Kaspas-3-aktivitet i Rat Amygdala Mätt med spektrofluorometri efter hjärtinfarkt

Abstract

Hjärtinfarkt (MI) har dramatiska mitten och långsiktiga konsekvenser på de fysiologiska och beteendemässiga nivåer, men mekanismerna är involverade är fortfarande oklart. Vårt laboratorium har utvecklat en råttmodell av post-MI-syndrom som visar nedsatt hjärtfunktion, neuronal förlust i det limbiska systemet, kognitiva brister och beteendemässiga tecken på depression. På det neuronala nivå, medierar caspas-3-aktivering efter Ml apoptos i olika limbiska regioner, såsom amygdala - topp vid 3 dagar efter Ml. Kognitiva och beteende nedskrivningar visas 2-3 veckor efter MI och dessa korrelerar statist med åtgärder av kaspas-3-aktivitet. Protokollet som beskrivs här används för att inducera Ml, samla amygdala vävnad och mäta kaspas-3-aktivitet med användning spektrofluorometri. För att inducera Ml är nedåtgående kransartären ockluderades under 40 minuter. Protokollet för utvärdering av kaspas-3-aktivering startar 3 dagar efter Ml: råttorna avlivades och amygdala isolerade rapiDLY från hjärnan. Proverna frystes snabbt i flytande kväve och hölls vid -80 ° C fram till själva analysen. Tekniken utföras för att bedöma caspas-3-aktivering är baserad på klyvning av ett substrat (DEVD-AMC) genom kaspas-3, som frigör en fluorogen förening som kan mätas genom spektrofluorometri. Metodiken är kvantitativ och reproducerbar men den utrustning som krävs är dyra och förfarandet för kvantifiering av proverna är tidskrävande. Denna teknik kan tillämpas på andra vävnader, såsom hjärta och njurar. DEVD-AMC kan ersättas av andra substrat för att mäta aktiviteten hos andra kaspaser.

Introduction

Kaspaser eller cystein-beroende aspartat riktad proteaser är en familj av enzymer som är involverade i olika homeostas processer som ^en. Kaspaser kan grovt klassificeras enligt deras roller i apoptos eller inflammation. Kaspas-1, -4, -5 och -12 är involverade i inflammation, medan de som ägnar sig apoptos kan vara sub-klassificeras som initiator kaspaser (kaspas-8 och -9) och bödel kaspaser (kaspas-3, -6 och -7 ).

Kaspaser spelar viktiga roller i många sjukdomar, främst i sjukdomar där apoptos kan vara överdriven, som observerats efter hjärtinfarkt (MI) eller cerebral ischemi.

I råttmodellen av post-MI syndrom som används i vårt labb, står det klart att kaspas-3 aktiveras inte bara i hjärtmuskeln ² men också i det limbiska systemet, som är inblandad i kontrollen av humör och känslor ^3-6. Det framgår också att caspas-3 aktiveras i olika regionerav det limbiska systemet, såsom amygdala och hippocampus, och detta aktiverings toppar runt 3 dagar efter ischemisk skada ^4. Intressant, korrelerar kaspas-3-aktivitet med post-MI beteende nedskrivningar och dess dämpning genom farmakologiska och näringsrika ingripanden minskar dessa skador, vilket tyder på en möjlig koppling mellan kaspas-3 och efter MI depression ^7-12.

Caspas-3-aktivering kan mätas genom olika tekniker. Western blotting konstaterar de enzymatiska egenskaperna hos kaspaser och kan detektera aktiva enzymer samt deras pro-enzymformer. Western blotting, dock är semikvantitativ, och små variationer kan förloras genom svaga signal-brusförhållanden ^13. En bättre teknik är baserad på klyvning av ett substrat (DEVD-AMC) genom kaspas-3 som frisätter en fluorogen förening, och kan mätas genom spektrofluorometri. Caspas-3-aktivering är en pålitlig markör för apoptos. Mätning av apoptos can vara instabil eftersom tidsfönstret för händelsen är kort, och angränsande celler skulle fagocytera apoptotiska kroppar eller celler ^14. Apoptos kan bekräftas ytterligare av andra tekniker, såsom terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick ändmärkning (TUNEL) analys, som detekterar DNA-fragmentering är resultatet av apoptotiska signalkaskader ^6, eller förhållandet mellan pro- / antiapoptotiska proteiner, såsom Bax / BCL2 ^6.

Protocol

Djuren hanteras i enlighet med regleringen av den lokala Animal Care kommittén i enlighet med riktlinjerna i den kanadensiska rådet om Animal Care. Råttor är inhysta individuellt under konstanta förhållanden (temperatur på 21-22 ° C och luftfuktighet på 40-50%), inklusive en 12 timmars mörker ljus cykel, börjar klockan 08:00. Chow pellets och kranvatten finns tillgängligt ad libitum under hela studien. En acklimatiseringsperiod av 3 dagar efter leverans av leverantören får före försöket. Sprague-Dawley med en vikt mellan 300-800 g har rutinmässigt användas med detta protokoll.

1. Ml Kirurgi

1. Inducera anestesi med intraperitoneala injektioner av ketamin 60 mg / kg och xylazin 10 mg / kg. Bekräfta korrekt anesthetization genom frånvaron av reflex när tassarna kläms.
2. Raka operationsområdet. Intuberas råtta med endotrakealtuber: kateter (16G 1.77 inches) och placera djur i sidoläge decubitus. Placera djuren på en värmedyna för att bibehålla temperaturen runt 37 ° C. Anslut endotrakealtuben att isofluran 2%.
3. Förbered operationsområdet med klorhexidinglukonat och isopropylalkohol. Under operationen, använder sterila handskar och steriliserade instrument. Applicera oftalmologiska salva i båda ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Sätt sterilt område på djur och de instrument på en annan sterila området bredvid djuret.
4. Incise huden med skalpell blad # 10. Lossnar muskelvävnad med en hemostatisk klämma. Placera djuret i ventrala trycksår ​​position. Öppen bröstkorg vägg med en hemostatisk klämma och ställning bröst upprullningsdon. Öppna perikardium med en hemostatisk klämma.
5. För att producera koronar ocklusion, en slinga av en 360 mm-lång 4-0 silkesutur runt nedåtgående kransartären, som passerar genom den sammanhängande myokardvävnad. Sätt båda ändarna av silkesutur i en 14G, 1,25 cm lång plastslang.
6. Dra båda ändarna av silkesutur och push röret nedåt mot artären att ockludera den, till 40 minuter. Säker ocklusion genom att klämma plaströret med en hemostatisk klämma.
7. Efter 40 minuter, släpp ocklusion genom att släppa den hemostatiska klämman, följt av avlägsnande den flexibla slangen och silkessutur.
   Obs: Sham kontrollråttor genomgå samma kirurgiska ingrepp minus ocklusion av kransartären.
8. Före stängning av thoraxväggen, placera en flexibel kateter (18G, 4,5 cm) genom brösthålan för att dra luft ut ur bröstkorgen med en 5-ml spruta för att förhindra pneumotorax.
9. Stäng thorax hålighet med 2-0 sutur, sy muskeln med 4-0 silke sutur och huden med 3-0 silke sutur.
10. Före stängning av sista huden punkten, återigen dra luft ut ur thorax med 5-ml spruta genom katetern placeras tidigare i bröstkorgen hålighet.
11. Sutur sista hud punkt. Stoppa isofluran ventilation.
12. Övervaka råtta uppvaknande. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har Regained tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
13. Behandla råtta varje 8 h under 24 timmar med ett analgetikum (buprenorfin, 0,05 mg / kg ip) och med ett antibiotikum (en enda dos av duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Efter operationen, house råttor individuellt tills tidpunkten för avlivandet dvs 3 dagar efter MI.
15. Infarktstorlek, främst nekros, uttrycks som andel av infarkt vävnad i riskområdet från vänster kammare. Detta kan mätas med användning av triphenyltetrazolium färg ^11.

2. Amygdala Isolering

1. Placera djuret huvudet först i en konformad väska, med nosen som skjuter ut från den smala änden öppningen. Säker råttan att undvika rörelse. Placera huvudet på lämpligt sätt på giljotinen, mellan skärbladen. Decapitate djur.
2. Placera chef för råttan i en skål som hålls på krossad is. Utför alla förfaranden för vävnadsisolering på krossad is (4 ° C).
3. Uppskuren skull med sax, försiktigt loss ben slidor med ben rongeurs genom att dra upp och undvika stympa vävnaden under.
4. Placera den platta bladet av en spatel mellan botten av skallen och den bakre ventrala ytan av hjärnan och försiktigt loss hjärnan från skallen genom att försiktigt trycka bladet framåt längs botten av skallen tills hjärnan kan sakta lyftas upp ur kranium. Kassera skallen.
5. Placera hjärnan på dess rygg yta. Identifiera hypothalamus (struktur framför lillhjärnan) och skär hjärnan koronalt framför dess främre ände och bakom dess bakre ände; kassera de främre och bakre delar av hjärnan om de inte behövs för annan användning.
6. Visualisera amygdalas som små sfärer under den temporala loberna, bilateralt, precis bredvid hypotalamus.
7. Vänd på hjärnan platt på sin främre ände, rygg yta bort från försöksledaren.
8. Börja med vänster eller höger sida av hjärnan. Separera hemisfärer och sedan cortex från angränsande amygdala. Skär way omkring 8 mm från detta lösa kortex för att medge isolering av amygdala. Skär bort amygdala med skalpell.
9. Isolera basolaterala delen av amygdala från sin centromedial del genom att skära längs den mörka suturen som löper över den, nästan hälften och hälften. Denna struktur är inte alltid lätt att känna igen.
10. Sätt amygdala delmoment i separata identifierade flaskor och hålla på krossad is.
11. Upprepa dissekering förfarandet med den andra halvklotet.
12. Doppa ampuller i flytande kväve under 1 minut. Förvara injektionsflaskan i -80 ° C frys tills det behövs.

3. kaspas-3-aktivitet

1. Förbered lysbuffert med 0,32 M sackaros, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM etylendiamintetraättiksyra, 2 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 pg / pl leupeptin , 10 ug / ul pepstatin A och 10 mikrogram / l aprotinin.
2. Tillsätt 150 | il lysbuffert till varje prov (5-10 mg). Håll på is. Sonikera varje prov på is under 5 sekunder vid maximal intensitet (40 W). Inkubera vävnad i lysbuffert på is under 30 minuter. Vortexa varje prov i 5 minuter.
3. Utför tre frysnings / upptiningscykler genom att placera prover växelvis i flytande kväve och en termostatstyrd värmeplatta, ställd till 37 ° C. Centrifugera vävnad vid 13 tusen g (4 ° C) under 10 minuter. Försiktigt bort supernatanten och hålla röret på is.
4. Bered standardproteinkoncentrationer mellan 0 och 10 mikrogram / ml med bovinserumalbumin. Förbered ämnen med enbart buffert.
5. Tillsätt 200 pl av Bradford reagens till varje standard. Läs standard vid 595 nm. För proteinnivåer, tillsätt 5 il prov supernatanten till 795 | j, l destillerat vatten och 200 fil av Bradford-reagens. Läs varje prov vid 595 nm och kvantifiera protein med standardkurva.
6. Förbered reaktionsbuffert med 50 mM tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCb _{2 <}/ sub>, 1 mM etylenglykol tetraättiksyra, 0,1% av 3-kolamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat och 1 mM ditiotreitol.
7. Tillsätt 25 mikrogram av protein till reaktionsbuffert och kaspas-3 substrat för att erhålla positiva och negativa reaktiva prover. För negativa prover, lägga reaktionsbuffert, 25 ^ g protein, 0,4 pl av Ac-DEVD-CHO 800 iM och 0,8 pl av Ac-DEVD-AMC 10 mM. För positiva prov, tillsätt 25 mikrogram av protein till reaktionsbuffert och 0,8 l av Ac-DEVD-AMC 10 mM. Behandla alla negativa och positiva prover i tre exemplar. Slutföra den slutliga volymen av varje prov upp till 200 | j, l genom tillsats av reaktionsbuffert.
8. Producera negativa kontroller genom tillsats 188.7 pl av reaktionsbuffert till 0,5 | il Ac-DEVD-CHO 800 pM, 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM och 10 | il av lysbuffert. För positiva kontroller, till 189.2 pl av reaktionsbuffert, 0,8 pl av Ac-DEVD-AMC 10 mM och 10 | il av lysbuffert.
9. Inkubera prov ochkontroller i mörker under 3 h vid 37 ^{° C}
10. Stoppa reaktionen med 600 pl glycin 0,4 M och NaOH 0,4 M (pH 10) i varje prov och kontroll.
11. Kvantifiera fluorescens genom spektrofluorometri vid excitationsvåglängd av 365 nm och emissionsvåglängd av 465 nm. Tillsätt 2 ml destillerat vatten till reaktion i glaskuvett. Läs kontroller och prover för 10 sek med en poäng på varje sekund.
12. Kvantifiera specifik aktivitet i varje prov: ((Fluorescence negativa prover minus fluorescens positiva prov) x volym av 2,8 ml) dividerat med (inkubationstid 3 timmar x mängden protein 25 mg).

Representative Results

Amygdala isolerades i 8 sham (kontroll) och 8 mi råttor tre dagar efter induktionen av ischemi / reperfusion-protokollet. Caspas-3-aktivitet mättes i denna vävnad med användning av en fluorokrom som kan klyvas av aktiv kaspas-3 och detekterades genom spektrofluorometri. Positiva och negativa mätningar (se steg 3.11, 3.12 och 3.16) utfördes i tre exemplar och mäts under 10 sekunder, med en poäng på varje sekund. Skillnader mellan positiva och negativa kontroller beräknades och medelvärdet av skillnaderna för alla sken vävnad utförts under detta experiment fastställdes till 100%. Resultat från MI råttor skalas enligt denna referens och Figur 1 visar de slutliga resultaten: det tyder på en betydligt högre aktivitet i MI råttor jämfört med placebo (p <0,05).

Figur 1. Caspas-3aktivitet i amygdala i MI råttor, uttryckt i procent av genomsnittlig aktivitet i skenkontroller, satt till 100% (8 råttor per grupp). * Indikerar signifikant mellan grupperna skillnad (p <0,05). Data uttrycks som medelvärde ± SEM.

Discussion

Vår erfarenhet med detta protokoll under de senaste 10 åren har lett till identifiering av kritiska metodfrågor. För det första är snabb hjärna dissektion i en petriskål på krossad is viktigt att upprätthålla preparationskvalitet. För det andra måste man vara medveten om att vävnadsultraljudsbehandling är kortare för cerebral amygdala jämfört med andra typer av vävnader, såsom hjärta (10 sek) eller njurar (20 sek). För det tredje bör stor försiktighet vidtas för att noggrant blanda substratet innan den läggs till proven. Vi upptäckte variabla signaler när blandningssekvensen var otillräcklig. För det fjärde bör inga bubblor vara närvarande i kvartscell vid läsning proverna. Annars kan signalen ändras.

Vi gjorde en förändring under de senaste åren för att öka resultatens reproducerbarhet: ökande substrat volym för att undvika volym mindre än 1 pl. Ändå kan små variationer förekommer mellan på varandra följande analyser, och åtminstone 3 kontrollprover bör användas för attkontroll för variationer. Fluorescence åtgärder för dessa kontroller i genomsnitt och medelvärdet är satt till 100%. Fluorescence åtgärder i experimentella prover omvandlas i procent av kontrollprover.

En annan begränsning hos tekniken är att endast en del av vävnad som används och därför kunde kaspas-3-aktivitet underskattas. Faktum är kort i varje given cell tidsfönstret av apoptos och skulle kunna missas även om det förekommer i angränsande områden vid tiden för provtagning ^1,4,15. Det omvända är också möjligt: ​​apoptos kan vara särskilt intensiv i delar av vävnad, vilket resulterar i överskattning av kaspas-3-aktivitet. Vi rekommenderar användning av återstående vävnader (amygdala) för kompletterande tekniker, såsom Tunel analyser eller Bax / Bcl2 förhållande (se inledningen).

Spektrofluorometri har åtminstone två fördelar jämfört med Western blotting. Först, direkt genererar den kvantitativa data. För det andra, den mäter enzymatisk enctivity själv snarare än protein eller RNA-expression, som kan vara orelaterade, och det är känt att proteinuttryck kan ökas utan någon förändring av enzymatisk aktivitet. Dessutom kan spektrofluorometri utföras på andra vävnader eller med olika djurarter och kan justeras för andra kaspas subtyper, med olika substrat, så att säkra jämförelser kan göras.

Sammanfattningsvis demonstrerar detta dokument användningen av spektrofluorometri att mäta kaspas-3-aktivitet i amygdala, vilket ger bevis på att apoptos sker i detta område av det limbiska systemet 3 dagar efter Ml.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio