Abstract
Myokardinfarkt (MI) hat dramatische mittel- und langfristigen Auswirkungen auf die physiologischen und verhaltens Ebenen, aber die Mechanismen sind noch unklar. Unser Labor hat ein Rattenmodell der Post-MI-Syndrom, die eingeschränkter Herzfunktion, Verlust von Nervenzellen im limbischen System, kognitive Defizite und Verhaltens Anzeichen einer Depression zeigt entwickelt. Auf neuronaler Ebene, vermittelt Caspase-3-Aktivierung post-MI Apoptose in verschiedenen limbischen Regionen, wie der Amygdala - Spitzenwert von 3 Tagen nach der MI. Kognitiven und Verhaltensstörungen erscheinen 2-3 Wochen post-MI und diese korreliert statistisch mit Maßnahmen der Caspase-3-Aktivität. Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um zu induzieren MI, sammeln Amygdala Gewebe und messen Caspase-3-Aktivität unter Verwendung Spektrofluorometrie. Um MI zu induzieren, wird der absteigenden Koronararterie für 40 Minuten verschlossen. Das Protokoll für die Auswertung der Caspase-3-Aktivierung beginnt 3 Tage nach MI: die Ratten getötet und die Amygdala isoliert rapiDLY aus dem Gehirn. Proben werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gehalten, bis tatsächliche Analyse. Durchgeführt, um die Caspase-3-Aktivierung beurteilen Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung, die durch Spektrofluorometrie gemessen werden kann, freisetzt. Die Methodik ist quantitativ und reproduzierbar, aber die erforderliche Ausrüstung ist teuer und das Verfahren für die Quantifizierung der Proben ist zeitaufwendig. Diese Technik kann auf anderen Geweben, wie Herz und Niere verwendet werden. DEVD-AMC durch andere Substrate ersetzt werden, um die Aktivität von anderen Caspasen messen.
Introduction
Caspasen oder Cystein-abhängigen Aspartat gerichtete Proteasen sind eine Familie von Enzymen, die in verschiedenen Homöostase processess 1 beteiligt sind. Caspasen können grob nach ihrer Rolle bei der Apoptose oder Entzündung eingestuft werden. Caspase-1, -4, -5 und -12 sind in eine Entzündung involviert während die in Apoptose eingreifen kann unterklassifiziert als Initiatorcaspasen (Caspase-8 und -9) und Vollstrecker Caspasen (Caspase-3, -6 und -7 ).
Caspasen spielen eine bedeutende Rolle in vielen Krankheiten, vor allem in Störungen, bei denen die Apoptose kann übermäßig sein, wie nach einem Myokardinfarkt (MI) oder zerebrale Ischämie beobachtet.
Im Rattenmodell der in unserem Labor verwendete post-MI-Syndrom festgestellt wird, dass Caspase-3 ist nicht nur im Myokard, sondern auch in 2 des limbischen Systems, die bei der Steuerung der Stimmung und Emotionen 3-6 gebracht wird aktiviert. Es ist auch ersichtlich, dass Caspase-3 ist in verschiedenen Regionen aktiviertendes limbischen Systems, wie der Amygdala und Hippocampus, und diese Aktivierung Gipfel rund 3 Tage nach dem ischämischen Insult 4. Interessant ist, dass Caspase-3-Aktivität korreliert mit post-MI Verhaltensstörungen, und dessen Dämpfung durch pharmakologische und ernährungsphysiologischen Interventionen reduziert diese Verletzungen, was auf eine mögliche Verbindung zwischen Caspase-3-und Post-MI Depressionen 7-12.
Caspase-3-Aktivierung kann nach verschiedenen Techniken gemessen werden. Westernblot ermittelt die enzymatischen Eigenschaften der Caspasen und aktive Enzyme sowie ihre pro-Enzymformen zu detektieren. Western-Blot, jedoch semi-quantitative und kleine Abweichungen können durch schwaches Signal-Rausch-Verhältnissen 13 verloren. Eine bessere Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung freigibt und spektrofluorometrisch gemessen werden kann. Caspase-3-Aktivierung ist ein zuverlässiger Marker für Apoptose. Die Messung der Apoptose can ist instabil, da das Zeitfenster für das Auftreten kurz ist, und der Nachbarzellen apoptotische Körper oder Zellen 14 phagozytieren können. Die Apoptose kann durch andere Techniken, wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Test bestätigt werden, dass die DNA-Fragmentierung von apoptotischen Signalkaskaden 6, oder das Verhältnis der Pro- / anti-apoptotische Proteine wie Bax / resultierenden erkennt Bcl2 6.
Protocol
Die Tiere werden in Übereinstimmung mit der Verordnung des lokalen Animal Care Committee behandelt, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care. Die Ratten werden individuell unter konstanten Bedingungen untergebracht (Temperatur von 21-22 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 40-50%), einschließlich einer 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, beginnend um 08.00 Uhr. Chow Pellets und Leitungswasser sind ad libitum während der gesamten Studie. Einer Eingewöhnungszeit von 3 Tagen nach Lieferung durch den Lieferanten wird vor dem Experiment erlaubt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300-800 g wurden routinemäßig mit diesem Protokoll verwendet.
1. MI-Chirurgie
- Induzieren Anästhesie mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin 60 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Abwesenheit von Reflex, wenn die Pfoten eingeklemmt werden.
- Rasur Operationsstelle. Intubieren Ratte mit Endotrachealtubus: Katheter (16G 1,77 Zoll) und legen Tier in Seitenlage. Legen Sie die Tiere auf einem Heizkissen auf die Temperatur um 37 ° C zu halten. Verbinden Sie den Endotrachealtubus bis 2% Isofluran.
- Bereiten Operationsstelle mit Chlorhexidingluconat und Isopropylalkohol. Während der Operation verwenden sterile Handschuhe und sterilisierten Instrumente. Bewerben Augensalbe für beide Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Setzen sterilen Bereich auf tierische und die Instrumente auf einem anderen sterilen Bereich neben dem Tier.
- Einzuschneiden Haut mit Skalpellklinge # 10. Ziehen Sie weg Muskelgewebe mit einem blutstillenden Klemme. Legen Sie das Tier in ventralen Dekubitus-Position. Offene Brustwand mit einem blutstillende Klammer und Position der Brust Aufroller. Offene Herzbeutel mit einem blutstillenden Klemme.
- Zur Herstellung Koronarverschluss, Schleife eine 360 mm lange 4-0 Seidennaht auf der absteigenden Koronararterie, die durch die angrenzenden Herzmuskelgewebe. Stecken Sie die beiden Enden des Seidenfaden in ein 14G, 1,25 cm langen Kunststoffrohr.
- Ziehen Sie die beiden Enden des Seidennaht und Eiterh das Rohr nach unten gegen die Arterie, um sie zu verschließen, für 40 Minuten. Sicheren Verschluß durch Klemmen des Kunststoffrohr mit einem hämostatischen Klemme.
- Nach 40 min, lassen Sie die Okklusion durch Lösen der hämostatischen Klemme, gefolgt vom Entfernen des flexiblen Schlauches und Seidennaht.
Anmerkung: Sham Kontrollratten unterziehen desselben chirurgischen Eingriffs minus die Okklusion der Koronararterie. - Vor dem Schließen der Brustwand, legen einen flexiblen Katheter (18 g, 4,5 cm) über der Brusthöhle, um Luft aus dem Brustkorb mit einer 5-ml-Spritze zur Pneumothorax zu verhindern, zu zeichnen.
- Schließen Thoraxhöhle mit 2-0 Nahtstich den Muskel mit 4-0 Seidennaht und die Haut mit 3-0 Seidennaht.
- Vor dem Schließen des letzten Haut Stelle nochmals ziehen Luft aus dem Thorax mit 5-ml-Spritze durch den Katheter vorher im Thoraxhohlraum angeordnet.
- Naht letzten Hautstelle. Stoppen Isofluran Belüftung.
- Überwachen Ratte Erwachen. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es Regained ausreichend Bewusstsein Brustlage zu halten.
- Behandlung von Ratten alle 8 h 24 h mit einem Analgetikum (Buprenorphin 0,05 mg / kg ip) anästhesiert und mit einem Antibiotikum (einer Einzeldosis von duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
- Nach der Operation Haus Ratten einzeln bis zum Zeitpunkt der Tötung, dh 3 Tage nach MI.
- Infarktgröße, insbesondere Nekrose, wird als das Verhältnis der Infarktgewebe im Risikobereich des linken Ventrikels ausgedrückt. Dies kann unter Verwendung von Triphenyltetrazoliumchlorid Färbung 11.
2. Amygdala Isolation
- Legen Sie das Tier mit dem Kopf voran in einem kegelförmigen Tasche, mit der Nase aus dem schmalen Ende Öffnung vorsteht. Sichere Ratte jede Bewegung zu vermeiden. Positionieren Sie den Kopf in geeigneter Weise auf der Guillotine, zwischen den Scherenblätter. Enthaupten Tier.
- Place-Kopf der Ratte in einer Schale gehalten auf Crushed Ice. Führen Sie alle Verfahren zur Gewebetrennung auf zerstoßenem Eis (4 ° C).
- Schnitten skVoll mit einer Schere vorsichtig lösen Knochenhüllen mit Bone Rongeurs durch Hochziehen und die Vermeidung von verstümmeln das Gewebe darunter.
- Legen Sie die flache Klinge eines Spatels zwischen der Unterseite des Schädels und der hinteren ventralen Oberfläche des Gehirns und sorgfältig lösen Gehirn von Schädel durch leichtes Drücken der Klinge nach vorne entlang der Unterseite des Schädels, bis das Gehirn kann sich langsam nach oben aus dem gehoben werden Schädel. Entsorgen Sie den Schädel.
- Zeigen Gehirn auf seiner Rückenfläche. Identifizieren Hypothalamus (Struktur vor dem Cerebellum) und schneiden das Gehirn koronal vor seinem vorderen Ende und seinem hinteren Ende hinter; Verwerfen der vorderen und hinteren Teile des Gehirns, wenn auch nicht für andere Zwecke benötigt wird.
- Visualisieren Sie die Amygdala als kleine Kugeln unter den Schläfenlappen, bilateral, direkt neben dem Hypothalamus.
- Flip das Gehirn flach auf seinem vorderen Ende, dorsale Oberfläche weg von der Experimentator.
- Beginnen mit der linken oder der rechten Seite des Gehirns. Trennen Sie die hemiKugeln und dann die Rinde von der angrenzenden Amygdala. Geschnitten Weise über 8 mm dieses lose Kortex der Isolierung der Amygdala ermöglichen. Schneiden Sie Amygdala mit Skalpell.
- Isolieren Sie die basolateralen Teil der Amygdala von seinem centromedial Teil durch Schneiden entlang der dunklen Naht, die sich über sie läuft, fast die Hälfte und die Hälfte. Diese Struktur ist nicht immer leicht erkennbar.
- Setzen Amygdala Unterteile in getrennten identifiziert Fläschchen und auf zerstoßenem Eis zu halten.
- Wiederholungs Dissektion Verfahren mit der anderen Hemisphäre.
- Einzutauchen Fläschchen in flüssigem Stickstoff für 1 min. Halten Fläschchen in -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt.
3. Caspase-3 Aktivität
- Vorbereitung Lysepuffer mit 0,32 M Saccharose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ul Leupeptin , 10 ug / ul Pepstatin A und 10 & mgr; g / & mgr; l Aprotinin.
- Zugabe von 150 & mgr; l Lysepuffer zu jeder Probe (5-10 mg). Halten Sie auf dem Eis. Beschallen jede Probe auf Eis für 5 s bei maximaler Intensität (40 W). Inkubieren Gewebe in Lysepuffer auf Eis für 30 min. Wirbel jede Probe für 5 min.
- Führen Sie 3 Einfrieren / Auftauen, indem Proben abwechselnd in flüssigem Stickstoff und auf einem thermostatisch gesteuerten Heizplatte bei 37 ° C eingestellt. Zentrifuge Gewebe bei 13.000 g (4 ° C) für 10 min. Überstand vorsichtig abnehmen und halten Sie in Röhrchen auf Eis.
- Sind Standardproteinkonzentrationen zwischen 0 und 10 ug / ml mit Rinderserumalbumin. Bereiten Rohlinge mit nur Puffer.
- Fügen Sie 200 ul von Bradford-Reagenz zu jedem Standard. Lesen Standard bei 595 nm. Für Proteinspiegel werden 5 ul der Probe Überstand in 795 ul destilliertem Wasser und 200 & mgr; l von Bradford-Reagenz. Lesen Sie jede Probe bei 595 nm und zu quantifizieren Protein mit Standardkurve.
- Vorbereitung Reaktionspuffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl 2 </ sub>, 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure, 0,1% 3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-Propansulfonat und 1 mM Dithiothreitol.
- Man gebe 25 & mgr; g Protein im Reaktionspuffer und Caspase-3-Substrate, um positive und negative Blindproben zu erhalten. Für negative Proben, fügen Reaktionspuffer, 25 & mgr; g Protein, 0,4 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM und 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM. Für positive Proben, fügen Sie 25 ug Protein, um Reaktionspuffer und 0,8 & mgr; l von Ac-DEVD-AMC 10 mM. Verarbeiten alle negativen und positiven Proben in dreifacher Ausfertigung. Füllen Sie das endgültige Volumen jeder Probe bis zu 200 & mgr; l durch Zugabe von Reaktionspuffer.
- Erzeugen negative Kontrollen, indem 188,7 ul Reaktionspuffer und 0,5 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM und 10 ul Lysepuffer. Für positive Kontrollen, fügen 189,2 ul Reaktionspuffer, 0,8 & mgr; l von Ac-DEVD-AMC 10 mM und 10 ul Lysepuffer.
- Proben inkubieren undKontrollen im Dunkeln für 3 Stunden bei 37 o C.
- Stop der Reaktion mit 600 ul 0,4 M Glycin und 0,4 M NaOH (pH 10) in jeder Probe und Kontrolle.
- Quantifizierung Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 465 nm. In 2 ml destilliertem Wasser, um die Reaktion in Glasküvetten. Lesen Kontrollen und Proben für 10 Sekunden mit 1 Punkt an jedem sec.
- Quantifizierung spezifischer Aktivität in jeder Probe: ((Fluorescence der negativen Proben minus Fluoreszenz der positiven Proben) x Volumen von 2,8 ml) geteilt durch (Inkubationszeit 3 Stunden x Proteinmenge 25 mg).
Representative Results
Die Amygdala wurde in 8 sham (Kontrolle) und 8 MI-Ratten drei Tage nach der Induktion der Ischämie / Reperfusion-Protokoll isoliert. Caspase-3-Aktivität wurde in diesem Gewebe mit Hilfe eines Fluorochroms, die durch aktive Caspase-3 gespalten und spektrofluorometrisch detektiert werden kann, gemessen. Positive und negative Messwerte (siehe Schritte 3.11, 3.12 und 3.16) wurden dreifach während 10 Sekunden durchgeführt und gemessen, wobei 1 Punkt an jedem sec. Unterschiede zwischen den positiven und negativen Kontrollen berechnet und der Mittelwert der Differenzen für alle Scheingewebe während dieses Experiment durchgeführt wurde auf 100% gesetzt. Ergebnisse aus MI-Ratten wurden nach dieser Referenz skaliert und Abbildung 1 zeigt die Endergebnisse: zeigt eine signifikant höhere Aktivität im MI-Ratten gegenüber Sham (p <0,05).
Abbildung 1. Caspase-3-Aktivität in der Amygdala von MI-Ratten, ausgedrückt als Prozentsatz der mittleren Aktivität in Schein-Kontrollen, um 100% (8 Ratten pro Gruppe) festgelegt. * Zeigt signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (p <0,05). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.
Discussion
Unsere Erfahrung mit diesem Protokoll in den letzten 10 Jahren zu der Ermittlung der kritischen methodische Probleme. Erstens ist eine schnelle Gehirn Dissektion in einer Petrischale auf zerstoßenem Eis wichtig, Vorbereitung Qualität aufrecht zu erhalten. Zweitens muss realisiert werden, dass Gewebe Beschallung kürzer für die zerebrale Amygdala Vergleich zu anderen Arten von Geweben, wie dem Herzen (10 sec) oder der Nieren (20 sec). Drittens sollte darauf geachtet, vermischen sorgfältig das Substrat, bevor Sie die Ware in den Proben werden. Wir stießen auf veränderliche Signale, wenn das Mischfolge war unzureichend. Viertens sollten keine Blasen in der Quarzzelle vorhanden sein, wenn das Lesen der Proben. Andernfalls könnte das Signal verändert werden.
Wir eine Änderung in den letzten Jahren, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen: Erhöhung der Substrat Volumen zu Volumen von weniger als 1 & mgr; l zu vermeiden. Dennoch können kleine Veränderungen zwischen aufeinander Assays auftreten, und mindestens 3 Kontrollproben verwendet werdenSteuerung für Variationen. Fluoreszenz Maßnahmen dieser Steuerelemente werden gemittelt, und der Mittelwert wird als 100% gesetzt. Fluoreszenz Maßnahmen experimentellen Proben werden in Prozent der Kontrollproben umgewandelt.
Eine weitere Einschränkung des Verfahrens ist, dass nur ein Teil des Gewebes verwendet wird und daher die Caspase-3-Aktivität unterschätzt werden kann. Tatsächlich ist das Zeitfenster der Apoptose kurz in jede gegebene Zelle und kann verfehlt werden, obwohl es in den benachbarten Bereichen tritt zum Zeitpunkt der Probenahme 1,4,15. Das Umgekehrte ist ebenfalls möglich: Apoptose konnte in Gewebeteile besonders intensiv sein, was zu einer Überschätzung der Caspase-3-Aktivität. Wir empfehlen die Verwendung von Restgewebe (Amygdala) für komplementäre Techniken wie TUNEL-Assays oder Bax / Bcl-2-Verhältnis (siehe Einleitung).
Spektrofluorometrie weist wenigstens zwei Vorteile gegenüber der Western Blot. Erstens, direkt erzeugt quantitative Daten. Zweitens misst er eine enzymatischectivity selbst anstatt Protein oder RNA-Expression, die unabhängig sein können, und es ist bekannt, dass die Proteinexpression kann ohne jede Änderung in der enzymatischen Aktivität erhöht werden. Darüber hinaus kann Spektrofluorometrie auf andere Gewebe oder mit unterschiedlichen Tierarten durchgeführt werden, und kann für andere Caspase Subtypen eingestellt werden kann, mit verschiedenen Substraten, so dass sichere Vergleiche angestellt werden können.
Abschließend Dieses Dokument zeigt die Verwendung Spektrofluorometrie Caspase-3-Aktivität in der Amygdala zu messen, den Nachweis, dass die Apoptose tritt in diesem Bereich des limbischen Systems 3 Tage nach MI.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Kim Gilbert unterstützt hält ein Stipendium vom Fonds de la recherche du Québec - Santé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
| Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
| Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path |
| Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
| Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |
References
- Denault, J. B., Salvesen, G. S. Caspases: keys in the ignition of cell death. Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).
- Boucher, M., et al. Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).
- Kaloustian, S., et al. Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala. Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).
- Kaloustian, S., et al. Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat. Brain Research. 1216, 87-91 (2008).
- Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).
- Wann, B. P., et al. Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat. Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).
- Arseneault-Breard, J., et al. Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model. British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).
- Bah, T. M., et al. Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression. Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).
- Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction. Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).
- Gilbert, K., et al. Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion. British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).
- Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression. Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).
- Wann, B. P., et al. Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline. Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).
- Gorr, T. A., Vogel, J. Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues. Proteomics: Clinical Applications. , (2015).
- McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. 'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response. Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell. 102, 1-4 (2000).
