Caspase-3 Aktivitet i Rat Amygdala Målt spektrofluorometri efter myokardieinfarkt

Abstract

Myokardieinfarkt (MI) har dramatiske mellem- og langsigtede konsekvenser på de fysiologiske og adfærdsmæssige niveauer, men de involverede mekanismer er stadig uklart. Vores laboratorium har udviklet en rotte model af post-MI syndrom, der viser nedsat hjertefunktion, neurontab i det limbiske system, kognitive underskud og adfærdsmæssige tegn på depression. På den neuronale niveau, caspase-3 aktivering medierer post-MI apoptose i forskellige limbiske regioner, såsom amygdala - toppede på 3 dage efter MI. Kognitive og adfærdsmæssige svækkelser vises 2-3 uger efter MI og disse korrelerer statistisk med foranstaltninger af caspase-3 aktivitet. Protokollen beskrevet her anvendes til at inducere MI, indsamle amygdala væv og måle caspase-3 aktivitet ved anvendelse af spektrofluorometri. For at inducere MI, er nedadgående kranspulsåre okkluderet i 40 minutter. Protokollen for evaluering af caspase-3-aktivering starter 3 dage efter MI: rotterne aflivet, og amygdala isoleret RapiDLY fra hjernen. Prøver fryses hurtigt i flydende nitrogen og holdt ved -80 ° C indtil selve analysen. Teknikken for at vurdere caspase-3-aktivering er baseret på spaltning af et substrat (DEVD-AMC) ved caspase-3, som frigiver et fluorogent forbindelse, som kan måles ved spektrofluorometri. Metodikken er kvantitativ og reproducerbar, men det nødvendige udstyr er dyrt og proceduren til kvantificering af prøverne er tidskrævende. Denne teknik kan anvendes på andre væv, såsom hjerte og nyre. DEVD-AMC kan erstattes af andre substrater for at måle aktiviteten af ​​andre caspaser.

Introduction

Caspaser eller cystein-afhængige aspartat-dirigeret proteaser er en familie af enzymer, der er involveret i forskellige homøostase processer, ^1. Caspaser kan groft inddeles i henhold til deres roller i apoptose eller betændelse. Caspase-1, -4, -5 og -12 er involveret i inflammation mens dem, der deltager i apoptose kan være sub-klassificeret som initiator caspaser (caspase-8 og -9) og bøddel caspaser (caspase-3, -6 og -7 ).

Caspaser spiller en væsentlig rolle i mange patologiske tilstande, især i lidelser, hvor apoptose kan være for vidtgående, som observeres efter myokardieinfarkt (MI) eller cerebral iskæmi.

I rottemodel for post-MI syndrom anvendes i vores laboratorium, er det fastslået, at caspase-3 aktiveres ikke alene i myocardium ^{2, men} også i det limbiske system, som er impliceret i kontrollen af humør og følelser ^3-6. Det ses også, at caspase-3 aktiveres i forskellige regioneraf det limbiske system, såsom amygdala og hippocampus, og denne aktivering toppe omkring 3 dage efter iskæmisk insult ^4. Interessant, caspase-3-aktivitet korrelerer med post-MI adfærdsmæssige svækkelser, og dets dæmpning gennem farmakologiske og ernæringsmæssige indgreb reducerer disse skader, hvilket antyder en mulig forbindelse mellem caspase-3 og post-MI depression ^7-12.

Caspase-3-aktivering kan måles ved forskellige teknikker. Western blotting konstaterer de enzymatiske egenskaber af caspaser og kan detektere aktive enzymer samt deres proenzym former. Western blotting, er imidlertid semikvantitativ og små variationer kan gå tabt ved svage signal-til-støj-forhold ^13. En bedre teknik er baseret på spaltningen af ​​et substrat (DEVD-AMC) ved caspase-3, der frigiver et fluorogent forbindelse og kan måles ved spektrofluorometri. Caspase-3-aktivering er en pålidelig markør for apoptose. Måling af apoptose can være ustabil, fordi den tid vinduet for forekomst er kort, og beslægtede celler kunne phagocytize apoptotiske organer eller celler ^14. Apoptose kan yderligere bekræftet af andre teknikker, såsom Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay, der detekterer DNA fragmentering som følge af apoptotiske signalleringskaskader ^6, eller forholdet mellem pro- / anti-apoptotiske proteiner, såsom Bax / BCL2 ^6.

Protocol

Dyrene håndteres i overensstemmelse med reguleringen af den lokale Animal Care Udvalg i overensstemmelse med retningslinjerne i den canadiske Rådet om Animal Care. Er Rotter opstaldet individuelt under konstante betingelser (temperatur på 21-22 ºC og luftfugtighed på 40-50%), herunder en 12 timers mørke-lys-cyklus, der begynder ved 8:00. Chow pellets og ledningsvand er til rådighed ad libitum under hele undersøgelsen. En akklimatisering periode på 3 dage efter levering af leverandøren er tilladt før eksperimentet. Sprague-Dawley hanrotter, der vejer mellem 300-800 g er blevet rutinemæssigt anvendes med denne protokol.

1. MI Kirurgi

1. Narkosen med intraperitoneale injektioner af ketamin 60 mg / kg og xylazin 10 mg / kg. Bekræft ordentlig bedøvelse ved fravær af refleks, når poterne er klemt.
2. Barbere operationsstedet. Intubationstid rotte med endotracheal slange: kateter (16G 1,77 inches) og placere dyr i lateral decubitus position. Placer dyr på en varmepude til at opretholde temperatur omkring 37 ° C. Slut endotracheal slange for isofluran 2%.
3. Forbered operationsstedet med chlorhexidingluconat og isopropylalkohol. Under operationen, brug sterile handsker og steriliserede instrumenter. Anvend oftalmologiske salve til begge øjne til at forebygge tørhed, mens under anæstesi. Sæt sterile område på dyrs og instrumenterne på en anden sterile område ved siden af ​​dyret.
4. Incise huden med skalpelblad # 10. Skalle muskelvæv med en hæmostatisk klemme. Placer dyret i ventrale decubitus position. Åben thorax væg med en hæmostatisk klemme og position brystet retraktor. Åben pericardium med en hæmostatisk klemme.
5. For at producere koronar okklusion, loop en 360 mm lang 4-0 silkesutur omkring nedadgående kranspulsåre, der passerer gennem den tilstødende myokardievæv. Sæt begge ender af silkesutur til en 14G, 1,25 cm lange plastrør.
6. Træk begge ender af silkesutur og push røret ned mod arterien for at okkludere det, i 40 minutter. Sikker okklusion ved at spænde plastrør med en hæmostatisk klemme.
7. Efter 40 minutter, frigiver okklusionen ved at løsne den hæmostatiske klemme, efterfulgt af fjernelse af fleksible slange og silkesutur.
   Bemærk: Sham kontrolrotter underkastes samme kirurgiske indgreb minus okklusion af kranspulsåren.
8. Før lukning af thorax væggen, og et fleksibelt kateter (18G, 4,5 cm) gennem brysthulen at trække luft ud af thorax med en 5 ml sprøjte for at forhindre pneumothorax.
9. Tæt brystkasse hulrum med 2-0 sutur, søm musklen med 4-0 silkesutur, og huden med 3-0-silkesutur.
10. Før lukning sidste hud point, igen trække luft ud af thorax med 5 ml sprøjte gennem kateteret tidligere placeret i brystkassen hulrum.
11. Sutur sidste hud punkt. Stop isofluran ventilation.
12. Overvåg rotte opvågnen. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har Regained tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
13. Behandl rotte hver 8. time i 24 timer med et analgetikum (buprenorphin, 0,05 mg / kg ip), og med et antibiotikum (en enkelt dosis på duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Efter operationen, hus rotterne enkeltvis, indtil tidspunktet for aflivning, dvs 3 dage efter MI.
15. Infarktstørrelse, hovedsagelig nekrose, udtrykkes som andelen af ​​infarkt væv i området med risiko for den venstre ventrikel. Dette kan måles ved hjælp af farvning triphenyltetrazolium ^11.

2. Amygdala Isolering

1. Sende dyret hovedet først i en kegle-formet taske, med næsen fremspringende ud af den smalle ende åbning. Sikker rotte for at undgå enhver bevægelse. Placer hovedet hensigtsmæssigt på guillotinen, mellem scissor klinger. Halshugge dyr.
2. Sted leder af rotte i en skål holdt på knust is. Udføre alle procedurer for væv isolation på knust is (4 ° C).
3. Skåret op skrå kobber med en saks, omhyggeligt frigøre knogle skeder med knogle rongeurs ved at trække op og undgå mutilating vævet nedenunder.
4. Placer flade klinge en spatel mellem bunden af ​​kraniet og den bageste ventrale overfladen af ​​hjernen og omhyggeligt løsrive hjernen fra kraniet ved forsigtigt at skubbe bladet frem langs bunden af ​​kraniet, så hjernen kan langsomt løftes op af kranium. Kassér kraniet.
5. Placer hjernen på dens dorsale overflade. Identificer hypothalamus (struktur foran cerebellum) og skæres hjernen coronalt foran sin forreste ende og bag dens bageste ende; skille de anteriore og posteriore dele af hjernen, hvis ikke nødvendigt for andre anvendelser.
6. Visualiser de amygdalas som små kugler under tindingelapperne, bilateralt, lige ved siden af ​​hypothalamus.
7. Flip hjernen fladt på sit frontale ende, dorsale overflade væk fra forsøgslederen.
8. Begynd med venstre eller højre side af hjernen. Adskil hemisfærer og derefter cortex fra den tilstødende amygdala. Skære alt ca. 8 mm i denne løs cortex for at tillade isolering af amygdala. Skær væk amygdala med skalpel.
9. Isoler basolaterale del af amygdala fra dets centromedial del ved at skære langs den mørke sutur, der løber på tværs af det, næsten halvt af. Denne struktur er ikke altid let kan identificeres.
10. Put amygdala subpart i separate identificerede hætteglas og holde på knust is.
11. Gentag dissektion procedure med det andet halvkugle.
12. Fordybe hætteglas i flydende nitrogen i 1 min. Opbevar hætteglasset i -80 ° C fryser indtil brug.

3. Caspase-3 Aktivitet

1. Forbered lysis buffer med 0,32 M saccharose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCI, pH 8, 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre, 2 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / pi leupeptin , 10 ug / pi pepstatin A og 10 pg / pl aprotinin.
2. Tilsæt 150 pi lysisbuffer til hver prøve (5-10 mg). Hold på is. Sonikeres hver prøve på is i 5 sekunder ved maksimal intensitet (40 W). Inkuber væv i lysepuffer på is i 30 minutter. Vortex hver prøve i 5 minutter.
3. Udfør 3 fryse / optøningscykler ved at placere prøver skiftevis i flydende nitrogen og på en termostatreguleret varmeplade indstillet til 37 ° C. Centrifuge væv ved 13.000 g (4 ° C) i 10 minutter. Fjern forsigtigt supernatanten og holde røret på is.
4. Forbered standard proteinkoncentrationer mellem 0 og 10 ug / ml med bovint serumalbumin. Forbered tomme felter med kun puffer.
5. Tilsæt 200 pi Bradford reagens til hver standard. Læs standard på 595 nm. For proteinniveauer, tilsættes 5 ul prøve supernatanten til 795 pi destilleret vand og 200 pi Bradford reagens. Læs hver prøve ved 595 nm og kvantificere protein med standardkurve.
6. Forbered reaktionsbuffer med 50 mM Tris-HCI, pH 7, 5 mM _{MgCl2 <}/ sub>, 1 mM ethylenglycol tetraeddikesyre, 0,1% af 3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat og 1 mM dithiothreitol.
7. Tilsæt 25 ug protein til reaktionsbuffer og caspase-3 substrater for at opnå positive og negative reaktive prøver. For negative prøver, tilføj reaktion buffer, 25 ug protein, 0,4 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM og 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM. For positive prøver, tilsættes 25 ug protein til reaktionsbuffer og 0,8 pi Ac-DEVD-AMC 10 mM. Behandler alle negative og positive prøver i tre eksemplarer. Fuldføre slutvolumen af ​​hver prøve op til 200 pi ved tilsætning reaktionsbuffer.
8. Fremstil negative kontroller ved tilsætning af 188,7 pi reaktionsbuffer til 0,5 pi Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 pi Ac-DEVD-AMC 10 mm og 10 pi lysisbuffer. For positive kontroller, tilsættes 189,2 pi reaktionsbuffer, 0,8 pi Ac-DEVD-AMC 10 mM og 10 pi lysisbuffer.
9. Inkuber prøver ogkontroller i mørke i 3 timer ved 37 ^{° C.}
10. Stop reaktion med 600 pi glycin 0,4 M og NaOH 0,4 M (pH 10) i hver prøve og kontrol.
11. Kvantificere fluorescens ved spektrofluorometri ved excitationsbølgelængde på 365 nm og emissionsbølgelængde på 465 nm. Tilsæt 2 ml destilleret vand til reaktion i glaskuvette. Læs kontroller og prøver til 10 sek med 1 point ved hvert sek.
12. Kvantificere specifik aktivitet i hver prøve: ((Fluorescens af de negative prøver minus fluorescens af positive prøver) x volumen på 2,8 ml) divideret med (inkubationstid 3 timer x mængde protein 25 mg).

Representative Results

Amygdala blev isoleret i 8 sham (kontrol) og 8 mi rotter tre dage efter induktion af iskæmi / reperfusion protokol. Caspase-3-aktivitet blev målt i dette væv ved hjælp af et fluorochrom, der kan spaltes ved aktiv caspase-3 og påvist ved spektrofluorometri. Positive og negative målinger (se trin 3.11, 3.12 og 3.16) blev udført i tre eksemplarer og målt under 10 sek, med 1 point ved hvert sek. Forskelle mellem positive og negative kontroller blev beregnet, og gennemsnittet af forskellene for alle fingeret væv udføres under dette eksperiment blev sat til 100%. Resultater fra MI rotter blev skaleret ifølge denne reference og Figur 1 illustrerer de endelige resultater: det indeholder en signifikant højere aktivitet i MI rotter sammenlignet med sham (p <0,05).

Figur 1. Caspase-3aktivitet i amygdala af MI rotter, udtrykt som procent af middelværdien aktivitet i skinkontroller, indstillet til 100% (8 rotter per gruppe). * Angiver signifikant Forskellen mellem grupperne (p <0,05). Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM.

Discussion

Vores erfaring med denne protokol over de sidste 10 år har ført til identifikation af kritiske metodologiske spørgsmål. Først hurtige hjerne dissektion i en petriskål på knust is er vigtigt at fastholde forberedelse kvalitet. For det andet må det være klart, at væv lydbehandling er kortere for cerebral amygdala i forhold til andre typer af væv, såsom hjertet (10 sek) eller nyrerne (20 SEC). For det tredje bør der udvises stor forsigtighed til omhyggeligt at blande underlaget, før du tilføjer den til prøverne. Vi stødte variable signaler, når blandingsforholdet sekvens var utilstrækkelig. For det fjerde bør ingen bobler være til stede i kvartskuvetter ved læsning prøverne. Ellers kan signalet ændres.

Vi har lavet en ændring i de sidste par år for at øge reproducerbarheden af ​​resultaterne: øget substrat volumen for at undgå volumen mindre end 1 pi. Alligevel kan forekomme små variationer mellem successive analyser, og mindst 3 kontrolprøver bør anvendes tilkontrol for variationer. Fluorescens foranstaltninger af disse kontroller er gennemsnit og gennemsnittet er sat til 100%. Fluorescens foranstaltninger i eksperimentelle prøver omdannes i procent af kontrolprøver.

En anden begrænsning ved teknikken er, at kun en del af væv anvendes, og derfor kunne caspase-3-aktivitet undervurderes. Faktisk er kort i en given celle tidsvinduet af apoptose og kunne blive savnet, selvom det forekommer i tilstødende områder på tidspunktet for prøveudtagning ^1,4,15. Det omvendte er også muligt: ​​apoptose kunne være særlig intens i dele af vævet, hvilket resulterer i overestimering af caspase-3-aktivitet. Vi anbefaler brugen af ​​de resterende væv (amygdala) for komplementære teknikker, såsom TUNEL assays eller Bax / Bcl2 forholdet (se indledning).

Spektrofluorometri har mindst to fordele i forhold til Western blotting. For det første gælder genererer kvantitative data. For det andet, den måler enzymatisk enctivity snarere end protein eller RNA-ekspression, der kan være uafhængige, og det vides, at protein-ekspression kan øges uden ændring af enzymatisk aktivitet. Desuden kan spektrofluorometri udføres på andre væv eller med forskellige dyrearter og kan justeres til andre caspase undertyper, med forskellige substrater, således at sikre sammenligninger kan foretages.

Afslutningsvis dette dokument viser anvendelsen af ​​spektrofluorometri at måle caspase-3-aktivitet i amygdala, som godtgør, at apoptose forekommer i denne region i det limbiske system 3 dage efter MI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio