Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

doi: 10.3791/53197 Published: October 10, 2015

Summary

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

Abstract

Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 'de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir.

Immünofloresan bağlanmış yeşil floresan protein (GFP) teknolojisi floresan mikroskop ile omurga tespiti ve şekil ölçümü için doğru bir aracı temsil eder. Bu yaklaşım kolayca kültür nöronları için uygulanabilir. However, veriler uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) elde edilen insan nöronlar üzerinde omurga olgunlaşması ve morfoloji analizi bildirilmiştir.

Bu çalışmanın amacı, in vitro kültürlenmiş insan nöronlardan dendritik omurga görüntüleme sağlayan bir protokol, tanımlamaktır. Imaris yazılımının Filament Tracer modülü ile GFP etiketleme, konfokal mikroskopi ve 3D analiz, mevcut protokolü kullanılmıştır. II nöral kök hücrelerden IV (NSC) için katmanları kortikal nöronlar glutamaterjik elde etmek için gerekli olan kültür adımlar da burada açıklanan kısaca. İnsan MGK üretimi için tüm protokol zaten başka bir yerde 4 yayımlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Nöronal Kültür

Not: pluripotent kök hücreleri yeniden programlama Fibroblast geç kortikal atalarıdır dorsal telencephalon soy, türetme, büyütme ve bankacılık bağlılık (LCP) Boissart ark 4 tarif edildi. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşma, aynı zamanda hafif değişiklikler Boissart et al 4'e göre gerçekleştirilmiştir. Diğer prosedürler nöronlar içine farklılaşma ardından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine doğrudan fibroblastların yeniden programlama için geliştirilmiştir. O piramidal Glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verir, çünkü bu protokol muhafaza edildi.

  1. Poli-ornitin (DPBS 1/6 seyreltildi, stok konsantrasyonu% 0.01) DPBS içinde üç kez yıkanması izler O / N, cam lamelleri ile 6 oyuklu kültür plakaları tedavi edin. Daha sonra bir akış hunisi altına, en az 10 saat süre ile laminin (1 mg / ml, DPBS içinde 500 defa seyreltilmiş stok konsantrasyonu) ekleyin .
  2. Plaka ve düşük yoğunlukta NSC sevk N2 ekinin (50.000 hücre / cm2), cam DMEM / F12 oluşan kültür ortamının 3 ml lamelleri (500 mi), 2 şişeler 6 oyuklu kültür plakaları içinde (her biri 5 mi), B27 ekinin 2 şişeler (10 mL) ekstrakte edildi, Pen-Streptomisin (10 ml Penisilin = ml Streptomisin = 10.000 birim / ml 10.000 ünite /), 2-merkaptoetanol, 1 ml (stok çözeltisi: 50 mM) ve laminin (1 / 500), büyüme faktörleri olmadan. KRİTİK ADIM: Hücre kümeleme azaltmak için yavaş dönen hareketlerle hücreler ekleyerek dikkatle bu adımı uygulayın.
  3. Kültür ortamı çıkarın. Cam lameller üzerine eklenmiş nöron tutmak topaklaşmayı önlemek için taze laminin çözeltisi 2 ug / ml ihtiva eden taze ortam N2B27 ekleyin. Her 3 günde orta değiştirin. Kurutma hücre önlemek için taze ortam ilave edilmeden önce kalan ortamı (200 ul) bir kısmını muhafaza edin. Alternatif olarak, daha hızlı ilerler ve toplam hacmin (3 mi) değiştirin.
e_title "> 2. lentiviral İletimi

Not: GFP lentiviral vektörler nazik Institut Pasteur Uwe Maskos Laboratory (Paris) tarafından sağlanan ve yayınlanan bir protokolün 5'e göre hazırlandı. GFP ekspresyonu fare fosfogliserat kinaz (PGK) promoteri tarafından tahrik edilir. Bu çalışma için, bir viral titresi 400 ng / ul (PBS 1x stok çözelti) oldu.

  1. Kültür başına GFP lentiviral vektör de (6-yuvalı plakalar), 40 ng ihtiva eden stok çözeltisi 1 ul ekleyerek viral partiküllerin yolu ile olgunlaştırma herhangi bir aşamasında, insan iPSC türetilmiş nöronlar transdüksiyonu ve taze kültür ortamı içinde 48 saat süreyle inkübe edilir. Not: Bu protokol için inkübasyon süresi omurga yapılarının iyi bir etiketleme verir.

3. İmmünofloresan

Not: Bütün omurga morfolojisinin etiketleme geliştirmek için, immüno-floresan etiketlemesini permeabilize koşullarında bir anti-GFP antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

  • Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde lamelleri transduse hücreleri kültür ortamı çıkarın ve gidermek ve ardından 1 x PBS içinde (10 dk) 3 kez yıkayın.
  • PBS içinde Immerge mistery lamelleri% 0.05 Triton (100x) ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 10 at serumu ile desteklenmiş, daha sonra 1 x PBS içinde 3 kez yıkayın.
  • 1x PBS 100 ul% 4 at serumu ve primer antikor (1/1000), GFP karşı ortaya her lamel 1000 kat seyreltildi ile takviye ekleyin. Bir karanlık kutu O inkübe / N 4 ° C'de, daha sonra 1 x 3 defa PBS ile yıkayın.
  • PBS Tween 20% 0.5 ile takviye edilmiş olarak ve Alexa Fluor 488-konjuge antikor (1/200) seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Sonra 1x PBS içinde 3 kere yıkayın ve floresan mikroskobu için montaj orta ile cam slaytlar lamelleri monte edin.
  • 4. Dendritik Omurga Görüntüleme

    1. Konfokal lazer tarama mikroskobu ile konfokal Görüntüleme gerçekleştirin.
    2. Piramidal morfoloji a ile sağlıklı nöronlar seçinnd tam dendritik arborization ve ayrı deneylerden elde edilen durumda en az 10 nöronlar ölçmek. Dendritin başına 100 mikron - 60 ölçmek.
    3. 20 uW etrafında örnek düzeyinde tipik bir zirve gücü ile NA objektif 1.3 = 40X yağ ve GFP uyarma için 488 nm lazer hattı kullanarak görüntüleri edinin. 80 nm çapında belirle piksel boyutu düzgün dendritik dikenler örnek.
      Not: Gürültü dendritler ve dikenler doğru segmentasyon taviz vermeyen hangi bir görüntü için daha sonra analiz çağrısı. Yukarıda belirtilen mekansal örnekleme ve güç ayarları ile, 3.15 ms'den piksel bekleme zamanı böyle bir görüntü oluşturmak için yeterli fotonları toplamak için yeterli olduğu görülmektedir. Loş numuneler için, görüntü kalitesi 2 ila 4 tarama ortalama geliştirilebilir. Birkaç XY çini satın alma daha sonra birlikte işlemeden önce dikişli gereken ilgi bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli olabilir.
    4. Ile, Z-yığını elde, tüm nöron hacmi örnekZ 20 30 Z dilimleri, sonuçta 150 nm ila 300 nm arasında değişen aralığı.
      Not: Bu ayarlarla elde yanal uzaysal çözünürlüğü 234 nm ve eksenel çözünürlük 591 nm. Burada seçilen örnekleme yeterli olduğunu, ancak eksenel çözünürlük yansıması için dikenler küçük boyutundan büyük olduğu için, analiz dendritler yana doğru uzanan dikenleri yanadır.

    Dendritik Spine 5. 3D Niceleme

    Not: Aşağıdaki bölümlerde özel analiz için Imaris yazılım kullanımını tarif eder. Alternatif uygulamalar benzer sonuçlar sağlayabilir NeuronStudio 15 veya Metamorph 8 de dahil olmak üzere, mevcuttur.

    Aşağıdaki anahtar ayarları kullanın:

    1. Bir ön işleme aşaması olarak, yazılım tarafından sunulan görüntü işleme tesisleri ile Gauss filtreleme kullanmak. Görüntü İşleme> smoo yoluyla Gauss filtreleme gerçekleştirinşey> Gauss Filtre. XY piksel boyutuna eşit olması için filtre genişliğini ayarlayın.
    2. Yazılımın Filament Tracer modülü kullanılarak, dendritler bir yarı otomatik izleme yapın.
      1. İlk olarak, yazılım Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, dendrit çapını tahmin ediyoruz.
      2. Aşan sekmesinde, Filament aracı tıklayın. Daha iyi bir sağlamlık için bu protokol yarı otomatik izleme dayanır; Atla otomatik oluşturulması tıklayın. Modül arayüzü artık Çizim sekmesini gösteriyor. Burada, bir yöntem, bir tür olarak dendrit ve giriş tahmini dendrit çapı olarak autopath seçin.
      3. Bir kutunun içine imleç dönüm işaretçi Seç modunu kullanın. Dendrit başlangıç ​​noktasında Shift-sağ tıklayın. Not: Yazılımın ilk hesaplamalar gerçekleştirir.
      4. Dendritin boyunca hareket ettirin. Başlangıç ​​noktasından (temsilmavi küre olarak ed), büyük olasılıkla dendrit yolu temsil eden bir sarı çizgi gösterilir. Dendrit uç noktası üzerinde Shift-sol tıklayın.
    3. Otomatik dikenleri segmentasyon gerçekleştirin. Not: takip dendrit üzerindeki dikenler modül arabirimi tarafından otomatik olarak rastlanmaktadır.
      1. Modül arayüzünde, Yaratılış sekmesine tıklayın. Yeniden açılan listesinde, Dendrit Çap yeniden almak ve Tut veri kutusunu işaretleyin. Ardından yeniden tıklatın.
      2. Parçalara hacmi gerçek dendrit hacmine tekabül böylece Eşik ayarlayın. Bir Algoritma olarak. Mesafe Map Kısa Mesafe seçin İleri düğmesini tıklatın.
      3. En küçük omurga baş çapı ve maksimal uzunluğunu tespit, yine yazılımın Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, sonra tekrar Aşmak sekmesine gelip parametreleri girin. Fveya bu protokol, 200 civarında değerleri - minimal çapı 300 nm ve maksimal uzunluğu 4 mikron iyi bir başlangıç ​​noktalarıdır. İzin Şube Dikenler kutusunu kontrol etmeyin. İleri düğmesini tıklatın.
      4. Dikenler temsil mavi noktalar gerçek omurga kafaları lokalize böylece Tohum Noktaları Eşik ayarlayın. İleri düğmesini tıklatın. Not: Çekirdek hesaplaması şu anda yapılıyor ve uzun olabilir.
    4. Modül arayüzü Araçlar sekmesine giderek dikenleri sınıflandırır. Sınıflandırır Spine tıklayın. İstendiğinde kullanıcı arayüzü, aşağıdaki gibi kendi morfolojisi ile tanımlanan dört sınıfları vardır emin olun: Topaç: uzunluk <1 um; Mantar: Uzunluk (omurga)> 3 ve Max genişliği (baş)> genişliği (boyun) 2 x anlamına gelir; Uzun ince: Ortalama genişlik (kafa) ≥ ortalama genişliği (boyun); Filopodia gibi: Uzunluk ≤ 4 mikron (hiç kafa).
      Not: module arayüz sınıflandırma sonuçlarını içeren dört yeni Filament nesneleri oluşturur.
    5. İhracat Istatistiksel veriler: Bu dört nesne arayüzleri herhangi İstatistikler sekmesine gidin.
      Düğmesine Dosyaya Aktar Tüm İstatistikleri tıklayın.
      Not: Diğer istatistiksel değerler dendritler için ihraç edilebilir (.. Örneğin uzunluk, alan, vb çapı, şube derinliği, dallanma açısı, hacim, ortalama), ve dikenler (örneğin, doğruluk, bağlılık, uzunluk ve farklı hacminin alan omurga parçaları, omurga çapı, yoğunluğu vb.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Bu çalışmada IPSC türetilen piramidal nöronların kültür dendritlerin omurga ölçümü için standart bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, insan omurga nöronlar üzerinde olgunlaşma ve standart kemirgen nöronal kültürlerinde dikenler olgunlaşması ve in vivo hayvan modellerinde ile olası karşılaştırma analizine izin verir.

    Şekil 1A kortikal piramidal nöronlar üretimine izin veren farklı kültür adımların bir düzeni temsil etmektedir. Böyle şematik temsili daha iyi dikenler farklı kategorilerde sahip piramidal nöronların üretimin küresel zaman ölçekleme anlamak için sağlanmaktadır. Reprogrammation adımlar, ancak bu çalışmanın kapsamı dışındadır ve başka yerlerde 4 tarif edilmiştir. Sağlıklı nöronlar 65 kadar kültür içinde tutulabilir -. 70 gün Şekil 1B görüntüleme ve dikenler 3D nicelikleme iş akışını gösterir.

    "ove_content> Şekil 2A, bir anti-beta III tubulin antikoru ile etiketlenmiş insan nöron kültürü göstermektedir. Bu rakam aynı zamanda hücre kümelenme eğilimi göstermektedir. Şekil 2B 40 gün sonrası farklılaşma de yüzeyel kortikal katmanları bir GFP etiketli piramit nöron gösterir geç kortikal atalarıdır (LCP).

    Şekil 2C, Şekil 3A, matürasyon aşamalarında dendritik dikenler bölümlerinin 3 boyutlu yeniden göstermektedir. Seçilen iki parametrelere (omurga yoğunlukları ve omurga baş hacim) kantitatif analiz Şekil 3B temsil edilmektedir. Bu sonuçlar, beklendiği gibi, bu iki parametre, kültür süresi boyunca artış gösterir.

    figür 1
    Nöronal diff zaman ölçeği Şekil 1. (A) Genel erentiation. Bu şematik temsili nöronal farklılaşma üç adımları açıklar. Protokol Boissart ve ark., 4 uyarlanmıştır. Aşama 1 'de, insan iPSC erken kortikal progenitörlerin türetilen (yani., Dorsal telencephalon erken nöro-epitel hücreleri) geç kortikal progenitörlerin (LCP) dönüştürülmesi takip etmektedir. LCP daha sonra sıvı azot içinde hücre bankacılık güçlendirilir. Adım 2'de, nöral farklılaşma iki hafta içerisinde elde edilir. Aşama 3 artan omurga ve progresif olgunlaşmasını takip etmek amacıyla, daha uzun süreler boyunca kültür nöronları korumak için uygundur. . Kültür koşulları altında, sağlıklı nöronlar 65 kadar tutulabilir - 70 gün görüntüleme ve dikenler 3D ölçümü için farklı adımlar (B) iş akışı. (IF: immünofloresan). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" always "> Şekil 2,
    Açıklandığı gibi Şekil 2. (A) Beta III tubulin pozitif hücreler aynı protokol kullanılarak immünofloresans tarafından ortaya ve bir poliklonal anti-beta III tubulin antikoru 1 / 1.000 bir seyreltme kullandı. (B) GFP primer ve sekonder dendritik dallanma -etiketli piramidal nöron 40 gün LCP sahne sonrası kültüre. Içerlek olarak, aynı nöron belirgin hücre gövdesi ile düşük büyütme temsil edilir. Dikenler iki kategoriden (C) 3 boyutlu rekonstrüksiyon ikincil dendrit bir kesimi üzerinde. Ölçek çubukları:. 250 mikron (A), 100 mikron (B), 40 mikron (B ek), 1.5 mikron (C) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.


    İki farklı kültür evrelerinde (25 ve 45 gün LCP post-farklılaşma) ikincil dendritler (gri renk), resimli kesimleri ile dendritik dikenler (mavi renk) Şekil 3. (A) 3 boyutlu rekonstrüksiyon. (B) omurganın kantitatif analizi Böyle dendrit ve omurga baş hacmi boyunca omurga yoğunluğu gibi iki kültür dönemlerde seçilen iki parametreler ile yoğunlukları ve morfolojisi. Sonuçlar ortalama ± SEM konfokal mikroskobu ile görüntülü sekonder dendritler elde edilebilen en azından 10 farklı nöron bölümlerinin ortalama olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz Mann-Whitney testi (* p <0.05) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı.

    Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşılaştırıldı. Yoğunlukları tüm vakalarda benzerdi. Hiçbir hacimli veri hacmi yeniden inşası için kendi protokolünü kullanarak Benavides-Piccione 3 çalışmada, biraz bizim veri karşılaştırıldığında düşürülmüştür toplam omurga hacminin ise (2D analiz yazarları tarafından kullanılan yazılımla rapor edildi) sıçan nöronlar tarif edildi Seçilen dikenler üzerinde. Bu farklılıklar da kullanılan hücrelerin bölgesel kökenli ve floresan boya ile açıklanabilir onlarınetiketleme.

    Bazı kritik noktaları başta görüntü ve sonraki sayımsal konfokal kalitesi için eşik tanımlara bakın bizim protokolde, içinde altı çizilmelidir. Anti-GFP Immünofloresan bir GFP lentiviral vektör transdüksiyon birleştirilmesi, tüm omurga yapıları iyi bir etiketleme ve görselleştirme sağlar. Biz GFP vektörleri ile yeniden programlanan hücreleri transfekte tarafından geleneksel protokollerin tam dendritik arborization etiket mümkün değildi. Tipik haliyle, 70-80% deneysel koşullar altında iletilir. Böyle bir yüzdesi biz transfeksiyon GFP plazmid ile protokolleri (bizim testlerde transfekte nöronların% 15) kullanılarak gözlenen olandan daha fazladır.

    Bir ön-işleme aşaması gürültü azaltılması için etkinliği ve etiketleme özelliği ile ilgili olarak, Gaussian filtreleme veya ters evrişim yararlı olabilir. Biz de deconvolution sonra 3D görüntü rekonstrüksiyon ve miktarının test etti. Bu Process bile konfokal görüntüleme ile, dekonvolüsyon ölçüde görüntü kalitesini artırır ve limitleri kırınımıyla kaynaklanan bulanıklıkları, çünkü yararlı olması beklenmektedir. Dekonvolüsyon Ancak, her üç yönde sert mekansal örnekleme heybetli, görüntüleme adımda önemli bir yük koyar. Burada sunulan görüntüler için yaklaşık 80 nm'ye ayarlanmış ise bu protokolde kullanılan optik kurulum sayesinde, deconvolution için istenilen piksel boyutu, yaklaşık 40 nm. 40 nm taşıma edinimi süresi dörtlü ve foton verimi pikseli düşük olacaktır. Buna ek olarak, deney koşulları altında, bölütleme sonuçlarında önemli bir gelişme Gauss filtreleme ile elde edilmiştir, istenilen sonucu, karşılaştırıldığında gözlenmiştir. Protokol bu nedenle bu basit post-processing adım dayanır ve görüntüleme sırasında Z örnekleme kısıtlamaları gevşetti. Bu da zaman alıcı ve örnek ağartma azaldı.

    Filament Tracer modülü tamamen autom sunuyoratic segmentasyon. Ancak kültür bu tür, nöronlar, genellikle yoğun olduğu birbirleri üzerinde çapraz ve güçlü bir arka plan görüntülenmiş. Bu olumsuz otomatik segmentasyon doğruluğunu etkiler. Yarı otomatik segmentasyon daha sağlam sonuçlar ve verimli işleme yol açtı. Bu, seçili dendritler boyunca dikenler otomatik 3D segmentasyon ardından nöron bazal vücut dendritlerin bir rehberli izleme oluşur.

    Daha önce 8 açıklandığı gibi Bizim yöntemimiz, time-lapse görüntüleme gerçekleştirmek ve doğrudan birincil sıçan kortikal nöronların nöronlar yaşayan omurga olgunlaşmasını kaydetmek için kullanılabilir.

    İnsan iPSC türetilmiş nöronlar bilim adamlarının dikkatini çekmiştir ve otizm spektrum bozukluğu 9-14 dahil nörogelişimsel bozukluklar modellemek için son girişimler olmuştur. Kortikal devrelerde, dendritik dikenler uyarıcı sinaps kurulmasında önemli bir rol oynar, ama onlarınkantitatif analiz kötü nörogelişimsel bozukluğu olan insanlarda belgelenmiştir. Kalkınma ve yaşam boyu sırasında, dikenler yoğunlukları ve morfolojileri nöronal devrelerin bağlantısı için kritik öneme sahiptir. Genetik nedenlere sahip patolojiler, hasta biyopsilerinden iPSC türetilmiş nöronların (örn., Fibroblastlar) kullanımı hastalık durumlarında sorumlu olabilir mutasyona uğramış gen (ler) ifade nöronlar arasındaki devre geliştirme analiz sağlar. Bu protokol mutasyona uğramış nöronların ve kontrol bireylerin reprogrammed nöronlar ile fenotip karşılaştırılması nüfusu içinde spinogenesis in vitro analizinde geniş için güçlü bir yaklaşımı temsil etmektedir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
    Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
    Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
    N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
    B-27 Supplement w/o Vitamin A (50x) Gibco/ Life Technologies 12587010
    DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
    Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
    2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
    Penicillin-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
    GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
    Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
    Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
    Polyclonal Anti-betaIII tubulin Antibody Millipore AB9354
    Coverglass 13 mm VWR 631-0150
    Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
    Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
    Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
    Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
    Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
    Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
    Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17, (1), 71-84 (2013).
    2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
    3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23, (8), 1798-1810 (2013).
    4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
    5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105, (41), 15991-15996 (2008).
    6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28, (24), 6079-6091 (2008).
    7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287, (43), 35964-35974 (2012).
    8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
    9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5, (1), 26-32 (2012).
    10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
    11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33, (5), 409-417 (2014).
    12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
    13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. (2014).
    14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
    15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3, (4), e1997 (2008).
    İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).More

    Gouder, L., Tinevez, J. Y., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter