbiopsier (t.ex.., Fibroblaster) kan analys av kretsar utveckling mellan neuroner som uttrycker den muterade genen (generna) som kan vara ansvarig för sjukdomstillstånd. Detta protokoll utgör en kraftfull metod för omfattande in vitro-analys av spinogenesis inom en population av muterade neuroner och jämförelse av fenotyper med omprogrammerade neuroner från kontrollindivider.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter