Summary
Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos.
Abstract
A retina é um bom modelo para o sistema nervoso central em desenvolvimento. O grande tamanho do olho e, mais importante a acessibilidade para manipulações experimentais em ovo / in vivo torna o frango retina embrionária um modelo experimental versátil e muito eficiente. Embora a retina da galinha é fácil de atingir in ovo por injecções intra-oculares ou electroporação, e a concentração eficaz exacta dos reagentes no interior da retina pode ser difícil de controlar totalmente. Isto pode ser devido a variações do local da injecção exacta, vazamento a partir do olho ou difusão desigual das substâncias. Além disso, a frequência de malformações e mortalidade após manipulações invasivos, tais como electroporação é bastante elevada.
Este protocolo descreve uma técnica ex ovo para a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha e proporciona um método para a exposição controlada da retina para reagentes. O protocol descreve como dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura inteiros a partir de embriões de galinha. Os explantes podem ser cultivados durante cerca de 24 horas e ser submetidos a manipulações diferentes, tais como electroporação. As principais vantagens são que a experiência não é dependente a sobrevivência do embrião e que a concentração do reagente introduzido pode ser variado e controlado, a fim de determinar e optimizar a concentração eficaz. Além disso, a técnica é rápida, barata e juntamente com a sua elevada taxa de sucesso experimental, que garante reprodutível resultados. Deve-se ressaltar que ele serve como um excelente complemento para experimentos realizados in ovo.
Introduction
A retina é parte do sistema nervoso central e é, com a sua relativa simplicidade e arquitetura celular bem caracterizada, um modelo popular para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso central. O olho de embrião de galinha é relativamente grande em comparação com o resto do embrião. É, portanto, facilmente acessível in ovo para manipulações experimentais, tais como injecções ou eletroporação, e serve como uma ferramenta excelente para adquirir conhecimento sobre células da retina e biologia do desenvolvimento in vivo. Apesar destas vantagens principais, a sobrevivência dos embriões pode ser baixo quando as experiências são invasivos, como com electroporations, injeções repetidas, ou manipulações experimentais combinados.
A electroporação de plasmídeos de ADN para o embrião de galinha in ovo é uma técnica importante e bem estabelecido 1. Ela permite a marcação de neurónios, o rastreio de destino celular, bem como vias neuronais no centro nervous sistema e que permite a expressão ectópica de genes para analisar a função da proteína in vivo. A técnica tem sido utilizada para estudos de tubo neural 2, rombencéfalo 3, 4 e da retina. Eletroporação de retina embrionária in ovo tem algumas dificuldades experimentais que estão relacionados com a situação in vivo. A posição do olho, devido à dobragem cranial do embrião, é relativamente perto do coração. Esta proximidade aumenta o risco de paragem cardíaca após a electroporação, e o risco aumenta com a idade do embrião. Além disso, para aceder ao olho, que é necessário para abrir as membranas embrionárias, aumentando assim o risco de sangramento, malformações e subsequente viabilidade reduzida. Ao testar e otimizar um novo plasmídeo DNA, muitas vezes sem um resultado fenotípico conhecido, as limitações podem diminuir a eficácia e poder do método, mesmo para um experimentalista experiente. Conforme apresentado neste protocolo, a cultura do wfuro explante da retina, definida como toda a retina neural com o epitélio pigmentar removido, é um método eficiente em que complementa a abordagem in ovo.
Injecções intra-ocular de reagentes químicos são relativamente fáceis de executar in ovo. No entanto, a concentração eficaz e exacta de reagentes injectados dentro da retina neural pode ser difícil de controlar totalmente. O volume injectado pode variar devido a fugas e o local exacto de injecção podem afetar tanto a distribuição do reagente no interior do olho e a difusão através do corpo vítreo. A variabilidade terá grandes implicações para a interpretação dos resultados, quando isto é, uma curva dose-resposta para um inibidor da enzima é determinada; particularmente se o efeito é pequeno e a janela temporal do efeito é estreita. Além disso, apenas um único olho pode ser usado de cada embrião quando realizando experiências in ovo devido a possíveis efeitos sistémicos através da corrente sanguíneapara o olho contralateral. Combinando a idade é importante quando se estuda o desenvolvimento ea variabilidade individual entre tratados e embriões de controle pode levar a variabilidade experimental adicional.
Por estas razões, um ex ovo método baseado em explantes de retina de embriões de galinha foi desenvolvido, em que a retina neural pode ser exposto a uma uniforme e controlada condição experimental in vitro. O presente protocolo foi desenvolvido com base em protocolos anteriores 5-9. Explantes de retina de fase (ST) 20 (dias embrionárias [E] 3) para ST31 (E7) embriões de galinha foram dissecadas, e cultivadas a electroporação com um plasmídeo de ADN definida concentração ou expostos a um meio contendo uma concentração definida de um reagente químico. O protocolo apresentado aqui foi implementado com sucesso em publicações recentes, usando vários reagentes químicos diferentes, incluindo reguladores da via danos no DNA, tais como KU55933, SB 218078, 109555 e NSC ditosylate, e o ciclo celular, tais como Cdk1 / 2 inibidor III 10,11.
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Protocol
Este protocolo é realizada de acordo com as recomendações contidas no "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia".
1. Egg Manuseio e coleção dos olhos
- Armazenar ovos brancos Leghorn em 12-14 ° C durante não mais de uma semana. Se possível, use um refrigerador de vinho refrigerado para armazenar os ovos fertilizados.
Nota: temperaturas mais elevadas armazenar levar ao desenvolvimento anormal dos embriões, enquanto temperaturas mais baixas aumenta a mortalidade. Tempo de armazenamento prolongado aumenta a mortalidade e desenvolvimento anormal. - Incubar os ovos em uma de 37,5 ° C e 60% incubadora de ovos umidificado com balanço delicado a uma frequência de 5 vezes por 24 horas.
- Remover os ovos incubados na incubadora de ovos com a idade embrionária pretendida.
Nota: A idade do embrião de galinha é determinada como o tempo de incubação e é denotado como dia embrionário (E) ou como fases (r), De acordo com a série de estágios de desenvolvimento descritas por Hamburger e Hamilton 12. - Coloque os ovos selecionados na capela de fluxo laminar. Limpar a casca de ovo com 70% de etanol para evitar a contaminação do embrião.
Nota: Realizar todos os procedimentos sob condições assépticas com soluções estéreishttp://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions e instrumentos. - Toque no lado do ovo firmemente contra uma superfície dura para rachar o ovo. Coloque o conteúdo em uma placa de Petri de 100 milímetros. Utilize uma pequena colher a transferência do embrião para um prato de 35 mm de Petri contendo pré-aquecido (37 ° C) 1x PBS para evitar que o tecido de secagem.
- Coloque o prato de 35 milímetros Petri contendo o tecido embrionário em um microscópio binocular de dissecação estereovisão na capela de fluxo laminar. Decapitar o embrião por beliscar o pescoço com uma pinça fina e descartar o corpo.
- Use uma pinça fina para fazer uma incisão tháspero boca, ventral para o olho. Começando no local da incisão, rasgar o tecido circundante o olho inteiro. Beliscar fora do nervo óptico e remover o olho intacto de cavidade ocular. Recolha tanto o olho esquerdo e direito do mesmo embrião para o uso como o controle ou o olho tratado.
- Utilize uma pequena colher para transferir os olhos para uma nova placa de Petri 35 mm contendo pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x.
2. Preparação de explantes de retina inteiras
- Use uma pinça fina para remover todo o tecido em volta do olho incluindo a anlage escleral.
Nota: O tecido irá separar facilmente deixando a retina no corpo vítreo e a lente com o epitélio pigmentar intacta (Figura 1A-B). - Utilize uma pinça fina para comprimir uma pequena incisão no epitélio pigmentado na parte dorsal do olho sem danificar a retina neural (Figura 1C).
- Utilize uma pinça fina para rasgar suavemente abrir o epitélio pigmentar starting no local da incisão, deixando a lente e a retina inteira ligada ao corpo vítreo (Figura 1D). Manter o olho em água morna (37 ° C) 1x PBS para facilitar a remoção do epitélio de pigmento.
Nota: O epitélio do pigmento podem ser difíceis de remover, em particular ao longo do corpo ciliar em torno da pupila, na região anterior do olho, e ao longo da fissura coróide. Portanto, alguns do epitélio de pigmento pode ser deixada sobre a retina neural (Figura 1E-F).
3. Tratamento de toda retinianas explantes
- A electroporação de explantes de retina inteiras
Nota: A electroporação de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2.- Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina.
- Cortar um 1,5 ml cuvette de plástico descartável (12,5 mm x 12,5 milímetros x 45 mm) (ou qualquer recipiente pequeno capaz de conter uma solução de 300-400 uL) de aproximadamente 8 mm a partir do fundo usando uma serra de lâminas finas.
- Dilui-se o plasmídeo de ADN de escolha em 1xDPBS a uma concentração final de 0,1 ug / ul.
- Ligue os parâmetros electroporador e definido para 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V para ST26 - st27 (E5) retina. Defina as Pulso-repetições para 5 pulsos de 50 ms de pulso de comprimento com intervalos de 1 segundo. Usar um gerador de impulsos que pode ser controlada por um pedal de pé sobre o chão, como será necessário duas mãos para segurar os eléctrodos no lugar.
- Conecte dois pá em forma (flat, diam circular. 4 mm) eletrodos de platina (Figura 2A) à tomada de saída no gerador de impulsos.
Nota: Os eletrodos de platina utilizados neste protocolo foram feitas pela oficina da universidade. Os eléctrodos foram feitos a partir de 0,1 mm placa de platina "rondelles" (grau de platina: Pt 950 / Cu 5). O conectando 0,8 milímetros wire foi isolada usando tubos de plástico. - Transferir cuidadosamente todo o explante de retina a partir do passo 2.3 para a tina (ou pequeno recipiente equivalente) usando uma pipeta de Pasteur de polietileno com a ponta cortada para adquirir o tamanho da ponta de abertura certo para o explante de retina. Evite o uso de pontas de pipeta como a retina tende a anexar ao plástico e rasgar.
- Use uma pipeta de 100 mL para remover suavemente toda a 1x PBS em torno do explante retina tomando cuidado para não tocar na retina para evitar rasgar.
- Adicionar 100 ul de solução de plasmídeo para a cuvete para cobrir todo o explante da retina. Pressione cuidadosamente o explante de retina com uma pinça se ele flutua para cima. Use uma pinça ou eléctrodos para posicionar a lente para uma face lateral da cuvete e do nervo óptico qualquer para o fundo da tina.
- Colocar o eléctrodo positivo em frente da lente e o eléctrodo negativo atrás da retina (Figura 2A), sem tocar no tecido.
- Aplique o atual pressionando para baixo o pé-pedal. Verifique se há bolhas nos eletrodos indicando descarga bem sucedido.
- Usar uma pipeta de 100 uL para remover toda a mistura de plasmídeo a partir da cuvete sem danificar a retina. A mistura de plasmídeo pode ser reutilizada de três a cinco vezes.
- Encha-se a cuvete com pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x. Utilize uma pinça para separar suavemente o explante da retina a partir da parede da cuvete. Após a electroporação, por vezes, a retina está coberta com bolhas, o que torna aderir à parede da cuvete.
- Utilizar a pipeta de Pasteur de polietileno para transferir toda a retina explante em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço.
- Incubar o explante da retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO 2 durante 24 horas. A rotação é garantir o máximo de exposição ao meio e prevent adesão da retina para o fundo da placa de 24 poços.
- Vá para a etapa 4.
- O tratamento de explantes de retina inteiras com reagentes químicos
Nota: O tratamento químico de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2.- Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina.
- Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina a partir do passo 2.3 em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço.
- Incubar todo o explante de retina durante 60 minutos a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO2 antes da adição de um reagente químico ou veículo.
- Preparar a solução química, por exemplo Cdk1 / 2 inibidor III, um inibidor da progressão da fase M 13, no final de umconcentração de 30 uM em DMSO.
- Remova a placa de 24 poços, contendo todo o explante da retina, da incubadora celular. Adicionam-se 10 ul do reagente químico ou o veículo (DMSO) directamente ao meio da retina, o que resulta numa concentração final de 300 nM Cdk1 / 2 inibidor III em 0,01% de DMSO. Rodar manualmente a placa de 24 poços para permitir uma distribuição uniforme do reagente químico ou veículo na solução.
- Incubar os explantes de retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, dentro de uma incubadora com 5% de CO 2 durante o tempo desejado (até 24 horas).
- Vá para a etapa 4.
4. Fixação e Congelamento de Whole Retinal Eexplants
- Remova a placa de 24 poços, que contém todo o explante da retina tratadas da incubadora celular.
- Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio paraformaldeído a 4% em 1xPBS. Incubate em gelo durante 15 min.
- Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 mL / poço 1xPBS geladas para lavar a retina. Incubar em gelo durante 10 min.
- Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio de sacarose a 30% em 1xPBS. Incubar em gelo durante 1-3 horas dependendo do dia embrionário da retina. Para ST20 - ST25 (E3) as retinas, incubar durante 1 hora, as retinas idosos necessitam de mais tempo de incubação em sacarose.
- Use uma colher pequena para transferir todo o explante de retina para uma película de parafina contendo cerca de 500 ul congelamento cryostat meio de montagem. Remover o máximo possível de sacarose como movendo-se delicadamente o explante da retina no meio de congelamento, utilizando a pequena colher.
- Transferir o explante da retina para um molde contendo a incorporação de meio de congelação. Posicione o olho para facilitar futuro seccionamento. Coloque o molde contendo a incorporação de todo o explante de retina no dry gelo até o meio é congelado. Armazenar a -80 ° C.
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Representative Results
Este protocolo descreve a preparação (Figura 1A-M) e a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha. Este protocolo foi usado com sucesso para a retina a partir de explantes de embriões inteiros de ST20 (E3) para ST31 (E7).
Eletroporação de plasmídeos de DNA em explantes de retina inteiras permite a rotulagem e rastreamento de células progenitoras da retina ou a sobre-expressão de diferentes produtos de genes. Para as experiências de electroporação, o epitélio de pigmento foi cuidadosamente removida do olho enucleado de um ST25 (E4 ½) embrião. Todo o explante da retina foi então colocada numa cuvete contendo a solução de DNA do plasmídeo, foram submersos os eléctrodos (Figura 2A) e uma corrente foi aplicada. Após 24 h de cultura, as células positivas para GFP foram visíveis em uma grande parte da retina intacta (Figura 2B). Após o corte, as células individuais GFP + foram facilmente detectados ao longo do eixo apico-basal da retina (Fifigura 2C). A electroporação resultou numa grande área da retina, tendo-se o plasmídeo e expressando o gene repórter. A taxa de sucesso, medida pelo número de retinas com uma área maior do que a electroporação 1/5 da retina total foi de 75% (62 de 83) para o conjunto retinas electroporação explante da retina, em comparação com 14% (37 de 263 olhos ) por electroporação em ovo. Experiências de electroporação em explantes de retina inteiras foram realizados com sucesso em ST20 (E3) para st27 (E5) embriões.
Os explantes de retina inteiras podem ser cultivadas durante cerca de 24 h (Figura 3A e B). Tempos de incubação mais longos podem conduzir a um atraso no desenvolvimento, malformações morfológicas, apoptose e, eventualmente, a desintegração da retina (Figura 3C). Quando a cultura das retinas de galinha como explantes de toda a arquitectura da retina permanece intacta. Isto inclui a distribuição das diferentes fases do ciclo celular ao longo das apico-baseixo ai. Durante o desenvolvimento normal, as células sofrem a fase S do lado da base, seguido por mitose no lado apical da retina 14,15. Uma secção de um explante de retina inteira, cultivadas durante 24 h, foi imunocoradas com um 3 (PH3) anticorpo fosfo-Histona, marcação das células no final de G2 / M-fase (Figura 3D). As células positivas foram PH3 encontrado no lado apical da retina, consistente com o desenvolvimento normal da retina. Um complexo de ciclina B1-Cdk1 activo no núcleo vai iniciar a fase de transição M-13. O bloqueio da actividade de Cdk1-cinase irá inibir eventos a jusante que são necessárias para a propagação do ciclo celular na mitose. Fase 29 (E6) inteiros explantes de retina foram incubados com o Cdk1 / 2 Inibidor III durante 4 horas e PH3 imunorreactividade foi analisada. O Cdk1 / inibidor III 2 reduziu o número de células positivas PH3 (Figura 3E), indicando um bloqueio eficiente de transição G2 / M-fase. A redução do número de mitoses após tratamenNT com o inibidor de Cdk1 / 2 verificou-se que o tratamento era eficaz.
Figura 1. A remoção do epitélio pigmentar. Um dia embrionário 6 (st29) frango olho foi dissecado e preparado para a cultura como explante retina todo. (A) Vista do olho anterior com a pupila ea lente ea fissura coróide voltado para baixo. O epitélio do pigmento está intacta, mas a Anlage escleral e tecido conjuntivo circundante foi retirado. (B) vista da parte posterior do olho. A saída do nervo óptico e fissura coróide está voltado para baixo. (C) A incisão no epitélio de pigmento. (D) A maior parte do epitélio do pigmento foi removido. (E) Alguns epitélio pigmentar é deixado no ao longo do bordo do corpo ciliar e ( F) a fissura coróide. LE: Lente e corpo ciliar, CF:fissura coróide, ON: saída do nervo óptico. Barra de escala é de 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A electroporação de explantes de retina inteiras. (A) Representação esquemática dos eléctrodos de platina e como eles são posicionados em ambos os lados de toda a retina explante que está submerso na solução de DNA do plasmídeo presente na célula truncado. (B) de explantes de retina inteira depois 24 h de cultura, e (C) segmentado retina. ON: saída do nervo óptico. Barra de escala é (A) 4 mm, (B) 0,5 mm, (C) 50 um. Por favor clique aqui para ver uma maior ve rsion desta figura.
Figura 3. cultivadas explantes de retina inteiras foram fixadas, congelados, criosseccionada, e marcado por imuno-histoquímica. (A) Um conjunto de explantes de retina st29 cultivadas durante 24 h. Micrografias de fluorescência de coloração nuclear após (B) 24 horas e (C) 48 horas (D). Um anticorpo PH3 foi usada para células de etiqueta no final de G2 / M de fase (E). A densidade relativa (PH3 + células / mm 2, média ± DP) e de fluorescência de células micrografias + PH3 em st29 após Cdk1 / 2 inibidor III tratamento durante 4 horas em comparação com veículo. st: Hamburger e estágios Hamilton, t de Student, ** p <0,01, n ≥ 4 olhos tratados, 4 secções por olho, h: horas. A barra de escala é (a) 0,5 mm, (BE) 10 uM."target =" _ blank jove.com/files/ftp_upload/53202/53202fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste trabalho, um protocolo detalhado para dissecção, eletroporação ou tratamento químico, e cultivo de explantes de retina inteiras de embriões de galinha é apresentado. Este protocolo é fácil, rápido e permite tanto uma elevada taxa de sucesso e reprodutível resultados.
A electroporação de explantes de retina inteiros produz grandes áreas de células que expressam a construção de gene de interesse. É fácil de posicionar correctamente os eléctrodos e para expor uma porção especifica da retina a uma concentração de ADN de plasmídeo definido. Esta abordagem permite a um método fiável para investigar a função do gene na retina, com uma taxa de sucesso tipicamente mais elevado em comparação com electroporações in ovo. Todo o explante da retina também faz com que seja possível para expor a retina para um meio contendo uma concentração definida de um reagente químico que dá uma distribuição uniforme do reagente na retina neural. O protocolo permite combinadotratamentos em que a retina é electroporadas em primeiro lugar e, em seguida, tratada com substâncias. A influência da variabilidade entre os embriões individuais podem ser minimizados, uma vez que tanto o olho tratado e controle podem ser coletadas a partir do mesmo embrião e ser tratada de forma independente.
O protocolo foi otimizado para explantes de retina inteiras de ST20 (E3) para st27 (E5) embriões para eletroporação e ST20 (E3) para ST31 (E7) embriões para o tratamento de substância química. Em estágios mais jovem a retina / cálice óptico é muito pequeno e frágil para lidar de forma eficaz ea eletroporação in ovo é provavelmente mais eficiente. Electroporations em explantes de retina inteiras não foi realizada em estágios mais velhos do que st27 (E5). É provável possível adaptar este protocolo para explantes de embriões mais velhos. Isso incluiria a obtenção de maiores cuvetes, poços maiores para incubação e aumento do volume de meio de cultura de retina. No entanto, por E12-14 o epitélio de pigmento e o segmento exterior docélulas fotorreceptoras tornar-se estreitamente associada, e a remoção do epitélio de pigmento pode danificar a retina. A retina deve estar intacto durante todo o procedimento experimental e de incubação.
Com este protocolo de cultura e dissecção, a integridade estrutural da arquitectura da retina permanece intacto durante 24 hr, com base na expressão de marcadores específicos de tipos de células. Como mencionado, nós estudamos a progressão do ciclo celular nos explantes e o processo de migração nuclear interkinetic de células progenitoras da retina parece normal. Se o protocolo é realizada rapidamente existem apenas pequenos efeitos sobre a progressão do desenvolvimento do explante. No entanto, o desenvolvimento pode ser ligeiramente desacelerado e um explante que foi cultivado durante 24 horas pode apresentar uma idade de desenvolvimento que é de 1-2 horas mais jovem do que a contrapartida normal. Aconselha-se a comparar o explante a mesma idade retina normal e é aconselhado a usar o olho contralateral como expl experimentalcontrole de formigas. Deve salientar-se que a remoção do epitélio pigmentar da retina podem afectar o desenvolvimento de segmentos externos de fotorreceptores. Também deve ser salientado que uma retina explante representa uma retina lesionada com células ganglionares da retina sujeitos a axotomia.
Este protocolo é simples e, portanto, reduz os erros experimentais, mas o ex ovo situação exige vários controles experimentais. Um processo de desenvolvimento específico que está sujeita a ser estudada utilizando este protocolo ex ovo podem também ser estudada em paralelo e ser comparada com a situação normal no ovo. Os controlos experimentais apropriados devem ser sempre incluídos, tais como veículos utilizados para solubilizar substâncias. Ao usar bloqueadores da via de sinal, usar vários inibidores diferentes para o mesmo processo ou usar diferentes inibidores que têm como alvo enzimas em mais de um nível da via específica que é estudada. Para a electroporação, um plasmídeo de ADN que expressa GFP é uma útilcontrole positivo sa. Se tal plasmídeo não produz qualquer expressão do gene repórter, é mais provável devido ao facto de o ânodo (+) e do cátodo (-) estão posicionadas de forma incorrecta. O plasmídeo de ADN será então migrar para longe da retina. Ao testar novos plasmídeos de ADN é, por conseguinte, recomenda-se incluir um plasmídeo de ADN que expressa uma proteína fluorescente diferente como um controlo interno electroporação. Os parâmetros eletroporação descritos neste protocolo foram optimizados para produzir um número elevado de gene repórter células que expressam. Diminuindo a tensão ou o número de pulsos reduz o número de células transf ectadas, o que pode produzir resultados falsos negativos. No entanto, o aumento da tensão ou o número de impulsos pode levar a lesão do tecido e aumento da morte celular. Três conjuntos de mercadorias feitas eléctrodos de platina foram usadas para todos os electroporações durante mais de dois anos sem mostrar qualquer capacidade reduzida. Os eletrodos devem ser cuidadosamente limpos e o surfac eletrodoe ser polido. Comercial 4 mm eletrodos de remo estão disponíveis.
Este protocolo de electroporação concentra-se em plasmídeos de ADN e do tratamento químico de explantes de retina inteiras. É possível expandir ainda mais este protocolo de modo a incluir outros procedimentos experimentais, tais como um knock-down da expressão do gene com a utilização de oligómeros de morfolino. O procedimento de explantes de retina inteira abre a possibilidade de realizar experimentos de curto prazo de uma forma fácil, rápida e altamente reprodutível. Reduz os custos, o tempo eo número de animais necessários para cada experimento e, mais importante, aumenta a possibilidade de obter dados sólidos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4,000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
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