Summary
Этот протокол описывает метод препарировать, экспериментально манипулировать и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантата культуры полезны, когда высокий уровень успеха, эффективность и воспроизводимость необходимы, чтобы проверить эффекты плазмид для электропорации и / или реагентов веществ, т.е., ферментативных ингибиторов.
Abstract
Сетчатка является хорошей моделью для развития центральной нервной системы. Большой размер глаза и, самое главное доступность для экспериментальных манипуляций в яйце / в естественных условиях составляет куриный эмбриональный сетчатки универсальным и очень эффективным экспериментальной модели. Несмотря на то, сетчатке цыпленка легко цели в яйце по внутриглазных инъекций или электропорации, эффективное и точное концентрация реагентов в сетчатке может быть трудно полностью контролировать. Это может быть из-за вариаций точного места инъекции, утечки из глаза или неровной диффузии веществ. Кроме того, частота пороков развития и смертности после инвазивных манипуляций, таких как электропорация достаточно высока.
Этот протокол описывает экс ово техники для культивирования целые эксплантатов сетчатки из куриных эмбрионах и обеспечивает способ контролированной экспозиции сетчатки к реагентам. Протокол описывает, как препарировать, экспериментально манипулировать, и культура целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Эксплантаты можно культивировать в течение примерно 24 ч и подвергают различным манипуляций, таких как электропорация. Основные преимущества в том, что эксперимент не зависит от выживания эмбриона и что концентрация вводимого реагента в можно варьировать и контролировать, чтобы определить и оптимизировать эффективную концентрацию. Кроме того, метод является быстрым, дешевым и вместе с его высокой скоростью успеха экспериментальной, она обеспечивает воспроизводимость Результаты. Следует особо подчеркнуть, что он служит в качестве отличным дополнением к экспериментов, проведенных в яйце.
Introduction
Сетчатка является частью центральной нервной системы, и это, с его относительной простотой и хорошо характеризуется сотовой архитектуры, популярной модели для изучения развития центральной нервной системы. Глаз эмбриона курицы является относительно большим по сравнению с остальной частью эмбриона. Поэтому легко доступны в яйце для экспериментальных манипуляций, таких как инъекции или электропорации, и служит отличным инструментом для получения знаний о клетке сетчатки и биологии развития в естественных условиях. Несмотря на эти основные преимущества, выживание эмбрионов может быть низким, когда эксперименты являются инвазивными, такие как с electroporations, повторных инъекций, или в сочетании экспериментальных манипуляций.
Электропорация плазмид ДНК в курином эмбрионе в яйце является важным и хорошо создана методика 1. Это позволяет для маркировки нейронов, отслеживание судьбы клеток, а также нервных путей в центральной NERVПодразделения системы, и это позволяет внематочной экспрессии генов для анализа функции белка в естественных условиях. Методика была использована для изучения нервной трубки 2, 3 заднего мозга, и сетчатки 4. Электропорация эмбрионального сетчатки в яйце есть некоторые экспериментальные трудности, связанные с в естественных условиях ситуации. Положение глаз, из-за черепно-мозговой складывания эмбриона, находится относительно близко к сердцу. Эта близость повышает риск сердечного приступа следующий электропорации, и риск увеличивается с возрастом эмбрионов. Кроме того, для доступа к глаз, необходимо открыть эмбриональных мембран, тем самым увеличивая риск кровотечения, пороков развития и последующего снижения жизнеспособности. При тестировании и оптимизации новой плазмиды ДНК часто без известной фенотипической исхода, эти ограничения могут снизить эффективность и силу метода даже для опытного экспериментатора. Как представлено в настоящем протоколе, культуры шдыры сетчатки эксплантов, определяется как весь нервной сетчатки с пигментным эпителием удаляется, является эффективным методом, который дополняет в ово подхода.
Интраокулярные инъекции химических реагентов относительно легко выполнить в яйце. Тем не менее, эффективное и точное содержание вводимых реагентов в нейронном сетчатки может быть трудно полностью контролировать. Вводимый объем может изменяться из-за утечки и точное место инъекции может повлиять как на распределение реагента в глаза и распространение через стекловидное тело. Изменчивость будет иметь серьезные последствия для интерпретации результатов при т.е. кривая доза-ответ для ингибитора фермента определяется; в частности, если эффект мал и временного окна эффекта является узким. Кроме того, только один глаз может быть использовано от каждого эмбриона при выполнении экспериментов в ово-за возможных системных эффектов через кровьна противоположной глаза. Возраст соответствия важно при изучении развития и индивидуальную изменчивость между лечение и контрольных эмбрионов может привести к дополнительной экспериментальной изменчивости.
По этим причинам, экс ово методом, основанным на эксплантатов сетчатки от куриных эмбрионах был разработан, в которой нейронные сетчатки могут быть подвержены равномерной и контролируемых экспериментальных условий в пробирке. Настоящий Протокол был разработан на основе предыдущих протоколов 5-9. Эксплантатов сетчатки от стадии (й) 20 (эмбриональные дней [E] 3) ST31 (Е7) куриных эмбрионов иссекали, культивируют и электропорации с определенной концентрации плазмидной ДНК или подвергается среде, содержащей определенное концентрации химического реагента. Протокол, представленные здесь была успешно реализована в последних публикациях, используя несколько различных химических реагентов, в том числе регуляторов повреждения ДНК пути, такие, как KU55933, SB 218078 и 109555 Дито НСКsylate и клеточный цикл, таких как Cdk1 / 2 ингибитора III 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол выполняется в соответствии с рекомендациями в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Ассоциации по исследованиям в видении и офтальмологии".
1. Яйцо Обращение и сбор глаз
- Храните белые Ливорно яйца на 12-14 ° С в течение не более чем 1 недели. Если возможно, используйте охлажденный винный кулер для хранения оплодотворенных яиц.
Примечание: Более высокие температуры магазин привести к неправильному развитию эмбриона, в то время как более низкие температуры увеличивает смертность. Длительное время хранения увеличивает как смертность и аномалии развития. - Выдержите яйца в 37,5 ° C и 60% влажности яйца инкубатора с нежным качалки на частоте 5 раз в 24 часа.
- Снимите инкубационных яиц из яиц инкубатор в желаемом эмбрионального возраста.
Примечание: возраст эмбриона курицы определяется как время инкубации и обозначается как эмбриональные дней (Е) или стадии (ST), В соответствии с серией стадий развития, описанных гамбургер и Гамильтон 12. - Поместите выбранный яйца в капюшоне ламинарного потока. Протрите яичную скорлупу с 70% этанола, чтобы избежать загрязнения эмбриона.
Примечание: Провести все процедуры в асептических условиях с стерильных растворовhttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions и инструменты. - Нажмите на сторону яйца категорически против твердой поверхности, чтобы взломать яйцо. Поместите содержимое в 100 мм чашки Петри. Используйте маленькую ложку, чтобы передать зародыш в 35 мм чашки Петри, содержащей подогретого (37 ° C) 1x PBS, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
- Поместите 35 мм чашки Петри, содержащую эмбриональную ткань на бинокулярного микроскопа StereoVision рассекает в капюшоне ламинарного потока. Обезглавьте эмбрион, зажимая шею тонким пинцетом и выбросить тело.
- Используйте тонкий пинцет, чтобы сделать надрез йгрубая рот, брюшной глаза. Начиная с сайта разреза, разорвать ткань, окружающую весь глаз. Повышение от зрительного нерва и снимите неповрежденный глаз от глазницы. Сбор и левый, и правый глаз из той же эмбриона для использования в качестве либо управления или очищенных глаз.
- Используйте маленькую ложку, чтобы передать глаза на новый 35 мм чашки Петри, содержащей подогретого (37 ° C) 1x PBS.
2. Подготовка всей сетчатки эксплантов
- Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить все ткани вокруг глаз, включая склеры зачатка.
Примечание: ткань будет отсоединить легко оставив сетчатки на стекловидного тела и хрусталика с пигментным эпителием нетронутыми (1А-Б). - Используйте тонкий пинцет, чтобы зажать небольшой разрез в пигментного эпителия в спинной части глаза, не повреждая нервной сетчатки (рис 1в).
- Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно разорвать пигментного эпителия ЗАПУСКнг на месте разреза, в результате чего линзы и весь сетчатки, прикрепленный к стекловидного тела (рис 1D). Держать глаз в теплой (37 ° С) 1x PBS, чтобы облегчить удаление пигментного эпителия.
Примечание: пигментный эпителий может быть трудно удалить, в частности вдоль цилиарного тела вокруг зрачка, в передней части глаза, и вдоль сосудистой борозды. Таким образом, некоторые из пигментного эпителия могут быть оставлены на нервной сетчатки (рис 1E-F).
3. Обработка целых сетчатки эксплантов
- Электропорация целых сетчатки эксплантов
Примечание: Электропорация целых сетчатки эксплантов может быть выполнена непосредственно после шага 2.- Подготовьте культуральную среду, содержащую 1: 1 DMEM F12: питательная смесь, 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, стрептомицина 5 мкг / мл инсулина, и 2 мМ L-глутамина.
- Отрежьте 1,5 мл одноразовый пластиковый кювету (12,5 мм х 12,5 мм х 45 мм) (или любой маленький контейнер способен удерживать 300-400 мкл раствора) примерно 8 мм от нижней с помощью тонкой лезвием пилы.
- Развести плазмидной ДНК выбора в 1xDPBS до конечной концентрации 0,1 мкг / мкл.
- Включите электропоратора и заданными параметрами до 15 В для ST20 - ST25 (Е3-Е4) сетчатка и 20 В для ST26 - ST27 (E5) сетчатки. Установите импульсно-повторы до 5 импульсов 50 мс импульса длины с 1 секундными интервалами. Используйте генератор импульсов, что можно управлять с помощью ножной педали на полу, как обе руки будут необходимы, чтобы держать электроды в месте.
- Подключите два весла формы (плоские, круговые диам. 4 мм) платиновых электродов (рис 2а) к выходному разъему на генератор импульсов.
Примечание: платиновые электроды, используемые в настоящем протоколе были сделаны университета мастерской. Электроды были изготовлены из 0,1 мм платины плиты "rondelles" (платина сорта: 950 Pt / Cu 5). Соединительный 0,8 мм WiRe была изолирована с помощью пластиковых трубок. - Тщательно передать весь сетчатки эксплантов с шага 2.3 в кювете (или эквивалентного небольшой контейнер) с использованием полиэтиленовой пипетки Пастера с наконечником отрезаны приобрести правильный размер кончика открытия для сетчатки эксплантов. Избегайте использования наконечников, как сетчатка имеет тенденцию приложить к пластике и разорвать.
- Используйте 100 мкл пипетки, чтобы аккуратно удалить всю 1x PBS вокруг сетчатки эксплантов, стараясь не прикасаться к сетчатку, чтобы избежать разрывов.
- Добавить 100 мкл раствора плазмиды в кювету, чтобы покрыть всю сетчатки эксплантов. Аккуратно надавите сетчатки эксплантов щипцами, если он всплывает на поверхность. Использование щипцов или электродов для позиционирования линзы к любым одну сторону кюветы и зрительного нерва на дно кюветы.
- Поместите положительного электрода в передней части объектива и отрицательным электродом за сетчаткой (фиг.2А), не прикасаясь к ткани.
- Применить ток, нажав ножной педали. Проверьте наличие пузырьков на электродах, указывающих успешный разряд.
- Использование 100 мкл пипетки, чтобы удалить все плазмиды смесь из кюветы без повреждения сетчатки. Плазмида смесь можно использовать повторно от трех до пяти раз.
- Заполните кювету с подогретого (37 ° C) 1x PBS. Используйте пинцет, чтобы аккуратно отсоединить сетчатки эксплантов от стенки кюветы. После электропорации сетчатки иногда покрыты пузырьков, что делает его придерживаться стенку кюветы.
- Использование полиэтилена пипетки Пастера, чтобы передать весь сетчатки эксплантов в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл предварительно нагретого (37 ° С) культуральной среды на лунку. Выдержите один сетчатки эксплантов на лунку.
- Инкубируйте сетчатки эксплантов при 37 ° С на шейкере вращающей, с постоянной скоростью 50 оборотов в минуту, внутри клеток инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 часов. Вращение является обеспечение максимального воздействия на среду и Превент адгезия сетчатки к нижней части пластины 24-луночного.
- Перейдите к шагу 4.
- Обработка целых эксплантатов сетчатки химическими реагентами
Примечание: Химическая обработка целых сетчатки эксплантов может быть выполнена непосредственно после шага 2.- Подготовьте культуральную среду, содержащую 1: 1 DMEM F12: питательная смесь, 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, стрептомицина 5 мкг / мл инсулина, и 2 мМ L-глутамина.
- С помощью небольшой ложкой, чтобы передать сетчатки эксплантов с шага 2.3 в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл предварительно нагретого (37 ° С) культуральной среды на лунку. Выдержите один сетчатки эксплантов на лунку.
- Инкубируют всю сетчатки эксплантов в течение 60 мин при 37 ° С на шейкере вращающей, с постоянной скоростью 50 оборотов в минуту, внутри клеток инкубаторе с 5% CO 2 перед добавлением химического реагента или транспортное средство.
- Подготовка химического раствора, например Cdk1 / 2 ингибитора III, ингибитор М-фазы прогрессии 13, в конечнойКонцентрация 30 мкМ в ДМСО.
- Удалить пластину 24-луночный, содержащий всю сетчатки эксплантов, из клеточной инкубаторе. Добавить 10 мкл химического реагента или транспортного средства (ДМСО) непосредственно на сетчатке среды, в результате чего в конечной концентрации 300 нМ Cdk1 / 2 ингибитора III в 0,01% ДМСО. Вручную повернуть пластину 24-луночный для обеспечения равномерного распределения химического реагента или транспортного средства в растворе.
- Инкубируйте эксплантатов сетчатки при 37 ° С на шейкере вращающей, с постоянной скоростью 50 оборотов в минуту, в инкубаторе с 5% CO 2 в течение требуемого времени (до 24 ч).
- Перейдите к шагу 4.
4. Фиксация и замораживание всей сетчатки Eexplants
- Извлеките 24-луночный планшет, содержащий обработанный весь сетчатки эксплантов из клеточной инкубаторе.
- С помощью небольшой ложкой, чтобы передать сетчатки эксплантов на 24-луночный планшет, содержащий 1 мл / лунку ледяной 4% параформальдегидом в 1xPBS. Инкубаторыте на льду в течение 15 мин.
- С помощью небольшой ложкой, чтобы передать всю сетчатки эксплантов на 24-луночный планшет, содержащий 1 мл / лунку ледяные 1xPBS мыть сетчатки. Инкубируют на льду в течение 10 мин.
- С помощью небольшой ложкой, чтобы передать всю сетчатки эксплантов на 24-луночный планшет, содержащий 1 мл / лунку ледяной 30% сахарозы в 1xPBS. Инкубируют на льду в течение 1-3 ч в зависимости от дневных эмбрионов сетчатки. Для ST20 - ST25 (E3) сетчатки, инкубируют в течение 1 часа, пожилые сетчатки нужно больше времени инкубации в сахарозе.
- Используйте маленькую ложку, чтобы передать всю сетчатки эксплантов на парафиновой пленки, содержащей примерно 500 мкл криостат замерзания монтажную среду. Удалить столько сахарозы, как это возможно, осторожно перемещая сетчатки эксплантов в морозильной среды с помощью небольшого ложку.
- Передача сетчатки эксплантов до вложения формы, содержащей замораживание среду. Расположите глаза с целью облегчить будущую секционирования. Поставьте вложение формы, содержащий всю сетчатки эксплантов на ДРу льду до среды замерзла. Хранить при -80 ° С.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает подготовку (1А-F) и культивирование целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах. Этот протокол был успешно использован для целых сетчатки эксплантов из эмбрионов ST20 (E3) в ST31 (E7).
Электропорация плазмид ДНК в целом сетчатки эксплантов позволяет для маркировки и отслеживания сетчатки клеток-предшественников или избыточная экспрессия различных генных продуктов. Для экспериментах электропорации, пигментный эпителий осторожно удаляют из энуклеированного глазу ST25 (Е4 ½) эмбриона. Весь сетчатки эксплантов затем помещали в кювету, содержащую плазмидную ДНК раствор электроды были погружены (2А) и ток был применен. Через 24 часа культивировани клетки GFP позитивные были видны в большей части интактной сетчатки (Фигура 2В). После секционирования, одиночные GFP + клетки легко обнаружить по апикально-базальной оси сетчатки (Fiфигура 2С). Электропорация привело большое область сетчатки занимая плазмиды и экспрессии гена-репортера. Скорость успех, измеряется по количеству сетчатки электропорации с площадью больше, чем 1/5 от общего сетчатки, составила 75% (62 из 83) для сетчатки всей сетчатки эксплантов электропорации, по сравнению с 14% (37 из 263 глаз ) для ово электропорации в. Экспериментах электропорации на целые сетчатки эксплантов были успешно выполнены на ST20 (E3) в ST27 (E5) эмбрионов.
Целые эксплантатов сетчатки можно культивировать в течение приблизительно 24 ч (Фиг.3А и В). Более длительные сроки инкубации может привести к задержке развития, морфологические пороков, апоптоза и в конечном итоге распада сетчатки (рис 3C). При культивировании куриные сетчатки как цельные эксплантов архитектура сетчатки остается неизменным. Это включает в себя распределение различных фаз клеточного цикла вдоль апикально-BASаль ось. Во время нормального развития клетки претерпевают S-фазу на базальной стороне, а затем путем митоза на апикальной стороне сетчатки 14,15. Раздел из целого сетчатки эксплантов, культивировали в течение 24 часов, был иммунологически с фосфо-гистона 3 (PH3) антитела, маркировка клеток в конце G2 / M-фазе (рис 3D). Положительные клетки PH3 были найдены на апикальной стороне сетчатки, в соответствии с обычной развития сетчатки. Активная комплекс циклин В1-Cdk1 в ядре будет инициировать М-фазовый переход 13. Блокирование Cdk1-киназы будет препятствовать вниз поток событий, которые необходимы для распространения клеточного цикла в митоз. Стадия 29 (E6) Всего эксплантатов сетчатки инкубировали с Cdk1 / 2 Ингибитор III в течение 4 ч и PH3 иммунореактивность была проанализирована. Cdk1 / 2 ингибитор III уменьшается количество PH3 позитивных клеток (Рис 3E), что указывает на эффективную блок G2 / M-фазе перехода. Сокращение числа митозов после очистныхнт с ингибитором Cdk1 / 2 проверяется, что лечение было эффективным.
Рисунок 1. Удаление пигментного эпителия. Зачаточном день 6 (st29) курица глаз отсекали и подготовлены для культивирования в целом сетчатки эксплантов. (А) Вид переднего отдела глаза с учеником и объектив и сосудистой щели вниз. Пигмент эпителий нетронутой, но склеры зачаток и окружающих соединительной ткани была удалена. (Б) Вид на задней части глаза. Зрительный выхода нерва и сосудистой оболочки трещины должны быть обращены вниз. (С) разрез в пигментном эпителии. (D) Большая часть пигментного эпителия была удалена. (Е) Некоторые пигментный эпителий оставлен на по окружности цилиарного тела и ( F) сосудистой оболочки трещина. LE: объектив и цилиарного тела, CF:сосудистое трещина, ПО: зрительного нерва выхода. Масштаб бар 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. электропорации целых эксплантатов сетчатки. (А) Схематическое представление платиновыми электродами и как они расположены по обе стороны от всей сетчатки эксплантов, которая погружена в раствор ДНК плазмиды в усеченной кювете. (В) Всего сетчатки эксплантов после 24 ч культивирования, и (С) срезы сетчатки. ВКЛ: выход зрительного нерва. Масштаб бар (А) 4 мм, (B), 0,5 мм (С) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше ве rsion этой фигуры.
Рисунок 3. Культивируемые целые эксплантатов сетчатки фиксировали, заморожены, cryosectioned, и помечены с помощью иммуногистохимии. (А) st29 весь сетчатки эксплантов культивировали в течение 24 часов. Флуоресцентные микрофотографии ядерного окрашивания после (б) 24 ч и (с) 48 ч. (Г) PH3 антитела были использованы в клетках этикеток в конце G2 / M-фазе. (Е) Относительная плотность (PH3 + клеток / мм 2, значит ± SD) и флуоресценции микрофотографии PH3 + клеток в st29 после Cdk1 / 2 ингибитор III лечение в течение 4 часов по сравнению с транспортного средства. ул: гамбургер и Гамильтон стадии, т-тест Стьюдента, ** р <0,01, п ≥ 4, обработанные глаза, 4 секции в глаза, ч: часы. Масштаб бар (А) 0,5 мм, (BE) 10 мкм.jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе подробно протокол для вскрытия, электропорации или химической обработки, и культивирования целых сетчатки эксплантов из куриных эмбрионах представлена. Этот протокол является простым, быстрым и позволяет как для высокой скорости успеха и воспроизводимость Результаты.
Электропорации целых эксплантатов сетчатки производит большие участки клеток, которые экспрессируют генную конструкцию интереса. Легко правильно расположить электроды и подвергать определенную часть сетчатки к определенной концентрации ДНК плазмиды. Такой подход позволяет для надежного метода для исследования функции генов в сетчатке с типично высокой скоростью успеха по сравнению с electroporations в яйце. Весь сетчатки эксплантов также делает возможным подвергать сетчатку к среде, содержащей определенную концентрацию химического реагента, давая равномерное распределение реагента в нервной сетчатки. Протокол позволяет комбинированныйлечение, при котором сетчатка сначала электропорации, а затем обрабатывают веществ. Влияние изменчивости между отдельными эмбрионами может быть сведено к минимуму, так как и лечение и контроль глаз может быть собрана из того же эмбриона и лечиться самостоятельно.
Протокол был оптимизирован для целых сетчатки эксплантов из ST20 (E3) в ST27 (E5) эмбрионы для электропорации и ST20 (E3) в ST31 (E7) эмбрионов для лечения химической субстанции. В младшей ступени сетчатки / оптические чашки слишком маленьким и хрупким, чтобы эффективно обрабатывать и в ово электропорации, скорее всего, более эффективными. Electroporations на целых сетчатки эксплантов не было выполнено на этапах старше ST27 (E5). Это, скорее всего, можно адаптировать этот протокол для эксплантов из старых эмбрионов. Это будет включать получение большего кювет, большие ямы для инкубации и увеличение объема сетчатки культуральной среде. Однако, E12-14 пигментный эпителий и наружный сегментфоторецепторов клетки становятся тесно связаны, и удаление пигментного эпителия может привести к повреждению сетчатки. Сетчатка должны быть неповрежденными в течение всего экспериментальной процедуры и инкубации.
С этой вскрытия и протокол культивирования, структурная целостность сетчатки архитектуры остается неизменным во 24 ч, основанный на экспрессии специфических маркеров типа клеток. Как уже упоминалось, мы изучили прогрессию клеточного цикла в эксплантов и процесс интеркинетического ядерной миграции клеток сетчатки предшественников выглядит нормально. Если протокол выполняется быстро есть только небольшие эффекты на эволюционного развития в эксплантата. Однако развитие может быть слегка замедляется и эксплантов, который культивировали в течение 24 часов, могут проявлять возраста с развитием, который 1-2 ч моложе нормального аналога. Рекомендуется сравнить эксплантов в возрастной соответствием нормальной сетчатки и рекомендуется использовать контралатеральной глаз в качестве экспериментальной взрывающаясямуравьёв. Следует отметить, что удаление пигментного эпителия сетчатки могут повлиять на развитие наружных сегментов фоторецепторов. Следует также отметить, что эксплант сетчатки представляет собой поврежденную сетчатку с аксотомизированных ганглиозных клеток сетчатки.
Этот протокол является простым и, следовательно, снижает экспериментальные ошибки, но экс ово ситуации требует несколько экспериментальных управления. Конкретный процесс развития, что является предметом для изучения с помощью этого экс ово протокол также может быть изучен параллельно и быть по сравнению с нормальной в ово ситуации. Соответствующие экспериментальные управления всегда должны быть включены, например, транспортных средств, используемых для солюбилизации вещества. При использовании сигнального пути блокаторы, использовать несколько различных ингибиторов для того же процесса или использовать различные ингибиторы, которые целевого фермента на более чем одном уровне конкретного пути, который изучается. Для электропорации, А GFP-выразив плазмиды ДНК СПРАВОЧНИКса положительный контроль. Если такой плазмиды не производит экспрессию гена репортера, это, скорее всего, благодаря тому, что анод (+) и катод (-) неправильно позиционируется. Плазмидную ДНК затем мигрируют от сетчатки. При тестировании новых ДНК-плазмиды поэтому рекомендуется включать плазмиды ДНК, который выражает различные флуоресцентный белок в качестве внутреннего контроля для электропорации. Параметры электропорации, описанные в данном протоколе были оптимизированы для получения высокой количество гена-репортера клеток, экспрессирующих. Уменьшение напряжения или количества импульсов уменьшает количество трансфицированных клеток, которые могут дать ложные отрицательные результаты. Однако увеличение напряжения или количества импульсов может привести к повреждению ткани и увеличение гибели клеток. Три комплекта пользовательских сделал платиновыми электродами были использованы для всех electroporations в течение более чем двух лет, не показывая никакого пониженную емкость. Электроды должны быть тщательно очищены и электрод Surfacе отполировать. Коммерческие 4 мм весло электродов имеются.
Этот протокол фокусируется на электропорации ДНК плазмид и химической обработки целых эксплантатов сетчатки. Можно еще больше расширить этот протокол, чтобы включить другие экспериментальные процедуры, такие как нокдаун экспрессии генов с использованием морфолино олигомеры. Вся процедура сетчатки эксплантов открывает для возможности выполнения краткосрочных экспериментов в легкой, быстрой и высокой воспроизводимостью образом. Это снижает затраты, время и количество животных, необходимых для каждого эксперимента и, самое главное это увеличивает возможность получить надежные данные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
