Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio

Abstract

O infarto do miocárdio (MI) tem de médio e longo prazo consequências dramáticas nos níveis fisiológicos e comportamentais, mas os mecanismos envolvidos ainda não estão claros. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de rato da síndrome pós-MI que exibe funções prejudicadas cardíacas, perda neuronal no sistema límbico, déficits cognitivos e comportamentais sinais de depressão. No nível neuronal, ativação da caspase-3 medeia pós-MI apoptose em diferentes regiões límbicas, como a amígdala - atingindo um máximo de 3 dias pós-MI. Alterações cognitivas e comportamentais aparecem 2-3 semanas pós-MI e estes correlacionar estatisticamente com medidas de caspase-3 atividade. O protocolo aqui descrito é utilizado para induzir MI, coletar tecido amígdala e medir caspase-3 atividade usando espectrofluorometria. Para induzir a MI, a artéria coronária descendente é obstruída durante 40 minutos. O protocolo para a avaliação da activação da caspase-3 começa depois de 3 dias MI: os ratos são sacrificados e a amígdala isolado rapiDLY a partir do cérebro. As amostras são rapidamente congeladas em azoto líquido e mantido a -80 ° C até à análise real. A técnica utilizada para avaliar a activação de caspase-3 baseia-se na clivagem de um substrato (DEVD-AMC) por caspase-3, o qual liberta um composto fluorogénico que pode ser medido por espectrofluorometria. A metodologia é quantitativo e reprodutível, mas o equipamento necessário é caro e o procedimento para quantificar as amostras é demorado. Esta técnica pode ser aplicada a outros tecidos, tais como o coração e os rins. DEVD-AMC pode ser substituído por outros substratos para medir a actividade de outras caspases.

Introduction

As caspases ou proteases de aspartato dirigida-cisteína-dependentes são uma família de enzimas que estão envolvidas em vários homeostase processess ^1. Caspases podem ser classificados de acordo com seus papéis na apoptose ou inflamação. A caspase-1, -4, -5 e -12 estão envolvidos na inflamação enquanto que aqueles envolvidos na apoptose pode ser sub-classificados como caspases iniciadoras (caspase-8 e -9) e caspases executoras (caspase-3, -6 e -7 ).

As caspases desempenham papéis importantes em muitas patologias, principalmente em desordens nas quais a apoptose pode ser excessivo, como observado após enfarte do miocárdio (MI) ou isquemia cerebral.

No modelo de rato da síndrome pós-MI utilizado no nosso laboratório, ficou estabelecido que a caspase-3 é activado, não só no miocárdio ^2, mas também no sistema límbico, que está implicada no controlo do humor e emoções ^3-6. Veja-se também que a caspase-3 é activado em diferentes regiõesdo sistema límbico, tal como a amígdala e o hipocampo, e esta activação picos em torno de 3 dias após o insulto isquémico ^4. Curiosamente, a caspase-3 atividade está correlacionada com pós-MI deficiências comportamentais, e sua atenuação por meio de intervenções farmacológicas e nutricionais reduz essas lesões, o que sugere uma possível ligação entre caspase-3 e depressão pós-MI ^7-12.

A caspase-3 de activação pode ser medida por várias técnicas. Western blotting verifica as propriedades enzimáticas dos caspases e pode detectar enzimas activas, bem como as suas formas de pró-enzima. Western blotting, no entanto, é semi-quantitativa, e pequenas variações podem ser perdida através fracos sinal-ruído rácios ^13. Uma melhor técnica baseia-se na clivagem de um substrato (DEVD-AMC), através da caspase-3 que liberta um composto fluorogénico e podem ser medidos por espectrofluorometria. Caspase-3 é um marcador de activação é confiável de apoptose. Medição da apoptose CAn ser instável porque a janela de tempo de ocorrência é curto, e as células vizinhas poderia fagocitar corpos apoptóticos ou células ^14. A apoptose pode ser ainda confirmada por outras técnicas, tais como a desoxinucleotidil transferase terminal dUTP nick end rotulagem (TUNEL) ensaio, que detecta a fragmentação de ADN resultante de cascatas de sinalização de apoptose, ⁶ ou a proporção de proteínas pró / anti-apoptótica, tal como a Bax / Bcl2 ^6.

Protocol

Os animais são tratados em conformidade com as regulamentações do Comitê Animal Care o local, de acordo com as orientações do Canadian Council on Animal Care. Os ratos são alojados individualmente, sob condições constantes (temperatura de 21-22 ºC e umidade de 40-50%), incluindo um 12 hr ciclo escuro-claro, com início às 08h00. Pelotas de comida e água da torneira estão disponíveis ad libitum durante todo o estudo. Um período de aclimatação de 3 dias após a entrega pelo fornecedor é permitido antes do experimento. Ratos machos Sprague-Dawley pesando entre 300-800 g foram rotineiramente usado com este protocolo.

1. Cirurgia MI

1. Induzir anestesia com injecções intraperitoneais de cetamina 60 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg. Confirme anesthetization adequada por ausência de reflexo quando as patas são trilhados.
2. Raspar sítio cirúrgico. Intubate rato com tubo endotraqueal: cateter (16G 1,77 polegadas) e colocá animal em decúbito lateral. Colocar os animais numa almofada de aquecimento para manter a temperatura de cerca de 37 ° C. Conecte o tubo endotraqueal ao isoflurano a 2%.
3. Prepare sítio cirúrgico com gluconato de clorexidina e álcool isopropílico. Durante a cirurgia, usar luvas estéreis e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos para prevenir a secura e sob anestesia. Coloque campo estéril em animais e os instrumentos no outro campo estéril ao lado do animal.
4. Inciso pele com lâmina de bisturi nº 10. Descolar o tecido muscular com uma pinça hemostática. Colocar o animal em decúbito ventral. Abrir parede torácica com uma pinça e posição afastador peito hemostático. Abrir pericárdio com uma pinça hemostática.
5. Para produzir a oclusão coronária, um circuito de 360 ​​mm de comprimento de sutura de seda 4-0 à volta da artéria coronária descendente, passando através do tecido do miocárdio contígua. Insira ambas as extremidades do fio de sutura de seda num 14G, 1,25 cm longo tubo de plástico.
6. Puxar ambas as extremidades da sutura de seda e push do tubo para baixo contra a artéria para ocluir-lo, por 40 min. Oclusão seguro por aperto o tubo de plástico com uma pinça hemostática.
7. Após 40 min, a oclusão por libertar a abertura da pinça hemostática, seguido por remoção do tubo flexível e sutura de seda.
   Nota: ratos controle Sham submetidas ao mesmo procedimento cirúrgico menos a oclusão da artéria coronária.
8. Antes de fechar a parede torácica, colocar um cateter flexível (18 g, 4,5 cm) através da cavidade torácica a extrair o ar para fora do tórax com uma seringa de 5 ml para evitar pneumotórax.
9. Fechar tórax cavidade com sutura 2-0, ponto do músculo com fio de seda 4-0 ea pele com sutura de seda 3-0.
10. Antes de fechar o último ponto da pele, de novo aspirar o ar para fora do tórax com 5 ml da seringa através do cateter colocado previamente na cavidade do tórax.
11. Suturar último ponto da pele. Pare de ventilação isoflurano.
12. Monitorar despertar rato. Não deixe um animal sem supervisão até que ele tem Regained consciência suficiente para manter decúbito esternal.
13. Tratar de rato a cada 8 horas durante 24 h com um analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) e com um antibiótico (uma única dose de duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Após a cirurgia, os ratos de casas individualmente até à hora de sacrifício, ou seja, 3 dias de pós-MI.
15. Tamanho do enfarte, necrose, principalmente, é expressa como a percentagem de tecido enfartado em a área em risco de o ventrículo esquerdo. Isto pode medido usando coloração ¹¹ trifeniltetrazólio.

2. Amygdala Isolamento

1. Coloque a cabeça de animal pela primeira vez em um saco em forma de cone, com o nariz saliente da abertura extremidade mais estreita. Rato seguro para evitar qualquer movimento. Posicione sua cabeça de forma adequada na guilhotina, entre as lâminas da tesoura. Decapitar animal.
2. Coloque a cabeça do rato em um prato mantidos em gelo picado. Efectuar todos os procedimentos para o isolamento do tecido em gelo picado (4 ° C).
3. Sk aberta Corteull com uma tesoura, retire cuidadosamente bainhas ósseas com fórceps osso, puxando para cima e evitando mutilando o tecido embaixo.
4. Colocar a lâmina achatada de uma espátula entre a parte inferior do crânio e a superfície ventral posterior do cérebro e cuidadosamente separar cérebro do crânio empurrando cuidadosamente a lâmina para a frente ao longo da parte inferior do crânio até ao cérebro pode ser levantada lentamente para fora do crânio. Descarte o crânio.
5. Coloque cérebro em sua superfície dorsal. Identificar hipotálamo (estrutura em frente do cerebelo) e cortar o cérebro coronalmente em frente da sua extremidade anterior e por trás da sua extremidade posterior; descartar as anterior e posterior partes do cérebro se não for necessário para outros usos.
6. Visualize as amígdalas como pequenas esferas debaixo dos lobos temporais, bilateralmente, mesmo ao lado do hipotálamo.
7. Virar o plano cerebral em sua extremidade frontal, superfície dorsal longe do experimentador.
8. Comece com o lado esquerdo ou direito do cérebro. Separe o hemiesferas e, em seguida, o córtex da amígdala contígua. Cortar caminho de cerca de 8 mm desta córtex solto para permitir o isolamento da amígdala. Cortar amígdala com bisturi.
9. Isolar a parte basolateral da amígdala de sua parte centromedial cortando ao longo da sutura escuro que atravessa-lo, quase meio a meio. Esta estrutura nem sempre é facilmente identificável.
10. Coloque subparts amígdala em frascos separados e identificados manter em gelo picado.
11. Procedimento de dissecção Repita com o outro hemisfério.
12. Mergulhe frascos em azoto líquido durante 1 min. Manter frasco em freezer -80 ° C até serem necessárias.

3. Actividade de Caspase-3

1. Preparar tampão de lise com 0,32 M de sacarose, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilenodiaminotetra-acético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug / mL de leupeptina , 10 ug / mL de pepstatina A e 10 ug / mL de aprotinina.
2. Adicionar 150 ul de tampão de lise a cada amostra (5-10 mg). Manter em gelo. Sonicar cada amostra em gelo durante 5 segundos a intensidade máxima (40 W). Incubar o tecido em tampão de lise em gelo durante 30 min. Vortex cada amostra durante 5 minutos.
3. Realizar 3 ciclos de congelamento / descongelamento, colocando alternadamente amostras em azoto líquido e numa placa de aquecimento controlado termostaticamente ajustado a 37 ° C. Centrifugar o tecido a 13.000 g (4 ° C) durante 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante e manter em tubo em gelo.
4. Prepare a concentrações de proteína padrão entre 0 e 10 ug / ml, com albumina de soro bovino. Prepare espaços em branco, com apenas tampão.
5. Adicionar 200 ul de reagente de Bradford a cada padrão. Leia padrão a 595 nm. Para níveis de proteína, adicionam-se 5 ul de amostra de sobrenadante a 795 ul de água destilada e 200 ul de reagente de Bradford. Leia cada amostra a 595 nm e quantificar a proteína com curva padrão.
6. Preparar tampão de reacção com 50 mM de Tris-HCl, pH 7, 5 mM de _{MgCl2 <}/ sub>, 1 mM de ácido tetra-acético de etileno glicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulf onato e 1 mM de ditiotreitol.
7. Adicionam-se 25 ug de proteína para tampão de reacção e substratos de caspase-3 para obter amostras reactivas positivos e negativos. Para as amostras negativas, adicionar tampão de reacção, 25 ug de proteína, 0,4 ul de Ac-DEVD-CHO 800 uM e 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para amostras positivas, adicionar 25 mg de proteína para tampão de reacção e 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Processar todas as amostras negativas e positivas em triplicado. Completar o volume final de cada amostra até 200 mL por adição de tampão de reacção.
8. Produção de controlos negativos pela adição de 188,7 ul de tampão de reacção de 0,5 ul de Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM e 10 ul de tampão de lise. Para os controlos positivos, adicionar 189,2 ul de tampão de reacção, 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM e 10 ul de tampão de lise.
9. Incubar as amostras econtroles no escuro durante 3 horas a 37 ^{o C.}
10. Parar a reacção com 600 ul de glicina 0,4 M e NaOH a 0,4 M (pH 10) em cada amostra e controlo.
11. Quantificar fluorescência por espectrofluorometria no comprimento de onda de excitação de 365 nm de comprimento de onda e emissão de 465 nm. Adicionar 2 ml de água destilada a reacção na cuvete de vidro. Leia controles e amostras de 10 segundos com um ponto em cada segundo.
12. Quantificar a actividade específica de cada amostra: ((fluorescência de amostras negativas menos fluorescência de amostras positivas) x volume de 2,8 ml) dividido por (tempo de incubação de 3 h x quantidade de proteína de 25 mg).

Representative Results

A amígdala foi isolado em 8 simulada (controlo) e 8 mi ratos três dias após a indução do protocolo de isquemia / reperfusão. A caspase-3 foi medida a actividade neste tecido usando um fluorocromo que pode ser clivada pela caspase-3 activa e detectado por espectrofluorometria. Medidas positivas e negativas (ver passos 3.11, 3.12 e 3.16) foram realizadas em triplicado e medido durante 10 segundos, com um ponto em cada segundo. As diferenças entre os controlos positivos e negativos foram calculadas e a média das diferenças para todo o tecido simulado realizada durante esta experiência foi fixada em 100%. Os resultados de ratos MI foram dimensionados de acordo com esta referência e A Figura 1 ilustra os resultados finais: indica uma actividade significativamente mais elevada nos ratos MI em comparação com sham (p <0,05).

Figura 1. A caspase-3actividade na amígdala de ratos MI, expressa como percentagem de actividade significativo em controlos simulados, definida como 100% (8 ratos por grupo). * Indica diferença significativa entre os grupos (p <0,05). Os dados são expressos como média ± SEM.

Discussion

Nossa experiência com este protocolo durante os últimos 10 anos levou à identificação de questões metodológicas críticas. Em primeiro lugar, dissecção rápido do cérebro em uma placa de Petri sobre gelo moído é importante para manter a qualidade da preparação. Em segundo lugar, deve-se perceber que a ultra-sons de tecido é mais curto para a amígdala cerebral em comparação com outros tipos de tecidos, tais como o coração (10 seg) ou rins (20 sec). Em terceiro lugar, deve ser tomado muito cuidado para misturar cuidadosamente o substrato antes de adicionar as amostras. Encontramos sinais variáveis ​​quando a sequência de mistura foi inadequada. Em quarto lugar, não há bolhas deve estar presente na célula de quartzo, quando da leitura das amostras. Caso contrário, o sinal pode ser alterada.

Nós fizemos uma mudança nos últimos anos para aumentar a reprodutibilidade dos resultados: aumento do volume do substrato a fim de evitar o volume inferior a 1 mL. Ainda, pequenas variações podem ocorrer entre ensaios sucessivos, e, pelo menos, 3 amostras de controlo devem ser usadas parade controlo para variações. Medidas de fluorescência destes controlos são calculados e a média é estabelecida em 100%. Medidas de fluorescência em amostras experimentais são transformados em percentagem das amostras de controlo.

Outra limitação da técnica é que apenas uma parte do tecido é utilizado e, por conseguinte, a actividade da caspase-3 pode ser subestimada. Com efeito, a janela de tempo de apoptose é curto em qualquer dada célula e pode ser dispensada, mesmo que ocorre em áreas vizinhas na altura da amostragem ^1,4,15. O inverso é também possível: a apoptose pode ser particularmente intenso em porções de tecido, resultando em sobreavaliação da actividade da caspase-3. Recomendamos a utilização de tecidos remanescentes (amígdala) para técnicas complementares, tais como ensaios de TUNEL ou razão Bax / Bcl2 (ver Introdução).

Espectrofluorometria tem pelo menos duas vantagens sobre Western blotting. Em primeiro lugar, diretamente gera dados quantitativos. Em segundo lugar, mede um enzimáticaem si, em vez de expressão da proteína ou RNA, que podem ser independentes, e sabe-se que a expressão da proteína pode ser aumentada sem qualquer alteração na actividade enzimática ctividades. Além disso, espectrofluorometria pode ser realizado em outros tecidos ou com diferentes espécies de animais e podem ser ajustados para outros subtipos de caspase, com diferentes substratos, de modo que as comparações de segurança pode ser feita.

Em conclusão, este documento demonstra o uso de espectrofluorometria para medir a actividade da caspase-3 na amígdala, fornecendo a evidência de que a apoptose ocorre nesta região do sistema límbico 3 dias depois do MI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio