Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Abstract

אוטם שריר לב (MI) יש השלכות אמצע וארוך טווח דרמטיים ברמות הפיזיולוגיות והתנהגותיים, אך המנגנונים המעורבים עדיין אינם ברורים. המעבדה שלנו פיתחה מודל חולדה של תסמונת הפוסט-MI המציגה פונקציות לקויים של הלב, אובדן עצבי במערכת הלימבית, ליקויים קוגניטיביים וסימנים התנהגותיים של דיכאון. ברמה העצבית, caspase-3 הפעלה מתווכת אפופטוזיס לאחר האוטם הלבבי באזורים הלימבית שונים, כגון האמיגדלה - שהגיע לשיא בימים 3 לאחר אוטם לבבי. ליקויים קוגניטיביים והתנהגותיים מופיעים 2-3 שבועות לאחר אוטם לבבי ואלה לתאם סטטיסטיים עם מדדים של caspase-3 פעילות. הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לגרום לאוטם לבבי, לאסוף רקמת האמיגדלה ולמדוד caspase-3 פעילות באמצעות spectrofluorometry. כדי לגרום לאוטם לבבי, העורק הכלל יורד הוא occluded במשך 40 דקות. הפרוטוקול להערכת caspase-3 הפעלה מתחיל 3 ימים לאחר אוטם לבבי: החולדות הקריבו והאמיגדלה מבודדת אונסיםdly מהמוח. דגימות קפואות במהירות בחנקן נוזלי והמשיכו ב -80 ° C עד ניתוח בפועל. הטכניקה שבוצעה על מנת להעריך caspase-3 הפעלה מבוססת על מחשוף של מצע (DEVD-AMC) על ידי caspase-3, אשר משחרר מתחם fluorogenic שניתן למדוד על ידי spectrofluorometry. המתודולוגיה היא כמותית ושחזור אבל הציוד הנדרש הוא יקר וההליך לכימות הדגימות הוא זמן רב. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות, כגון לב וכליות. ניתן להחליף DEVD-AMC על ידי מצעים אחרים כדי למדוד את הפעילות של caspases האחר.

Introduction

Caspases או פרוטאזות המכוונת aspartate ציסטאין תלוי היא משפחה של אנזימים שמעורבים בprocessess הומאוסטזיס שונים ^1. Caspases יכול להיות מסווג באופן כללי על פי תפקידיהם באפופטוזיס או דלקת. Caspase-1, -4, -5 ו-12 מעורבים בדלקת ואילו אלה העוסקים באפופטוזיס יכולים להיות תת-מסווג כcaspases יוזם (caspase-8 ו -9) וcaspases התליין (caspase-3, -6 ו-7 ).

Caspases לשחק תפקידים משמעותיים בפתולוגיות רבות, בעיקר בהפרעות בי אפופטוזיס יכול להיות מוגזם, כפי שנצפה לאחר אוטם שריר לב (MI) או איסכמיה מוחית.

במודל העכברים של תסמונת הפוסט-MI משמשת במעבדה שלנו, נקבע כי caspase-3 מופעל לא רק בשריר הלב ^2, אלא גם במערכת הלימבית שמעורבת בשליטה על מצב רוח ורגשות ^3-6. הוא גם ראה שcaspase-3 מופעל באזורים שוניםשל המערכת הלימבית, כגון האמיגדלה וההיפוקמפוס, ופסגות הפעלה זה סביב 3 ימים לאחר עלבון איסכמי ^4. מעניין לציין, caspase-3 פעילות בקורלציה עם ליקויים התנהגותיים לאחר אוטם לבבי, וההנחתה שלה באמצעות התערבות תרופתית ותזונתית מפחיתה פציעות אלה, המצביע על קשר אפשרי בין caspase-3 ודיכאון לאחר אוטם לבבי ^7-12.

Caspase-3 הפעלה ניתן למדוד על ידי טכניקות שונות. מערבי סופג ascertains המאפיינים האנזימטית של caspases ויכול לזהות אנזימים פעילים, כמו גם צורות פרו-האנזים שלהם. מערבי סופג, לעומת זאת, הוא חצי כמותית, ויכולים ללכת לאיבוד וריאציות קטנות באמצעות יחסי אות לרעש חלשים ^13. טכניקה טובה יותר מבוססת על המחשוף של מצע (DEVD-AMC) על ידי caspase-3 שמשחרר מתחם fluorogenic וניתן למדוד על ידי spectrofluorometry. Caspase-3 הפעלה היא סמן אמין של אפופטוזיס. מדידה של CA אפופטוזיסn להיות לא יציב בגלל החלון של התרחשות הזמן קצר, ותאים שכנים יכולים phagocytize גופים או תאים אפופטוטיים ^14. אפופטוזיס ניתן לאשר עוד יותר על ידי טכניקות אחרות, כגון תיוג סוף dUTP ניק assay מסוף deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), שמזהה פיצול ה- DNA וכתוצאה ממפלים אפופטוטיים איתות ^6, או היחס של חלבונים פרו / אנטי-אפופטוטיים, כגון Bax / Bcl2 ^6.

Protocol

בעלי חיים מטופלים בעמידה ברגולציה של ועדת הטיפול בבעלי חיים המקומית, בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. חולדות שוכנו בנפרד בתנאים קבועים (טמפרטורה של 21-22 מעלות צלזיוס ולחות של 40-50%), כולל מחזור כהה אור 12 שעות, מתחיל בשעה 08:00 בבוקר. כדורי צ'או ומים ברז הם כרצונך מודעה זמין לאורך כל תקופת המחקר. תקופת התאקלמות של 3 ימים לאחר לידה על ידי הספק מותר לפני הניסוי. חולדות זכרי Sprague-Dawley משקל בין 300-800 גר היו בשימוש באופן שיגרתי עם פרוטוקול זה.

1. ניתוח MI

1. לגרום להרדמה עם זריקות intraperitoneal של 60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / קילוגרם xylazine. אשר הרדמה תקינה על ידי היעדר רפלקס כאשר כפות הם צבטו.
2. לגלח אתר כירורגית. צנרר עכברוש עם צינורות endotracheal: צנתר (16G 1.77 אינץ ') ולמקם את החיה בעמדת פַּחֶסֶת רוחב. מניחים את בעלי החיים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס. חבר את צינורות endotracheal לIsoflurane 2%.
3. הכן אתר כירורגית עם gluconate chlorhexidine ואלכוהול איזופרופיל. במהלך ניתוח, להשתמש בכפפות סטריליות ומכשירים מעוקרים. החל משחת עיניים לשני העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. שים שדה סטרילי על בעלי חיים ועל המכשירים אחר שדה סטרילי בסמוך לבעלי החיים.
4. לחתוך את עור עם להב סכין מנתחים # 10. לקלף את רקמת שריר עם מהדק עוצר דמום. מניחים את החיה בעמדת פַּחֶסֶת הגחון. קיר בית חזה פתוח עם מפשק חזה מהדק ומיקום עוצר דמום. קרום הלב פתוח עם מהדק עוצר דמום.
5. כדי לייצר חסימה כלילית, לולאת תפר משי 4-0 מ"מ 360-ארוך סביב העורקים הכליליים יורדים, עובר דרך רקמת שריר לב רציפה. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי ל14g, צינור פלסטיק ארוך 1.25 סנטימטר.
6. משוך את שני הקצוות של תפר המשי ומוגלהh הצינור נחלש כנגד העורק כדי לחסום אותו, במשך 40 דקות. חסימה מאובטחת על ידי הידוק צינור הפלסטיק עם מהדק עוצר דמום.
7. אחרי 40 דקות, לשחרר את החסימה על ידי שחרור המהדק עוצר דמום, ואחריו הסרת תפר צינורות ומשי גמיש.
   הערה: חולדות שליטה שאם עוברות את אותו הליך כירורגי מינוס החסימה של העורקים הכליליים.
8. לפני סגירת קיר בית החזה, מקום צנתר גמיש (18G, 4.5 סנטימטרים) בחלל בית החזה לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ"ל כדי למנוע pneumothorax.
9. חלל בית החזה לסגור עם 2-0 תפר, לתפור את השריר עם תפר 4-0 משי ועור עם 3-0 תפר משי.
10. לפני סגירת נקודת העור שעברה, שוב לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ"ל באמצעות הצנתר ממוקם בעבר בחלל בית החזה.
11. לתפור נקודת עור שעברה. תפסיק אוורור isoflurane.
12. צג התעוררות חולדה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד יש Regaineתודעה מספיק ד לשמור כיבתה sternal.
13. פנק את חולדה כל שעה 8 לשעה 24 עם משכך כאבים (עצירות, 0.05 מ"ג / IP קילוגרם) ועם אנטיביוטיקה (מנה אחת של duplocillin, 0.2 מ"ג / IP קילוגרם).
14. לאחר הניתוח, חולדות בית בנפרד עד זמן הקרבה, כלומר, 3 ימים לאחר אוטם לבבי.
15. גודל אוטם, בעיקר נמק, מתבטא בשיעור של רקמת אוטם שריר באזור בסיכון של החדר השמאלי. זה יכול נמדד באמצעות צבע triphenyltetrazolium ^11.

2. בידוד האמיגדלה

1. מניחים את ראש החיה ראשונה בתיק בצורת חרוט, עם אפה הבולט מתוך צמצם הקצה הצר. עכברוש מאובטח כדי למנוע כל תנועה. מקם את ראשה כראוי על הגיליוטינה, בין להבי המספריים. לערוף חיה.
2. ראש מקום החולדה בצלחת כל הזמן על קרח כתוש. לבצע את כל ההליכים לבידוד רקמות על קרח כתוש (4 מעלות צלזיוס).
3. SK הפתוח לחתוךull עם מספריים, לנתק בזהירות נדני עצם עם rongeurs עצם על ידי משיכת והימנעות פציעת הרקמה מתחת.
4. מניחים את להב השטוח של מרית בין החלק התחתון של הגולגולת ומשטח הגחון האחורי של המוח ולנתק בזהירות מוח מגולגולת על ידי דחיפה קלה של הלהב קדימה לאורך החלק התחתון של הגולגולת עד שהמוח יכול להיות הרים לאט מ גוּלגוֹלֶת. מחק את הגולגולת.
5. מניחים מוח על פני השטח הגב שלה. לזהות ההיפותלמוס (מבנה בחזית של המוח הקטן) ולחתוך את מוח coronally מול הקצה הקדמי שלה ומאחורי הקצה האחורי שלה; השלך את החלקים הקדמי והאחוריים של המוח, אם אין צורך לשימושים אחרים.
6. דמיין amygdalas כמו כדורים קטנים מתחת האונה הטמפורלית, דו-צדדי, רק בסמוך להיפותלמוס.
7. הפוך את שטוח המוח בסוף הקדמי שלה, משטח הגבי מהניסוי.
8. התחל עם צד שמאלי או ימני של המוח. הפרד את חמיתחומים ולאחר מכן הקליפה מהאמיגדלה רציפה. חותך דרך כ -8 מ"מ של זה רופף קליפה כדי לאפשר בידוד של האמיגדלה. לחתוך אמיגדלה עם אזמל.
9. לבודד את החלק של basolateral האמיגדלה מחלק centromedial על ידי חיתוך לאורך התפר הכהה שחוצה אותו, כמעט חצי וחצי. מבנה זה לא תמיד קל לזיהוי.
10. שים subparts האמיגדלה בבקבוקונים מזוהים נפרדים ולשמור על קרח כתוש.
11. הליך נתיחה חוזר עם חצי הכדור האחר.
12. לטבול את הבקבוקונים בחנקן נוזלי דקות 1. שמור בקבוקון במקפיא -80 ° C עד צורך.

3. caspase-3 פעילות

1. הכן מאגר תמוגה עם 0.32 M של סוכרוז, 1% Triton-X-100, 10 מ"מ של טריס-HCl, pH 8, 5 מ"מ של חומצת ethylenediaminetetraacetic, 2 מ"מ של dithiothreitol, 1 מ"מ של פלואוריד phenylmethylsulfonyl, 10 מיקרוגרם / μl של leupeptin , 10 מיקרוגרם / μl של pepstatin ו -10 מיקרוגרם / μl של aprotinin.
2. להוסיף 150 μl של חיץ תמוגה לכל דגימה (5-10 מ"ג). שמור על קרח. Sonicate כל דגימה על קרח למשך 5 שניות בעוצמה מקסימלי (40 W). דגירה רקמה במאגר תמוגה על קרח למשך 30 דקות. וורטקס כל מדגם למשך 5 דקות.
3. לבצע מחזורי 3 הקפאה / הפשרה על ידי הצבת דגימות לסירוגין בחנקן נוזלי ועל צלחת חימום תרמוסטטית שליטה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס. רקמת צנטריפוגה ב 13,000 ז (4 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות. מוציא בזהירות supernatant ולשמור בצינור על קרח.
4. הכן ריכוזי חלבון סטנדרטיים בין 0 ל 10 מיקרוגרם / מיליליטר עם אלבומין בסרום שור. הכן את החסר עם חיץ בלבד.
5. הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד לכל תקן. קראו סטנדרטי ב595 ננומטר. לרמות חלבון, להוסיף 5 μl של supernatant המדגם לμl 795 של מים מזוקקים ו -200 μl של מגיב ברדפורד. קראו כל דגימה ב595 ננומטר ולכמת חלבון עם עקומה סטנדרטית.
6. הכן חיץ תגובה עם 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7, 5 מ"מ של MgCl _{2 <}/ Dimethylammonio] -1-propanesulfonate משנה>, 1 מ"מ של חומצת tetraacetic אתילן גליקול, 0.1% מ3-cholamidopropyl) ושל 1 מ"מ dithiothreitol.
7. הוסף 25 מיקרוגרם של חלבון למצעי חיץ התגובה וcaspase-3 להשיג דגימות תגובה חיוביות ושליליות. עבור דגימות שליליות, להוסיף למאגר תגובה, 25 מיקרוגרם של חלבון, 0.4 μl של מיקרומטר Ac-DEVD-CHO 800 וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ. לדגימות חיוביות, להוסיף 25 מיקרוגרם של חלבון למאגר תגובה וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ. לעבד את כל הדגימות השליליות וחיוביות בשלושה עותקים. השלם את הנפח הסופי של כל דגימה עד 200 μl על ידי הוספת תגובת חיץ.
8. לייצר בקרה שלילית על ידי הוספת 188.7 μl של חיץ תגובה ל 0.5 μl של Ac-DEVD-CHO 800 מיקרומטר, 0.8 μl Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. לבקרות חיוביות, להוסיף 189.2 μl של חיץ תגובה, 0.8 μl של Ac-DEVD-AMC 10 מ"מ ו -10 μl של מאגר תמוגה.
9. דגירה דגימות ובקרות בחושך במשך 3 שעות על 37 ^{מעלות צלסיוס}
10. קצות עם 600 גליצין μl 0.4 מ 'ו -0.4 NaOH M (pH 10) בכל דגימה ושליטה.
11. לכמת הקרינה על ידי spectrofluorometry בגל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​465 ננומטר. הוסף 2 מיליליטר של מים מזוקקים לתגובה בקובט זכוכית. קראו בקרות ודגימות למשך 10 שניות עם נקודה 1 בכל שנייה.
12. לכמת פעילות ספציפית בכל דגימה: ((הקרינה של דגימות שליליות מינוס הקרינה של דגימות חיוביות) x נפח של 2.8 מיליליטר) מחולקים ב( זמן דגירה 3 כמות x שעות של חלבון 25 מ"ג).

Representative Results

האמיגדלה הייתה מבודדת בדמה 8 (שליטה) ו8 חולדות MI שלושה ימים אחרי הגיוס של פרוטוקול איסכמיה / reperfusion. Caspase-3 פעילות נמדדה ברקמה זו באמצעות fluorochrome שניתן ביקע ידי caspase-3 הפעיל וזוהה על ידי spectrofluorometry. מדידות חיוביות ושליליות (ראה צעדים 3.11, 3.12 ו3.16) בוצעו בשלושה עותקים ונמדדו במהלך 10 שניות, עם נקודה 1 בכל שנייה. הבדלים בין בקרות חיוביות ושליליות חושבו והממוצע של ההבדלים לכל רקמת הדמה שבוצעה במהלך ניסוי זה נקבע על 100%. תוצאות מחולדות MI היו מדורגים על פי התייחסות זו והאיור 1 מדגים את התוצאות הסופיות: הוא מציין פעילות גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לחולדות MI דמה (p <0.05).

איור 1. caspase-3פעילות באמיגדלה של חולדות MI, הביעה כאחוז מפעילות הממוצעת בבקרת אחיזת עיניים, שנקבעה ל -100% (8 חולדות לכל קבוצה). * מציין משמעותי הבדל בין הקבוצות (p <0.05). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM.

Discussion

הניסיון שלנו עם פרוטוקול זה מעל 10 השנים האחרונות הוביל לזיהוי של בעיות מתודולוגיות קריטיות. ראשית, לנתיחה מוח מהירה בצלחת פטרי על קרח כתוש חשוב לשמור על איכות הכנה. שנית, הוא חייב להיות הבין שsonication רקמה קצר לאמיגדלה המוחית בהשוואה לסוגים אחרים של רקמות, כמו הלב (10 שניות) או כליות (20 שניות). שלישית, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לערבב בזהירות את המצע לפני הוספתו לדגימות. נתקלנו אותות משתנים כאשר רצף הערבוב היה לקוי. רביעית, אין בועות צריכה להיות נוכחת בתא קוורץ בעת קריאת הדגימות. אחרת, את האות אפשר לשנות.

אנחנו עשינו שינוי בשנים האחרונות להגדיל את שחזור של התוצאות: הגדלת נפח מצע, כדי למנוע נפח של פחות מ 1 μl. ובכל זאת, שינויים קטנים עשויים להתרחש בין מבחני רצופים, ויש להשתמש לפחות 3 דגימות בקרה לשליטה לווריאציות. צעדי הקרינה של בקרות אלה בממוצע והממוצע מוגדר ב 100%. צעדי הקרינה בדגימות ניסוי הופכים באחוזים של דגימות הבקרה.

מגבלה נוספת של הטכניקה היא שרק חלק מהרקמה משמש, ולכן, caspase-3 פעילות יכולה לזלזל. ואכן, החלון של אפופטוזיס הזמן קצר בכל תא נתון ויכול להיות שלא נענו למרות שהיא מתרחשת באזורים הסמוכות בזמן דגימת ^1,4,15. ההפך הוא גם אפשרי: אפופטוזיס יכול להיות אינטנסיבי במיוחד בחלקים של רקמה, וכתוצאה מכך הערכת יתר של caspase-3 פעילות. אנו ממליצים על השימוש ברקמות שנותרו (אמיגדלה) לטכניקות משלימות, כגון מבחני TUNEL או יחס Bax / Bcl2 (ראה מבוא).

יש Spectrofluorometry לפחות שני יתרונות על פני מערבי סופג. ראשית, אותו ישירות מייצר נתונים כמותיים. שנית, הוא מודד האנזימטיתctivity עצמו ולא חלבון או RNA ביטוי, אשר עשוי להיות קשורים, וזה ידוע כי ביטוי חלבון עשוי להיות מוגבר ללא כל שינוי בפעילות האנזימטית. יתר על כן, spectrofluorometry יכול להתבצע על רקמות אחרות או עם בעלי חיים שונים ויכולה להיות מותאם לתת caspase אחרים, עם מצעים שונים, כך ניתן לבצע השוואות שבטוחות.

לסיכום, מסמך זה מדגים את השימוש בspectrofluorometry למדוד caspase-3 פעילות באמיגדלה, מתן עדות אפופטוזיס המתרחש באזור זה של המערכת הלימבית 3 ימים לאחר אוטם לבבי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio