Caspase-3 activiteit in het Rat Amygdala Gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct

Abstract

Myocardinfarct (MI) heeft dramatische middellange en lange termijn gevolgen van de fysiologische en gedragsmatige niveau, maar de betrokken mechanismen zijn nog onduidelijk. Ons laboratorium heeft een rattenmodel van post-MI syndroom dat verminderde hartfunctie, neuronaal verlies in het limbische systeem, cognitieve stoornissen en gedragsmatige tekenen van depressie wordt ontwikkeld. Op neuronaal niveau, caspase-3 activatie bemiddelt post-MI apoptose in verschillende limbische gebieden, zoals de amygdala - piek op 3 dagen na MI. Cognitieve en gedragsmatige stoornissen lijken 2-3 weken na MI en deze correleren statistisch met de maatregelen van caspase-3-activiteit. De hier beschreven protocol wordt gebruikt om MI induceren verzamelen amygdala weefsel en meet caspase-3 activiteit met spectrofluorimetrie. MI induceren, wordt de dalende kransslagader afgesloten gedurende 40 min. Het protocol voor de evaluatie van caspase-3 activatie begint 3 dagen na MI: de ratten opgeofferd en de amygdala geïsoleerde rapiDly uit de hersenen. De monsters worden snel bevroren in vloeibare stikstof en bij -80 ° C bewaard tot werkelijke analyse. De techniek uitgevoerd voor caspase-3 activatie beoordelen op basis van splitsing van een substraat (DEVD-AMC) van caspase-3, die een fluorogene verbinding die kan worden gemeten door spectrofluorimetrie vrijgeeft. De methodologie kwantitatieve en reproduceerbare maar de vereiste apparatuur duur en de procedure voor het kwantificeren van de monsters tijdrovend. Deze techniek kan worden toegepast op andere weefsels, zoals het hart en de nieren. DEVD-AMC kan worden vervangen door andere substraten op de activiteit van andere caspasen meten.

Introduction

Caspasen of Cysteine-afhankelijke-aspartaat gerichte proteasen zijn een familie van enzymen betrokken bij verschillende homeostase processess ^1. Caspasen kan grofweg worden ingedeeld op basis van hun rol in apoptose of ontsteking. Caspase-1, -4, -5 en -12 zijn betrokken bij ontstekingen terwijl die betrokken zijn bij apoptose kan sub-geclassificeerd als initiator caspases (caspase-8 en -9) en beul caspases (caspase-3, -6 en -7 ).

Caspasen spelen een belangrijke rol in vele ziekten, vooral in aandoeningen waarin apoptose buitensporig kan zijn, zoals waargenomen na myocardinfarct (MI) of cerebrale ischemie.

In het rattenmodel van post-MI syndroom gebruikt in ons lab is vastgesteld dat caspase-3 wordt geactiveerd niet alleen in het myocardium ^2, maar ook in het limbische systeem dat is betrokken bij de beheersing van stemming en emoties ^3-6. Ook wordt gezien dat caspase-3 wordt geactiveerd in verschillende regiohet limbische systeem, zoals de hippocampus en amygdala en deze activering pieken ongeveer 3 dagen na ischemisch insult ^4. Interessant is dat caspase-3-activiteit correleert met post-MI gedrags- stoornissen, en de demping door middel van farmacologische en nutritionele interventies vermindert deze verwondingen, hetgeen duidt op een mogelijk verband tussen caspase-3 en post-MI depressie ^7-12.

Caspase-3 activatie kan worden gemeten met verschillende technieken. Western blotting constateert de enzymatische eigenschappen van de caspasen en kunnen actieve enzymen en hun pro-enzymvormen detecteren. Western blotting echter semi-kwantitatief en kleine variaties kunnen worden verloren door zwak signaal-ruisverhoudingen ^13. Een betere techniek is gebaseerd op de splitsing van een substraat (DEVD-AMC) van caspase-3 die een fluorogene verbinding vrijgeeft en kan worden gemeten door spectrofluorimetrie. Caspase-3 activatie is een betrouwbare merker van apoptose. Meting van apoptose can instabiel zijn omdat het tijdvenster van optreden is kort, en naburige cellen kunnen apoptotische lichamen of cellen ¹⁴ phagocytize. Apoptose kan verder worden bevestigd door andere technieken, zoals terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) test, dat DNA fragmentatie die voortvloeit uit apoptotische signaaltransductie cascades ^6, of de verhouding van pro- / anti-apoptotische proteïnen, zoals Bax / detecteert Bcl2 ^6.

Protocol

Dieren worden behandeld in overeenstemming met de regelgeving van de lokale Animal Care Committee, in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care. Ratten zijn gehuisvest individueel onder constante condities (temperatuur van 21-22 ° C en vochtigheid van 40-50%), waaronder een 12 uur donker-licht cyclus, te beginnen om 08:00. Chow pellets en kraanwater zijn ad libitum gedurende het onderzoek. Een acclimatisatie periode van 3 dagen na levering door de leverancier is toegestaan ​​voor het experiment. Mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht tussen 300-800 g werden routinematig gebruikt met dit protocol.

1. MI Surgery

1. Induceren anesthesie met intraperitoneale injecties van ketamine 60 mg / kg en xylazine 10 mg / kg. Bevestig de juiste verdoving door de afwezigheid van reflex wanneer de poten worden geknepen.
2. Scheren operatiewond. Intuberen rat met endotracheale slangen: catheter (16G 1,77 inch) en plaats van dieren in de laterale decubitus positie. Plaats de dieren op een verwarmingselement om de temperatuur rond de 37 ° C te houden. Sluit de endotracheale slang aan isofluraan 2%.
3. Bereid chirurgische site met chloorhexidinegluconaat en isopropylalcohol. Tijdens de operatie, gebruik steriele handschoenen en gesteriliseerde instrumenten. Breng oogzalf beide ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Zet steriele veld op dieren en de instrumenten op een andere steriele veld naast het dier.
4. Incise huid met een scalpel # 10. Afpellen spierweefsel met een hemostatische klem. Plaats het dier ventrale decubitus positie. Open thoracale muur met een hemostatische klem en de positie van de borst oprolmechanisme. Open hartzakje met een hemostatische klem.
5. Coronaire occlusie, lus produceert een 360 mm lange 4-0 zijden hechtdraad rondom de dalende kransslagader, die door de aangrenzende myocardweefsel. Steek beide uiteinden van de zijden hechtdraad in een 14G, 1,25 cm lange plastic buis.
6. Trek beide uiteinden van de zijden hechtdraad en push de buis naar beneden tegen de slagader om het af te sluiten, gedurende 40 min. Veilig occlusie door klemmen de plastic buis met een hemostatische klem.
7. Na 40 min, laat de occlusie door het vrijgeven van de hemostatische klem, gevolgd door het verwijderen van de flexibele slang en de zijden hechtdraad.
   Opmerking: Sham controle ratten dezelfde operatie minus de occlusie van de kransslagader ondergaan.
8. Voordat de borstwand, een flexibel katheter (18G, 4,5 cm) tot de borstholte om lucht te trekken uit de thorax met een 5-ml spuit om pneumothorax voorkomen.
9. Sluiten thorax holte met 2-0 hechtdraad, steek de spier met 4-0 zijden hechtdraad en de huid met 3-0 zijden hechtdraad.
10. Voor het sluiten van de laatste huid punt weer trekken lucht uit de thorax met 5-ml spuit door de katheter die eerder in de thorax holte geplaatst.
11. Hechtdraad laatste huid punt. Stoppen isofluraan ventilatie.
12. Monitor rat ontwaken. Heeft een dier niet onbeheerd laten staan ​​totdat het Regained voldoende bewustzijn borstligging handhaven.
13. Behandel rat elke 8 uur gedurende 24 uur met een pijnstiller (buprenorfine, 0,05 mg / kg ip) en een antibioticum (een enkelvoudige dosis duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Na de operatie, huis ratten individueel op het moment van het offer, dat wil zeggen, 3 dagen na MI.
15. Infarctgrootte, voornamelijk necrose, wordt uitgedrukt als het percentage infarct weefsel in het risicogebied van de linker ventrikel. Dit kan gemeten met triphenyltetrazolium kleuring ^11.

2. Amygdala Isolatie

1. Plaats het dier hoofd eerst in een kegelvormige zakje met zijn neus uitsteekt uit de nauwe eindopening. Beveiligde rat om elke beweging te vermijden. Positioneer het hoofd op de juiste wijze op de guillotine, tussen de schaar messen. Onthoofden dier.
2. Plaats het hoofd van de rat in een schotel gehouden op crushed ijs. Voer alle procedures weefsel isolatie op gemalen ijs (4 ° C).
3. Opengesneden skull met een schaar voorzichtig los bot scheden met been rongeurs door te trekken en het vermijden van verminken het weefsel eronder.
4. Leg de platte kant van een spatel tussen de onderkant van de schedel en het achterste ventrale oppervlak van de hersenen en zorgvuldig losmaken hersenen van de schedel diept het blad voorwaarts langs de onderkant van de schedel tot de hersenen langzaam kan worden opgetild uit de schedel. Gooi de schedel.
5. Plaats de hersenen op zijn dorsale oppervlak. Identificeer hypothalamus (structuur tegenover het cerebellum) en snijd de hersenen coronaalwaarts vóór het voorste uiteinde en achter het achterste uiteinde; gooi de voorste en achterste delen van de hersenen als nodig voor andere doeleinden.
6. Visualiseer de amygdalas als kleine bolletjes onder de temporale kwabben, bilateraal, net naast de hypothalamus.
7. Flip de hersenen plat op de voorste einde, dorsale oppervlak weg van de experimentator.
8. Beginnen met de linker of rechterkant van de hersenen. Scheid de hemibollen en dan de cortex van de aangrenzende amygdala. Snijd weg ongeveer 8 mm van deze losse cortex aan de isolatie van de amygdala mogelijk te maken. Weggesneden amygdala met scalpel.
9. Isoleer de basolaterale deel van de amygdala van zijn centromedial deel door te snijden langs het donker hechtdraad dat over het loopt, bijna de helft en de helft. Deze structuur is niet altijd gemakkelijk te identificeren.
10. Zet amygdala subparts in afzonderlijke geïdentificeerd flesjes en blijf op crushed ijs.
11. Herhaal dissectie procedure bij de andere hersenhelft.
12. Dompel ampullen in vloeibare stikstof gedurende 1 minuut. Houd flacon in -80 ° C vriezer totdat het nodig is.

3. Caspase-3 Activity

1. Bereid lysis buffer met 0,32 M sucrose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur, 2 mM dithiothreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 ug / ul leupeptine , 10 ug / ul pepstatine A en 10 ug / ul van aprotinine.
2. Voeg 150 ul lysisbuffer aan elk monster (5-10 mg). Houden op het ijs. Ultrasone trillingen elk monster op ijs gedurende 5 sec bij maximale intensiteit (40 W). Incubeer weefsel in lysis buffer op ijs gedurende 30 min. Vortex elk monster gedurende 5 min.
3. Voer 3 vries / ontdooi cycli door het plaatsen van monsters in vloeibare stikstof afwisselend en een thermostatisch geregelde verwarmingsplaat ingesteld op 37 ° C. Centrifuge weefsel bij 13.000 g (4 ° C) gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig supernatant en in buis te houden op het ijs.
4. Bereid standaard eiwitconcentraties tussen 0 en 10 ug / ml met runderserumalbumine. Bereid blanks met slechts buffer.
5. Voeg 200 ul van Bradford-reagens aan elke standaard. Lees standaard bij 595 nm. Voor eiwitniveaus, voeg 5 ul monster supernatant aan 795 pl gedestilleerd water en 200 pl Bradford-reagens. Lees elk monster bij 595 nm en gekwantificeerd eiwit met standaardcurve.
6. Bereid reactiebuffer met 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl _{2 <}/ sub>, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur, 0,1% van 3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat en 1 mM dithiothreitol.
7. Voeg 25 ug eiwit reactiebuffer en caspase-3 substraten positieve en negatieve reactieve monsters. Voor negatieve monsters, voeg reactiebuffer, 25 ug eiwit, 0,4 gl Ac-DEVD-CHO 800 pM en 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Voor positieve monsters, voeg 25 ug eiwit reactiebuffer en 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Verwerken alle negatieve en positieve monsters in drievoud. Vul het eindvolume van elk monster tot 200 ul door toevoegen reactiebuffer.
8. Opbrengst negatieve controles door toevoeging van 188,7 pl reactiebuffer tot 0,5 gl Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 gl Ac-DEVD-AMC 10 mM en 10 pl lysisbuffer. Voor positieve controles, voeg 189,2 pi reactiebuffer, 0,8 pi van Ac-DEVD-AMC 10 mM en 10 pl lysisbuffer.
9. Incubeer monsters encontroles in het donker gedurende 3 uur bij 37 ^oC
10. Stop de reactie met 600 ul 0,4 M glycine en 0,4 M NaOH (pH 10) in elk monster en controle.
11. Kwantificeren fluorescentie door spectrofluorimetrie bij excitatie golflengte van 365 nm en emissie golflengte van 465 nm. Voeg 2 ml gedestilleerd water om de reactie in glas cuvet. Lees controles en monsters voor 10 sec met 1 punt bij elke sec.
12. Kwantificeren specifieke activiteit in elk monster: ((Fluorescentie van negatieve monsters minus fluorescentie van positieve monsters) x volume van 2,8 ml) gedeeld door (incubatietijd 3 uur x hoeveelheid eiwit 25 mg).

Representative Results

De amygdala werd geïsoleerd 8 sham (controle) en 8 MI ratten drie dagen na de inductie van de ischemie / reperfusie protocol. Caspase-3 activiteit werd gemeten in dit weefsel met een fluorochroom dat kan worden gesplitst door actief caspase-3 en gedetecteerd door spectrofluorometrie. Positieve en negatieve metingen (zie stap 3.11, 3.12 en 3.16) werden in drievoud uitgevoerd en gemeten gedurende 10 sec, met 1 punt bij elke sec. Verschillen tussen positieve en negatieve controles werden berekend en het gemiddelde van de verschillen voor alle schijn tissue uitgevoerd tijdens deze proef werd gesteld op 100%. Resultaten van MI ratten werden opgeschaald volgens deze referentie en figuur 1 illustreert de eindresultaten: het geeft een significant hogere activiteit in MI ratten vergeleken met placebo (p <0,05).

Figuur 1. Caspase-3activiteit in de amygdala MI ratten, uitgedrukt als percentage van de gemiddelde activiteit in schijncontroles, ingesteld op 100% (8 ratten per groep). * Geeft significant verschil tussen de groepen (p <0,05). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM.

Discussion

Onze ervaring met dit protocol in de afgelopen 10 jaar geleid tot de identificatie van de kritieke methodologische kwesties. Ten eerste, snelle hersenen dissectie in een petrischaal op gemalen ijs belangrijk prepareerkwaliteit handhaven. Ten tweede dient men zich te realiseren dat weefsel sonicatie korter de cerebrale amygdala vergelijking met andere typen weefsels, zoals het hart (10 sec) en nieren (20 sec). Ten derde moet grote zorg worden genomen om het substraat nauwkeurig te mengen voordat het aan de monsters. We tegenkwamen variabele signalen wanneer het mengen volgorde was onvoldoende. Ten vierde moeten geen bellen in de kwarts cel bij het lezen van de monsters. Anders kan het signaal worden veranderd.

We hebben een verandering in de afgelopen jaren de reproduceerbaarheid van de resultaten te vergroten: verhoging substraatvolume volume minder dan 1 pi voorkomen. Toch kunnen kleine verschillen optreden tussen opeenvolgende testen en tenminste 3 controlemonsters worden gebruiktcontrol variaties. Fluorescentie metingen van deze controles worden gemiddeld en het gemiddelde wordt gesteld op 100%. Fluorescentie maatregelen experimentele monsters worden omgezet in percentage van de controlemonsters.

Een andere beperking van deze techniek is dat slechts een deel van het weefsel wordt toegepast en derhalve kan caspase-3 activiteit wordt onderschat. Inderdaad, het tijdvenster van apoptose kort in een bepaalde cel en kan worden gemist hoewel het voorkomt in aangrenzende gebieden op het moment van bemonstering ^1,4,15. Het omgekeerde is ook mogelijk: apoptosis kan bijzonder intens in porties van weefsel, wat resulteert in een overschatting van caspase-3 activiteit. Wij raden het gebruik van de resterende weefsels (amygdala) voor aanvullende technieken, zoals TUNEL testen of Bax / Bcl2 ratio (zie inleiding).

Spectrofluorimetrie ten minste twee voordelen boven Western blotting. Ten eerste genereert direct kwantitatieve gegevens. Ten tweede, het meet enzymatische eenctivity zelf in plaats van eiwit of RNA-expressie, die geen verband kan zijn, en het is bekend dat eiwit expressie kan worden verhoogd zonder wijziging van enzymatische activiteit. Bovendien kan spectrofluorimetrie worden uitgevoerd op andere weefsels of met andere diersoorten en kunnen worden aangepast voor andere caspase subtypen, met verschillende substraten, zodat veilig vergelijkingen kunnen worden gemaakt.

Concluderend dit document wordt het gebruik van spectrofluorimetrie met caspase-3 activiteit te meten in de amygdala, waarin wordt aangetoond dat apoptose optreedt in deze regio van het limbische systeem 3 dagen na MI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio