रोधगलन के बाद Spectrofluorometry द्वारा मापा चूहा प्रमस्तिष्कखंड में कस्पासे 3 गतिविधि

Abstract

रोधगलन (एमआई) शारीरिक और व्यवहार के स्तर पर नाटकीय मध्य और दीर्घकालिक परिणाम है, लेकिन शामिल तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं। हमारी प्रयोगशाला बिगड़ा हृदय कार्य, लिम्बिक सिस्टम में neuronal नुकसान, संज्ञानात्मक घाटे और अवसाद के व्यवहार संकेत प्रदर्शित करता है कि बाद एमआई सिंड्रोम का एक चूहे मॉडल विकसित किया है। बाद एमआई 3 दिन में बढ़ता जा - न्यूरोनल स्तर पर, कस्पासे 3 सक्रियण ऐसे प्रमस्तिष्कखंड के रूप में विभिन्न लिम्बिक क्षेत्रों में बाद एमआई एपोप्टोसिस मध्यस्थता करता है। संज्ञानात्मक व्यवहार और दोष 2-3 सप्ताह के बाद एमआई दिखाई देते हैं और इन कस्पासे 3 गतिविधि के उपायों के साथ सांख्यिकीय रूप सहसंबंधी। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, एमआई प्रेरित प्रमस्तिष्कखंड ऊतक को इकट्ठा करने और spectrofluorometry का उपयोग कर कस्पासे 3 गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। एमआई के लिए प्रेरित करने के लिए, उतरते कोरोनरी धमनी में 40 मिनट के लिए occluded है। चूहों बलिदान कर रहे हैं और प्रमस्तिष्कखंड rapi पृथक: कस्पासे 3 सक्रियण के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल 3 दिन एमआई के बाद शुरू होता हैमस्तिष्क से Dly। नमूने जल्दी से तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हैं और वास्तविक विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। कस्पासे 3 सक्रियण का आकलन करने के लिए किया तकनीक spectrofluorometry से मापा जा सकता है कि एक fluorogenic यौगिक विज्ञप्ति जो कस्पासे 3 से एक सब्सट्रेट (DEVD-एएमसी) की दरार पर आधारित है। कार्यप्रणाली मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, लेकिन आवश्यक उपकरण महंगा है और नमूने बढ़ाता के लिए प्रक्रिया समय लेने वाली है। इस तकनीक जैसे हृदय और गुर्दे के रूप में अन्य ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। DEVD-एएमसी अन्य कास्पासेस की गतिविधि को मापने के लिए अन्य substrates द्वारा बदला जा सकता है।

Introduction

Caspases या Cysteine ​​निर्भर aspartate निर्देशित प्रोटिएजों विभिन्न समस्थिति processess ¹ में शामिल कर रहे हैं कि एंजाइमों के एक परिवार के हैं। Caspases मोटे तौर पर apoptosis या सूजन में उनकी भूमिकाओं के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है। कस्पासे -1, -4, -5 और -12 एपोप्टोसिस में लगे लोगों के हो सकते हैं, जबकि सूजन में शामिल कर रहे उप-वर्गीकृत सर्जक कास्पासेस के रूप में (कस्पासे 8 और -9) और जल्लाद caspases (कस्पासे 3, -6 और -7 )।

रोधगलन (एमआई) या मस्तिष्क ischemia के बाद मनाया के रूप में caspases, मुख्य रूप से एपोप्टोसिस अत्यधिक हो सकता है, जहां विकारों में, कई विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल के बाद एमआई सिंड्रोम के चूहे मॉडल में, यह कस्पासे 3 मायोकार्डियम ² में भी, लेकिन मूड और भावनाओं को ^3-6 के नियंत्रण में फंसा है जो लिम्बिक सिस्टम में न केवल सक्रिय हो जाता है कि स्थापित है। यह भी कस्पासे 3 अलग-अलग क्षेत्रों में सक्रिय है देखा गया है किलिम्बिक सिस्टम की, इस तरह के प्रमस्तिष्कखंड और हिप्पोकैम्पस, और इस्कीमिक अपमान ⁴ के बाद 3 दिन के आसपास इस सक्रियण चोटियों के रूप में। दिलचस्प बात यह है कस्पासे 3 गतिविधि के बाद एमआई व्यवहार impairments के साथ संबद्ध है, और औषधीय और पोषण हस्तक्षेप के माध्यम से अपने क्षीणन कस्पासे 3 और बाद एमआई अवसाद ^7-12 के बीच एक संभव लिंक का सुझाव दे, इन चोटों को कम करता है।

कस्पासे 3 सक्रियण विभिन्न तकनीकों से मापा जा सकता है। पश्चिमी सोख्ता कास्पासेस के enzymatic गुण ascertains और सक्रिय एंजाइमों के साथ ही उनके समर्थक एंजाइम रूपों पता लगा सकते हैं। पश्चिमी सोख्ता, तथापि, अर्द्ध मात्रात्मक है, और छोटे बदलाव कमजोर संकेत करने वाली शोर अनुपात ¹³ के माध्यम से खो दिया जा सकता है। एक बेहतर तकनीक एक fluorogenic यौगिक जारी है और spectrofluorometry से मापा जा सकता है कि कस्पासे 3 से एक सब्सट्रेट (DEVD-एएमसी) की दरार पर आधारित है। कस्पासे 3 सक्रियण apoptosis की एक विश्वसनीय मार्कर है। एपोप्टोसिस सीए के मापनएन घटना के समय खिड़की कम है, क्योंकि अस्थिर हो सकता है, और पड़ोसी कोशिकाओं apoptotic निकायों या ¹⁴ कोशिकाओं का भक्षण कर सकता है। Apoptosis आगे इस तरह Bax / रूप apoptotic cascades संकेत ^6, या विरोधी apoptotic / समर्थक प्रोटीन के अनुपात से उत्पन्न डीएनए विखंडन का पता लगाता है कि इस तरह के टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) परख के रूप में अन्य तकनीकों के द्वारा पुष्टि की जा सकती Bcl2 ^6।

Protocol

पशु पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार, स्थानीय पशु की देखभाल समिति के विनियमन के साथ अनुपालन में नियंत्रित किया जाता है। चूहे, (21-22 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 40-50% की नमी) को व्यक्तिगत रूप से लगातार शर्तों के तहत आते हैं 08:00 पर शुरुआत, 12 घंटा अंधेरे प्रकाश चक्र भी शामिल है। चाउ छर्रों और नल के पानी के अध्ययन के दौरान उपलब्ध यथेच्छ हैं। आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रसव के बाद 3 दिनों के अभ्यस्त अवधि प्रयोग से पहले अनुमति दी है। 300-800 ग्राम के बीच वजन पुरुष Sprague-Dawley चूहों नियमित रूप से इस प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया गया है।

1. एमआई सर्जरी

1. Ketamine 60 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 10 मिलीग्राम / किलो की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ संज्ञाहरण प्रेरित। पंजे pinched कर रहे हैं जब पलटा के अभाव से उचित anesthetization की पुष्टि करें।
2. शल्य साइट दाढ़ी। (16 जी 1.77 इंच) कैथेटर और पार्श्व decubitus स्थिति में जानवरों की जगह: अंतःश्वासनलीय ट्यूबिंग के साथ चूहे intubate। तापमान लगभग 37 डिग्री सेल्सियस बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर जानवरों रखें। 2% isoflurane को अंतःश्वासनलीय ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
3. Chlorhexidine gluconate और isopropyl शराब के साथ शल्य साइट तैयार करें। सर्जरी के दौरान, बाँझ दस्ताने और निष्फल उपकरणों का उपयोग करें। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों को नेत्र मरहम लागू करें। जानवर और पशु के बगल में एक और बाँझ क्षेत्र पर उपकरणों पर बाँझ क्षेत्र रखो।
4. स्केलपेल ब्लेड # 10 के साथ त्वचा काटकर अलग कर देना। एक hemostatic क्लैंप के साथ मांसपेशियों के ऊतकों को छीलकर। उदर डेक्यूबीटस स्थिति में पशु रखें। एक hemostatic दबाना और स्थिति के सीने प्रतिकर्षक के साथ खुला वक्ष दीवार। एक hemostatic क्लैंप के साथ ओपन पेरीकार्डियम।
5. सन्निहित दौरे ऊतक के माध्यम से गुजर रहा है, कोरोनरी रोड़ा, पाश उतरते कोरोनरी धमनी के चारों ओर एक 360 मिमी लंबे समय से 4-0 रेशम सीवन उत्पादन करने के लिए। एक 14G, 1.25 सेमी लंबी प्लास्टिक ट्यूब में रेशम सीवन के दोनों सिरों डालें।
6. रेशम सिवनी और मवाद के दोनों सिरों खींचोज नीचे धमनी के खिलाफ ट्यूब 40 मिनट के लिए, यह रोक देना। एक hemostatic क्लैंप के साथ प्लास्टिक ट्यूब clamping द्वारा सुरक्षित रोड़ा।
7. 40 मिनट के बाद, लचीला ट्यूबिंग और रेशम सीवन को हटाने के द्वारा पीछा किया hemostatic दबाना, रिहा द्वारा रोड़ा जारी।
   नोट: नकली नियंत्रण चूहों ही शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया शून्य से कोरोनरी धमनी का रोड़ा गुज़रना पड़ता है।
8. वक्ष दीवार को बंद करने से पहले, वातिलवक्ष को रोकने के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ छाती से बाहर हवा आकर्षित करने के लिए वक्ष गुहा के माध्यम से एक लचीला कैथेटर (18G, 4.5 सेमी) जगह है।
9. बंद छाती गुहा 2-0 सीवन के साथ, 4-0 रेशम सीवन के साथ मांसपेशियों और 3-0 रेशम सीवन के साथ त्वचा सिलाई।
10. पिछले त्वचा बिंदु बंद करने से पहले, फिर छाती गुहा में पहले से रखा कैथेटर के माध्यम से 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ छाती से बाहर हवा आकर्षित।
11. पिछले त्वचा बिंदु सीवन। Isoflurane वेंटिलेशन बंद करो।
12. चूहे जागरण की निगरानी करें। यह regaine है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर को मत छोड़ोडी पर्याप्त चेतना स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए।
13. एक एंटीबायोटिक के साथ एक एनाल्जेसिक (buprenorphine, 0.05 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) और के साथ 24 घंटा (duplocillin की एक खुराक, 0.2 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) के लिए चूहे हर 8 घंटे समझो।
14. सर्जरी के बाद, घर में चूहों को व्यक्तिगत यानी बलिदान का समय है, जब तक, 3 दिन बाद एमआई।
15. रोधगलितांश आकार, मुख्य रूप से गल जाना, बाएं वेंट्रिकल के जोखिम में क्षेत्र में infarcted ऊतक के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है। इस triphenyltetrazolium रंगाई ¹¹ का उपयोग करके मापा जा सकता है।

2. प्रमस्तिष्कखंड अलगाव

1. अपनी नाक संकीर्ण अंत एपर्चर से बाहर फैला हुआ साथ, एक शंकु के आकार का बैग में पहले पशु सिर रखें। सुरक्षित चूहा किसी भी आंदोलन से बचने के लिए। कैंची ब्लेड के बीच, गिलोटिन पर उचित रूप से अपने सिर की स्थिति। पशु सिर काटना।
2. एक थाली में चूहे की जगह सिर कुचल बर्फ पर रखा। कुचल बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर ऊतक अलगाव के लिए सभी प्रक्रियाओं को पूरा करें।
3. कट खुला एसकेull कैंची से, ध्यान खींच रहा है और नीचे के ऊतकों mutilating से बचने के द्वारा हड्डी rongeurs साथ हड्डी शीथ अलग।
4. खोपड़ी के नीचे और मस्तिष्क के पीछे उदर की सतह के बीच एक रंग के फ्लैट ब्लेड प्लेस और ध्यान से मस्तिष्क धीरे धीरे से बाहर उठाया जा सकता है जब तक धीरे खोपड़ी के नीचे के साथ आगे ब्लेड धक्का द्वारा खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग खोपड़ी। खोपड़ी त्यागें।
5. अपने पृष्ठीय सतह पर मस्तिष्क रखें। हाइपोथैलेमस (सेरिबैलम के सामने संरचना) को पहचानें और उसके पूर्वकाल अंत की और उसके पीछे के अंत के पीछे सामने coronally मस्तिष्क में कटौती; अन्य उपयोगों के लिए आवश्यक नहीं है, तो मस्तिष्क के पूर्वकाल और कूल्हों भागों त्यागें।
6. बस अगले हाइपोथेलेमस करने के लिए द्विपक्षीय, लौकिक पालियों के नीचे छोटे क्षेत्रों के रूप में amygdalas कल्पना।
7. दूर प्रयोगकर्ता से अपने ललाट अंत पर पृष्ठीय सतह मस्तिष्क फ्लैट पलटें।
8. मस्तिष्क के बाईं या दाईं ओर से शुरू करें। हेमी अलग करेंतब क्षेत्रों और सन्निहित प्रमस्तिष्कखंड से कोर्टेक्स। प्रमस्तिष्कखंड के अलगाव की अनुमति देने के इस ढीले कॉर्टेक्स के रास्ते के बारे में 8 मिमी कट। छुरी के साथ प्रमस्तिष्कखंड दूर कटौती।
9. इसे भर चलता है कि अंधेरे सीवन, लगभग आधा और आधा साथ काटने से इसकी centromedial हिस्से से प्रमस्तिष्कखंड की basolateral हिस्सा अलग। इस संरचना हमेशा आसानी से नहीं पहचाना जा सकता है।
10. अलग पहचान शीशियों में प्रमस्तिष्कखंड subparts रखो और कुचल बर्फ पर रहते हैं।
11. अन्य गोलार्द्ध के साथ दोहराएँ विच्छेदन प्रक्रिया।
12. 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में शीशियों को विसर्जित कर दिया। जब तक जरूरत -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में शीशी रखें।

3. कस्पासे 3 गतिविधि

1. सुक्रोज के 0.32 एम, 1% ट्राइटन X-100, Tris- एचसीएल, पीएच 8, ethylenediaminetetraacetic एसिड 5 मिमी, dithiothreitol 2 मिमी, phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड 1 मिमी, leupeptin की 10 माइक्रोग्राम / μl 10 मिमी के साथ lysis बफर तैयार , pepstatin ए के 10 माइक्रोग्राम / μl और aprotinin के 10 माइक्रोग्राम / μl।
2. प्रत्येक नमूना (5-10 मिलीग्राम) के लिए lysis बफर के 150 μl जोड़ें। बर्फ पर रखें। अधिक से अधिक तीव्रता (40 डब्ल्यू) में 5 सेकंड के लिए बर्फ पर प्रत्येक नमूना Sonicate। 30 मिनट के लिए बर्फ पर lysis बफर में ऊतक सेते हैं। भंवर 5 मिनट के लिए प्रत्येक नमूना।
3. बारी-बारी से तरल नाइट्रोजन में और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक thermostatically नियंत्रित हीटिंग थाली पर नमूने रखकर 3 / फ्रीज पिघलना चक्र को पूरा करें। 13,000 जी पर अपकेंद्रित्र ऊतक (4 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस)। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और बर्फ पर ट्यूब में रहते हैं।
4. गोजातीय सीरम albumin के साथ 0 और 10 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच मानक प्रोटीन सांद्रता तैयार करें। केवल बफर के साथ रिक्त स्थान तैयार करें।
5. प्रत्येक मानक के ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 μl जोड़ें। 595 एनएम पर मानक पढ़ें। प्रोटीन के स्तर के लिए, आसुत जल के 795 μl और ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 μl के लिए नमूना सतह पर तैरनेवाला के 5 μl जोड़ें। 595 एनएम पर प्रत्येक नमूना पढ़ें और मानक की अवस्था के साथ प्रोटीन यों।
6. 5 मिमी ₂ MgCl के 50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7, _<साथ प्रतिक्रिया बफर तैयार/ उप>, इथाइलीन ग्लाइकॉल tetraacetic एसिड 1 मिमी, 3-cholamidopropyl का 0.1%) dimethylammonio] -1-propanesulfonate और dithiothreitol 1 मिमी।
7. सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रियाशील नमूने प्राप्त करने के लिए प्रतिक्रिया बफर और कस्पासे 3 substrates के लिए प्रोटीन की 25 ग्राम जोड़ें। नकारात्मक नमूने के लिए, प्रोटीन की 25 ग्राम, एसी-DEVD चो 800 माइक्रोन की 0.4 μl और एसी DEVD-एएमसी 10 मिमी के 0.8 μl, प्रतिक्रिया बफर जोड़ें। सकारात्मक नमूने के लिए, प्रतिक्रिया बफर के लिए प्रोटीन की 25 ग्राम और एसी DEVD-एएमसी 10 मिमी के 0.8 μl जोड़ें। तीन प्रतियों में सभी नकारात्मक और सकारात्मक नमूने प्रक्रिया। प्रतिक्रिया बफर जोड़कर 200 μl अप करने के लिए प्रत्येक नमूने की अंतिम मात्रा को पूरा करें।
8. एसी DEVD चो 800 माइक्रोन की 0.5 μl, 0.8 μl एसी DEVD-एएमसी 10 मिमी और lysis बफर के 10 μl की प्रतिक्रिया बफर के 188.7 μl जोड़कर नकारात्मक नियंत्रण का उत्पादन। सकारात्मक नियंत्रण के लिए, प्रतिक्रिया बफर के 189.2 μl, एसी-DEVD-एएमसी 10 मिमी के 0.8 μl और lysis बफर के 10 μl जोड़ें।
9. नमूने सेते हैं और37 ^ओ सी पर 3 घंटे के लिए अंधेरे में नियंत्रण
10. प्रत्येक नमूना और नियंत्रण में 600 μl ग्लाइसिन 0.4 मीटर और NaOH 0.4 एम (पीएच 10) के साथ प्रतिक्रिया बंद करो।
11. 465 एनएम के 365 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में spectrofluorometry द्वारा प्रतिदीप्ति यों। कांच क्युवेट में प्रतिक्रिया के लिए आसुत पानी के 2 मिलीलीटर जोड़ें। प्रत्येक सेकंड में 1 अंक के साथ 10 सेकंड के लिए नियंत्रण और नमूने पढ़ें।
12. प्रत्येक नमूने में विशिष्ट गतिविधि यों: ((नकारात्मक नमूने शून्य से सकारात्मक नमूनों की प्रतिदीप्ति) 2.8 मिलीलीटर की एक्स मात्रा की प्रतिदीप्ति) (प्रोटीन, 25 मिलीग्राम की ऊष्मायन 3 घंटा x मात्रा के समय) से विभाजित।

Representative Results

प्रमस्तिष्कखंड 8 दिखावा (नियंत्रण) और तीन दिन ischemia / reperfusion प्रोटोकॉल के शामिल होने के बाद 8 एमआई चूहों में अलग किया गया था। कस्पासे 3 गतिविधि सक्रिय कस्पासे 3 से चिपके रहते हैं और spectrofluorometry से पता लगाया जा सकता है कि एक fluorochrome उपयोग करते हुए इस ऊतक में मापा गया था। सकारात्मक और नकारात्मक माप (कदम 3.11, 3.12 और 3.16 देखें) प्रत्येक सेकंड में एक बिंदु के साथ, 10 सेकंड के दौरान तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया और मापा गया। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के बीच मतभेद की गणना की गई है और इस प्रयोग के दौरान प्रदर्शन सब दिखावा ऊतक के लिए मतभेद की औसत 100% पर स्थापित किया गया था। एमआई चूहों से परिणाम इस संदर्भ के अनुसार बढ़ाया गया और चित्रा 1 अंतिम परिणाम दिखाता है: यह दिखावा (पी <0.05) की तुलना में एमआई चूहों में एक काफी अधिक गतिविधि को इंगित करता है।

चित्रा 1. कस्पासे 3एमआई चूहों के प्रमस्तिष्कखंड में गतिविधि, 100% (प्रति समूह 8 चूहों) के लिए सेट, नकली नियंत्रण में मतलब गतिविधि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। * महत्वपूर्ण बीच-समूह अंतर (पी <0.05) इंगित करता है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं।

Discussion

पिछले 10 वर्षों में इस प्रोटोकॉल के साथ हमारा अनुभव महत्वपूर्ण methodological मुद्दों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया। सबसे पहले, कुचल बर्फ पर एक पेट्री डिश में तेजी से मस्तिष्क विच्छेदन तैयारी की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, यह ऊतक sonication के अन्य ऐसे दिल (10 सेकंड) के रूप में ऊतकों के प्रकार, या गुर्दे (20 सेकंड) की तुलना में मस्तिष्क प्रमस्तिष्कखंड के लिए कम है कि एहसास होना चाहिए। तीसरा, महान देखभाल ध्यान से नमूनों में जोड़ने से पहले सब्सट्रेट मिश्रण करने के लिए लिया जाना चाहिए। मिश्रण अनुक्रम अपर्याप्त था जब हम चर संकेतों का सामना करना पड़ा। नमूने जब पढ़ने चौथा, कोई बुलबुले क्वार्ट्ज सेल में मौजूद होना चाहिए। अन्यथा, संकेत बदला जा सकता है।

1 μl की तुलना में कम मात्रा से बचने के लिए सब्सट्रेट मात्रा बढ़ रही है: हम परिणामों के reproducibility बढ़ाने के लिए पिछले कुछ वर्षों में एक परिवर्तन किया है। फिर भी, छोटे बदलाव लगातार assays के बीच हो सकता है, और कम से कम 3 नियंत्रण के नमूने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएबदलाव के लिए नियंत्रण। इन पर नियंत्रण के प्रतिदीप्ति उपायों औसत रहे हैं और मतलब 100% पर सेट किया जाता है। प्रयोगात्मक नमूनों में प्रतिदीप्ति उपायों नियंत्रण के नमूने के प्रतिशत में तब्दील कर रहे हैं।

तकनीक की एक और सीमा इसलिए, कस्पासे 3 गतिविधि को कम करके आंका जा सकता है, ऊतक के केवल एक हिस्से का इस्तेमाल किया जाता है और। दरअसल, apoptosis के समय खिड़की किसी भी कोशिका में कम है और यह ^1,4,15 नमूने के समय आसपास के इलाकों में होता है, भले ही याद किया जा सकता है। उलटा भी संभव है: एपोप्टोसिस कस्पासे 3 गतिविधि की overestimation, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक के कुछ भागों में विशेष रूप से तीव्र हो सकता है। हम इस तरह के TUNEL assays या Bax / Bcl2 अनुपात (परिचय देखें) के रूप में पूरक तकनीक, के लिए शेष ऊतकों (प्रमस्तिष्कखंड) के उपयोग की सलाह देते हैं।

Spectrofluorometry पश्चिमी सोख्ता के ऊपर कम से कम दो फायदे हैं। सबसे पहले, यह सीधे मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करता है। दूसरा, यह एंजाइमी एक के उपायctivity खुद को बजाय संबंधित हो सकता है, और यह प्रोटीन अभिव्यक्ति enzymatic गतिविधि में किसी भी बदलाव के बिना बढ़ाया जा सकता है कि जाना जाता है, जो प्रोटीन या शाही सेना अभिव्यक्ति,। इसके अलावा, spectrofluorometry अन्य ऊतकों पर या विभिन्न जानवरों की प्रजातियों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और अलग अलग substrates के साथ, अन्य कस्पासे उपप्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है, तो यह है कि सुरक्षित तुलना बनाया जा सकता है।

अंत में, इस दस्तावेज़ कि एपोप्टोसिस 3 दिन एमआई के बाद लिम्बिक सिस्टम के इस क्षेत्र में होता है सबूत उपलब्ध कराने, प्रमस्तिष्कखंड में कस्पासे 3 गतिविधि को मापने के लिए spectrofluorometry के उपयोग को दर्शाता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio