Caspasa-3 La actividad en la amígdala de rata Medido por espectrofluorometría Después de Infarto de Miocardio

Abstract

El infarto de miocardio (IM) tiene a medio y largo plazo consecuencias dramáticas en los niveles fisiológicos y de comportamiento, pero los mecanismos involucrados aún no están claros. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de rata de síndrome post-MI que muestra alteraciones funcionales cardíacas, pérdida neuronal en el sistema límbico, déficits cognitivos y conductuales signos de depresión. A nivel neuronal, la caspasa-3 de activación media post-MI apoptosis en diferentes regiones límbicas, como la amígdala - alcanzando un máximo de 3 días después de la MI. Alteraciones cognitivas y conductuales aparecen 2-3 semanas después de la MI y éstas se correlacionan estadísticamente con medidas de actividad caspasa-3. El protocolo descrito aquí se utiliza para inducir MI, recoger el tejido de la amígdala y medir actividad caspasa-3 utilizando espectrofluorometría. Para inducir la MI, la arteria coronaria descendente se ocluye durante 40 min. El protocolo para la evaluación de la caspasa-3 de activación empieza 3 días después de MI: las ratas se sacrificaron y se aisló la amígdala RAPIDLY desde el cerebro. Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 ° C hasta su análisis real. La técnica que se realiza para evaluar la activación de la caspasa-3 se basa en la escisión de un sustrato (DEVD-AMC) por la caspasa-3, que libera un compuesto fluorogénico que se puede medir por espectrofluorometría. La metodología es cuantitativa y reproducible pero el equipo requerido es caro y el procedimiento para la cuantificación de las muestras consume mucho tiempo. Esta técnica se puede aplicar a otros tejidos, tales como el corazón y los riñones. DEVD-AMC puede sustituirse por otros sustratos para medir la actividad de otras caspasas.

Introduction

Las caspasas o aspartato proteasas dirigida cisteína-dependientes son una familia de enzimas que están implicadas en diversos homeostasis processess ^1. Las caspasas pueden clasificarse ampliamente en función de sus roles en la apoptosis o la inflamación. Caspasa-1, -4, -5 y -12 están involucrados en la inflamación, mientras que quienes se dedican a la apoptosis puede ser sub-clasificado como caspasas iniciadoras (caspasa-8 y -9) y caspasas verdugo (caspasa-3, -6 y -7 ).

Las caspasas desempeñan papeles importantes en muchas patologías, principalmente en trastornos en los que la apoptosis puede ser excesivo, como se observa después de un infarto de miocardio (MI) o isquemia cerebral.

En el modelo de rata del síndrome post-MI utilizado en nuestro laboratorio, se establece que se activa la caspasa-3 no sólo en el miocardio ^2, sino también en el sistema límbico que está implicada en el control del estado de ánimo y emociones ^3-6. También se ve que se activa la caspasa-3 en diferentes regionesdel sistema límbico, como la amígdala y el hipocampo, y esta activación picos alrededor de 3 días después de la lesión isquémica ^4. Curiosamente, la caspasa-3 actividad se correlaciona con el post-MI alteraciones de comportamiento y su atenuación mediante intervenciones farmacológicas y nutricionales reduce estas lesiones, lo que sugiere una posible relación entre la caspasa-3 y post-MI depresión ^7-12.

Caspasa-3 de activación se puede medir mediante diversas técnicas. Western Blot comprueba las propiedades enzimáticas de las caspasas y puede detectar enzimas activas, así como sus formas pro-enzima. Western Blot, sin embargo, es semi-cuantitativa, y pequeñas variaciones se puede perder por la debilidad de la relación señal-ruido ^{de 13.} Una mejor técnica se basa en la escisión de un sustrato (DEVD-AMC) por la caspasa-3 que libera un compuesto fluorogénico y se puede medir por espectrofluorometría. Caspasa-3 de activación es un marcador fiable de la apoptosis. Medición de la apoptosis can ser inestable debido a que la ventana de tiempo de ocurrencia es corto, y las células vecinas pueden fagocitar cuerpos apoptóticos o células ^14. La apoptosis se puede confirmar más mediante otras técnicas, tales como Terminal desoxinucleotidil transferasa dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) de ensayo, que detecta la fragmentación de ADN resultante de las cascadas de señalización de apoptosis ^6, o la relación de las proteínas pro / anti-apoptóticos, tales como Bax / Bcl2 ^6.

Protocol

Los animales son manejados de acuerdo con la regulación del Comité de Cuidado de Animales local, de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Las ratas se alojan individualmente bajo condiciones constantes (temperatura de 21-22 ºC y una humedad del 40-50%), incluyendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas, comenzando a las 08:00 am. Pellets de Chow y agua corriente están disponibles ad libitum durante todo el estudio. Se permite un período de aclimatación de 3 días después de la entrega por el proveedor antes del experimento. Ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 300-800 g entre han sido utilizados rutinariamente con este protocolo.

1. MI Cirugía

1. Inducir la anestesia con inyecciones intraperitoneales de ketamina 60 mg / kg y xilazina 10 mg / kg. Confirme anestesia adecuada por la ausencia de reflejos cuando se pellizcan las zarpas.
2. Afeitado sitio quirúrgico. Intubar rata con un tubo endotraqueal: catéter (16G 1,77 pulgadas) y colocar los animales en decúbito lateral. Coloque los animales en una almohadilla térmica para mantener la temperatura alrededor de 37 ° C. Conecte el tubo endotraqueal al isoflurano 2%.
3. Preparar sitio quirúrgico con gluconato de clorhexidina y alcohol isopropílico. Durante la cirugía, use guantes estériles e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica de ambos ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Ponga campo estéril en los animales y los instrumentos sobre otro campo estéril al lado del animal.
4. Incisión de la piel con hoja de bisturí # 10. Despegar el tejido muscular con una pinza hemostática. Colocar el animal en decúbito ventral. Pared torácica abierta con una pinza y la posición de retracción torácica hemostático. Pericardio abierto con una pinza hemostática.
5. Para producir la oclusión coronaria, un bucle de 360 ​​mm de largo sutura de seda de 4-0 alrededor de la arteria coronaria descendente, pasa a través del tejido miocárdico contigua. Inserte ambos extremos de la sutura de seda en una 14G, tubo de plástico largo 1,25 cm.
6. Tire de ambos extremos de la sutura de seda y push el tubo hacia abajo contra la arteria para ocluir que, por 40 min. Oclusión Secure sujetando el tubo de plástico con una pinza hemostática.
7. Después de 40 min, liberar la oclusión por la liberación de la pinza hemostática, seguido de la eliminación del tubo flexible de sutura y seda.
   Nota: el control de ratas Sham someten al mismo procedimiento quirúrgico menos la oclusión de la arteria coronaria.
8. Antes de cerrar la pared torácica, colocar un catéter flexible (18G, 4,5 cm) a través de la cavidad torácica para extraer el aire fuera del tórax con una jeringa de 5 ml para prevenir el neumotórax.
9. Cerrar cavidad torácica con 2-0 sutura, puntada del músculo con 4-0 sutura de seda y la piel con sutura de seda 3-0.
10. Antes de cerrar el último punto de la piel, de nuevo extraer el aire fuera del tórax con 5 ml jeringa a través del catéter colocado previamente en la cavidad del tórax.
11. Suturar último punto de la piel. Deje de ventilación isoflurano.
12. Monitorear el despertar de la rata. No deje a un animal sin vigilancia hasta que tenga regained conciencia suficiente para mantener decúbito esternal.
13. Tratar rata cada 8 h durante 24 h con un analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) y con un antibiótico (una dosis única de duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Después de la cirugía, las ratas de la casa de forma individual hasta la hora del sacrificio, es decir, 3 días después de la MI.
15. El tamaño del infarto, principalmente necrosis, se expresa como el porcentaje de tejido infartado en el área en riesgo del ventrículo izquierdo. Esto puede medido utilizando la coloración de trifeniltetrazolio ^11.

2. amígdala Aislamiento

1. Coloque la cabeza del animal por primera vez en una bolsa en forma de cono, con su nariz que sobresale de la abertura de extremo estrecho. Rata seguro para evitar cualquier movimiento. Coloque la cabeza apropiada en la guillotina, entre las hojas de las tijeras. Decapitar a los animales.
2. Coloque la cabeza de la rata en un plato mantuvo en hielo picado. Realizar todos los procedimientos para el aislamiento de tejido en hielo picado (4 ° C).
3. Sk abierta Cortarull con tijeras, separar cuidadosamente envolturas óseas con gubia ósea tirando hacia arriba y evitar la mutilación de los tejidos debajo.
4. Coloque la punta plana de una espátula entre la parte inferior del cráneo y la superficie ventral posterior del cerebro y separar cuidadosamente cerebro de cráneo empujando suavemente la cuchilla hacia adelante a lo largo de la parte inferior del cráneo hasta que el cerebro puede ser levantado lentamente fuera de la cráneo. Deseche el cráneo.
5. Coloque el cerebro en su superficie dorsal. Identificar hipotálamo (estructura en la parte delantera del cerebelo) y cortar el cerebro coronal delante de su extremo anterior y detrás de su extremo posterior; descartar las partes anterior y posterior del cerebro si no es necesario para otros usos.
6. Visualice las amígdalas como pequeñas esferas debajo de los lóbulos temporales, de forma bilateral, justo al lado del hipotálamo.
7. Da la vuelta al cerebro plana en su extremo frontal, superficie dorsal de distancia del experimentador.
8. Comience con el lado izquierdo o derecho del cerebro. Separar el hemiesferas y luego la corteza de la amígdala contigua. Cortar manera alrededor de 8 mm de esta corteza floja para permitir el aislamiento de la amígdala. Cortar la amígdala con el bisturí.
9. Aislar la parte basolateral de la amígdala de su parte centromedial cortando a lo largo de la sutura oscura que corre a través de ella, casi mitad y mitad. Esta estructura no siempre es fácil de identificar.
10. Ponga subpartes amígdala en viales identificados por separado y mantener en hielo picado.
11. Procedimiento de disección Repita con el otro hemisferio.
12. Sumergir viales en nitrógeno líquido durante 1 min. Mantenga vial en -80 ° C congelador hasta que se necesite.

3. actividad caspasa-3

1. Preparar tampón de lisis con 0,32 M de sacarosa, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg / l de leupeptina , 10 g / l de pepstatina A y 10 g / l de aprotinina.
2. Añadir 150 ml de tampón de lisis a cada muestra (5-10 mg). Mantenga en hielo. Sonicar cada muestra en hielo durante 5 segundos a intensidad máxima (40 W). Incubar el tejido en tampón de lisis en hielo durante 30 min. Vortex cada muestra durante 5 min.
3. Realizar ciclos de 3 de congelación / descongelación colocando alternativamente muestras en nitrógeno líquido y en una placa de calefacción controlada por termostato a 37 ° C. Centrifugar a 13000 tejido g (4 ° C) durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante y mantener en el tubo en hielo.
4. Preparar las concentraciones de proteína estándar entre 0 y 10 mg / ml con albúmina de suero bovino. Preparar espacios en blanco con solamente búfer.
5. Añadir 200 l de reactivo de Bradford a cada norma. Leer estándar a 595 nm. Para los niveles de proteína, añadir 5 l de muestra de sobrenadante a 795 l de agua destilada y 200 l de reactivo de Bradford. Lea cada muestra a 595 nm y cuantificar la proteína con la curva estándar.
6. Preparar tampón de reacción con 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl de _{2 <}/ sub>, 1 mM de ácido tetraacético etilenglicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato y 1 mM de ditiotreitol.
7. Añadir 25 g de proteína a sustratos de tampón de reacción y la caspasa-3 para obtener muestras de reactivos positivos y negativos. Para las muestras negativas, añadir tampón de reacción, 25 g de proteína, 0,4 l de Ac-DEVD-CHO 800 mM y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para las muestras positivas, añadir 25 g de proteína al tampón de reacción y 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Procesar todas las muestras negativas y positivas por triplicado. Completar el volumen final de cada muestra hasta 200 l mediante la adición de tampón de reacción.
8. Producir controles negativos mediante la adición de 188,7 l de tampón de reacción a 0,5 l de Ac-DEVD-CHO 800 M, 0,8 l Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis. Para los controles positivos, añadir 189,2 l de tampón de reacción, 0,8 l de Ac-DEVD-AMC 10 mM y 10 l de tampón de lisis.
9. Incubar las muestras ycontroles en la oscuridad durante 3 horas a 37 ^{° C}
10. Detener la reacción con 600 l de glicina 0,4 M y NaOH 0,4 M (pH 10) en cada muestra y control.
11. Cuantificar la fluorescencia por espectrofluorometría en la excitación de longitud de onda de 365 nm de longitud de onda y la emisión de 465 nm. Añadir 2 ml de agua destilada a la reacción en cubeta de vidrio. Leer los controles y las muestras durante 10 segundos con 1 punto en cada seg.
12. Cuantificar la actividad específica en cada muestra: ((La fluorescencia de las muestras negativas, menos la fluorescencia de las muestras positivas) x volumen de 2,8 ml) dividido por (tiempo de incubación de 3 horas x cantidad de proteína de 25 mg).

Representative Results

La amígdala fue aislado en 8 simulado (control) y 8 ratas MI tres días después de la inducción del protocolo de isquemia / reperfusión. Caspasa-3 se midió la actividad en este tejido usando un fluorocromo que se puede escindir por la caspasa-3 activa y se detecta por espectrofluorometría. Medidas positivas y negativas (consulte los pasos 3.11, 3.12 y 3.16) se realizaron por triplicado y se midieron durante 10 seg, con 1 punto en cada seg. Se calcularon las diferencias entre los controles positivos y negativos y el promedio de las diferencias para todo el tejido simulado realizado durante este experimento se fijó en 100%. Los resultados de las ratas MI fueron escalados de acuerdo con esta referencia y Figura 1 ilustra los resultados finales: indica una actividad significativamente mayor en ratas MI en comparación con simulado (p <0,05).

Figura 1. La caspasa-3actividad en la amígdala de ratas MI, expresado como porcentaje de la actividad media de controles simulados, se establece en 100% (8 ratas por grupo). * Indica diferencia significativa entre los grupos (p <0,05). Los datos se expresan como media ± SEM.

Discussion

Nuestra experiencia con este protocolo en los últimos 10 años llevó a la identificación de las cuestiones metodológicas críticos. En primer lugar, la disección rápido del cerebro en un plato de Petri en hielo picado es importante para mantener la calidad de preparación. En segundo lugar, debe tenerse en cuenta que la sonicación tejido es más corto para la amígdala cerebral en comparación con otros tipos de tejidos, tales como el corazón (10 seg) o riñones (20 seg). En tercer lugar, el gran cuidado se debe tomar para mezclar cuidadosamente el sustrato antes de añadir a las muestras. Nos encontramos con señales variables cuando la secuencia de mezcla era inadecuada. En cuarto lugar, no hay burbujas deben estar presentes en la celda de cuarzo cuando se leen las muestras. De lo contrario, la señal podría ser alterado.

Hicimos un cambio en los últimos años para aumentar la reproducibilidad de los resultados: el aumento de volumen de sustrato para evitar el volumen de menos de 1 l. Sin embargo, las pequeñas variaciones pueden ocurrir entre ensayos sucesivos, y al menos 3 muestras de control deben ser usado paracontrol para variaciones. Medidas de fluorescencia de estos controles se promedian y la media se fija en el 100%. Medidas de fluorescencia en las muestras experimentales se transforman en porcentaje de las muestras de control.

Otra limitación de la técnica es que sólo se utiliza una porción de tejido y, por lo tanto, la caspasa-3 actividad podría ser subestimada. De hecho, la ventana de tiempo de la apoptosis es corto en cualquier célula dada y podría perderse a pesar de que se produce en las zonas vecinas en el momento de muestreo ^1,4,15. Lo contrario también es posible: la apoptosis podría ser particularmente intensa en porciones de tejido, dando lugar a una sobreestimación de la caspasa-3 actividad. Se recomienda el uso de los tejidos restantes (la amígdala) para técnicas complementarias, tales como ensayos TUNEL o relación Bax / Bcl2 (véase la Introducción).

Espectrofluorometría tiene al menos dos ventajas sobre la transferencia Western. En primer lugar, se genera directamente datos cuantitativos. En segundo lugar, mide enzimática unsí mismo en lugar de proteína o la expresión del ARN, que puede ser no relacionado, y se sabe que la expresión de proteínas se puede aumentar sin ningún cambio en la actividad enzimática ctividad. Por otra parte, espectrofluorometría se puede realizar en otros tejidos o con diferentes especies de animales y se puede ajustar para otros subtipos de caspasas, con diferentes sustratos, por lo que las comparaciones de seguros puede ser hecho.

En conclusión, este documento demuestra el uso de espectrofluorometría para medir la caspasa-3 actividad en la amígdala, proporcionando evidencia de que la apoptosis se produce en esta región del sistema límbico 3 días después de un IM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio