Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Abstract

Miyokard infarktüsü (Mİ) fizyolojik ve davranışsal düzeyde dramatik orta ve uzun vadeli sonuçları vardır, ancak ilgili mekanizmalar hala belirsizdir. Laboratuvarımız bozulmuş kardiyak fonksiyonları, limbik sistemde nöronal kayıp, bilişsel açıkları ve depresyon belirtileri gösterir davranışsal post-MI sendromu sıçan modeli geliştirmiştir. Post-MI 3 gün zirve - nöronal düzeyde, kaspaz-3 aktivasyonu gibi amigdala gibi farklı limbik bölgelerde, post-MI apoptozu aracılık eder. Bilişsel ve davranışsal bozukluklar 2-3 haftalar sonrası MI görünür ve bu kaspaz-3 aktivitesi önlemleri ile istatistiksel korelasyon. Burada açıklanan protokol, MI neden amigdala doku toplamak ve spectrofluorometry kullanarak kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için kullanılır. MI teşvik etmek için, inen koroner arter 40 dakika tıkanır. Sıçanlar kurban edilir ve amigdala rapi izole: kaspaz-3 aktivasyonu değerlendirilmesi için protokol 3 gün MI sonra başlarbeyin GEC. Numuneler hızlı bir şekilde sıvı azot içinde donduruldu ve gerçek analiz kadar -80 ° C'de tutulur. Kaspaz-3 aktivasyonunu değerlendirmek için tekniklerin spectrofluorometry ile ölçülebilir bir flüorojenik bileşiği serbest kaspaz-3, bir alt-tabaka (DEVD-AMC) bölünmesine dayanmaktadır. Yöntem niceliksel ve tekrarlanabilir ama gerektiren ekipman pahalıdır ve numune ölçülmesi için prosedür, zaman alıcıdır. Bu teknik, kalp ve böbrek gibi diğer dokuların, tatbik edilebilir. DEVD-AMC için diğer kaspaz aktivitesini ölçmek için diğer substratlar ile ikame edilmiş olabilir.

Introduction

Kaspazlar ya Sistein bağımlı aspartat yönelik proteazlar çeşitli homeostazı süreçlerini ¹ katılan bir enzim ailesidir. Kaspazlar geniş apoptosis veya inflamasyon kendi rollerine göre sınıflandırılabilir. Kaspaz-1, -4, -5 ve -12 apoptosis uğraşanların olabilir oysa inflamasyon katılan alt sınıflandırılmış başlatıcı kaspazlara olarak (kaspaz-8 ve -9) ve cellat kaspazlar (kaspaz-3, -6 -7 ve ).

Miyokard enfarktüsü (MI) veya serebral iskeminin ardından gözlemlenen Kaspazlar, esas olarak apoptoz fazla olabilir hastalıklarda çok patolojilerin önemli rol oynar.

Bizim laboratuvarda kullanılan post-MI sendromunun sıçan modelinde, bu kaspaz-3 miyokardın ² değil, aynı zamanda ruh ve duyguların ^3-6 kontrolünde karıştığı limbik sistemde sadece etkin olduğunu kurulmuştur. Ayrıca, kaspaz-3, farklı bölgelerde aktif olduğu görülmektedirlimbik sistemin, bu tür amigdala ve hipokampus ve iskemik hakaret ⁴ sonra 3 gün etrafında bu aktivasyon zirveleri olarak. İlginçtir, kaspaz-3 aktivitesi post-MI davranış bozuklukları ile ilişkilidir ve farmakolojik ve beslenme müdahaleler yoluyla zayıflama kaspaz-3 ve post-MI depresyon ^7-12 arasındaki olası bağlantıyı düşündüren, bu yaralanmaları azaltır.

Kaspaz-3 aktivasyonu, çeşitli teknikler ile ölçülebilir. Western blotting kaspaz enzimatik özellikleri tespit eder ve aktif enzimler olarak pro-enzim biçimleri algılayabilir. Western lekeleme, ancak yarı-kantitatif ve küçük varyasyonlar, zayıf sinyal-ses oranlarına ¹³ ile kaybolabilir. Daha iyi bir teknik, bir florojenik bileşiği serbest bırakır ve spectrofluorometry ölçülebilir kaspaz-3, bir alt-tabaka (DEVD-AMC) bölünmesine dayanmaktadır. Kaspaz-3 aktivasyon apoptoz güvenilir bir göstergesidir. Apoptoz ca ölçümün oluşma zaman penceresi kısa olduğu için kararsız ve komşu hücrelerin apoptotik organları veya hücreleri ¹⁴ fagosite olabilir. Apoptosis ayrıca, Bax / olarak apoptotik sinyal silsileleri ^6, ya da anti-apoptotik / pro protein oranı, elde edilen DNA parçalanmasını algıladığı, örneğin terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç işaretleme analizi (TÜNEL) deneyi gibi diğer teknikler tarafından teyit edilebilir Bcl2 ^6.

Protocol

Hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi İlkelerine uygun olarak, yerel Hayvan Bakım Komitesi yönetmeliğine uygun olarak ele alınır. Sıçanlar, (21-22 ºC sıcaklık ve% 40-50 nem) ayrı ayrı sabit koşullarda muhafaza edilir 08:00 am başlayan, 12 saat karanlık-aydınlık döngüsünün dahil. Chow pelet ve musluk suyu çalışma boyunca ad libitum. Tedarikçi tarafından doğum sonrası 3 günlük bir alışma dönemi deney öncesi izin verilir. 300-800 g arasında olan erkek Sprague-Dawley sıçanları rutin olarak bu protokol ile kullanılmıştır.

1. MI Cerrahisi

1. Ketamin 60 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi neden. Pençeleri sıkışmak zaman refleksinin yokluğu ile doğru anesthetization onaylayın.
2. Cerrahi siteyi Tıraş. (16G 1.77 inç) kateter ve lateral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin: endotrakeal tüp ile entübe sıçan. Sıcaklık yaklaşık 37 ° C tutmak için bir ısıtma pedi üzerine hayvanlar koyun. % 2 izofluran endotrakeal tüp bağlayın.
3. Klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile cerrahi siteyi hazırlayın. Ameliyat sırasında steril eldiven ve steril aletler kullanın. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için her iki göze oftalmik merhem sürün. Hayvan ve hayvan yanındaki başka bir steril alanında araçlara steril alan yerleştirin.
4. Neşter bıçak # 10 ile cildi İnsizyon. Hemostatik kelepçe ile kas dokusu soyulabilir. Ventral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin. Hemostatik kelepçe ve pozisyon göğüs Retraktörü Açık göğüs duvarı. Hemostatik kelepçe ile Açık perikard.
5. Bitişik miyokard dokusu geçerek, koroner oklüzyon, döngü inen koroner arterin etrafında 360 mm uzunluğunda 4-0 ipek sütür üretmek. Bir 14G, 1,25 cm uzunluğunda plastik tüp içine ipek sütür her iki ucunu yerleştirin.
6. Ipek sütür ve irin iki ucunu çekinh aşağı arterin karşı tüp 40 dakika, bunu tıkanması için. Bir hemostatik kelepçe ile plastik tüp sıkma ile Güvenli tıkanıklığı.
7. 40 dakika sonra, esnek boru ve ipek dikiş çıkarılarak hazırlanabilir hemostatik kelepçe, serbest tarafından oklüzyonu bırakın.
   Not: Sham kontrol fareler aynı cerrahi prosedür eksi koroner arter tıkanıklığı uğrarlar.
8. Torasik duvar kapatmadan önce, pnömotoraks önlemek için 5 ml şırınga ile toraks havayı dışarı çekmek için göğüs boşluğundan esnek bir kateter (18G, 4.5 cm) yerleştirin.
9. Kapat toraks boşluğu 2-0 sütür ile, 4-0 ipek sütür ile kas ve 3-0 ipek sütür ile cilt dikiş.
10. Geçen cilt noktasını kapatmadan önce, yine göğüs boşluğuna önce yerleştirilmiş kateter ile 5 ml şırınga ile toraks havayı çizin.
11. Geçen cilt noktasını dikin. Izofluran havalandırma durdurun.
12. Sıçan uyanış izleyin. O Regaine olana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınd yeterli bilinç sternum yatma korumak için.
13. Bir antibiyotik ile bir analjezik (buprenorfin, 0,05 mg / kg ip) ile 24 saat (duplocillin tek bir dozu, 0.2 mg / kg ip) için sıçana her 8 saat tedavi edin.
14. Ameliyattan sonra, ev fareleri tek tek, yani kurban zamanına kadar, 3 gün sonrası MI.
15. Enfarktüs büyüklüğü, özellikle nekroz sol ventrikülün risk altındaki alanlarda bulunan enfarktlı doku oranı olarak ifade edilir. Bu trifeniltetrazolyum renklenme ¹¹ kullanılarak ölçülür olabilir.

2. Amygdala İzolasyon

1. Onun burnu dar olan uç açıklığı dışarı çıkıntılı, bir koni şeklinde çanta içinde ilk hayvan kafası yerleştirin. Güvenli sıçan herhangi bir hareketi önlemek için. Makas bıçakları arasında, giyotin üzerinde uygun başını yerleştirin. Hayvan başını kesmek.
2. Bir tabak sıçan Yeri başkanı ezilmiş buz tuttu. Ezilmiş buz (4 ° C) doku olarak ayırma işlemleri gerçekleştirir.
3. Cut açık skull makasla dikkatlice yukarı çekerek ve altındaki dokuyu yaralama kaçınarak kemik rongeurs kemik kılıfları ayırmak.
4. Kafatasının alt ve beynin posterior ventral yüzeyi arasında bir spatula düz bıçağı yerleştirin ve dikkatlice beyin yavaşça dışarı kaldırdı olabilir kadar yavaşça kafatasının alt kısmı boyunca ileriye doğru bıçağı iterek kafatası beyin ayırmak kafatası. Kafatası atın.
5. Dorsal yüzeyinde beyin yerleştirin. Hipotalamus (beyincik önünde yapısını) tanımlamak ve ön ucu ve arka ucu önünde ve arkasında koronale beyin kesmek; diğer kullanımlar için gerekli değilse beynin ön ve arka bölümlerini atmak.
6. Hemen yanında hipotalamus, bilateral, temporal lob altında küçük küreler olarak amygdalas gözünüzde canlandırın.
7. Uzakta deneyci gelen, onun ön ucundaki dorsal yüzeyini beyin düz çevirin.
8. Beynin sol veya sağ tarafı ile başlayın. Hemi ayırınDaha sonra küreler ve mücavir amigdala gelen korteks. Amigdala izolasyonunu sağlamak için bu gevşek korteksin yolu yaklaşık 8 mm kesin. Neşter ile amigdala kesip.
9. Karşıya çalışan karanlık sütür, neredeyse yarı yarıya boyunca keserek kendi centromedial kısmından amigdala bazolateral kısmını ayırın. Bu yapı her zaman kolayca tanımlanabilir değildir.
10. Ayrı tespit şişelerde amigdala alt parçalarının koyun ve ezilmiş buz üzerinde tutmak.
11. Diğer yarımkürede ile tekrarlayın diseksiyon prosedürü.
12. 1 dakika süre ile sıvı azot içinde şişeleri bırakın. Ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C dondurucu içinde flakonu tutun.

3. Kaspaz-3 Aktivite

1. Sukroz 0.32 M,% 1 Triton-X-100, Tris-HCI, pH 8, etilendiamintetraasetik asit 5 mM, ditiyotreitol 2 mM, fenilmetilsülfonil fluorür, 1 mM, leupeptin, 10 ug / ul 10 mM liziz tamponu , pepstatin A 10 mg / ml aprotinin, 10 ug / ml.
2. Her numune (5-10 mg), lizis tamponu 150 ul ekle. Buz üzerinde tutun. Maksimal şiddette (40 W) 5 saniye boyunca buz üzerinde her örnek sonikasyon. 30 dakika boyunca buz üzerinde liziz tamponunda doku inkübe edin. Vorteks 5 dakika boyunca her bir numune.
3. Alternatif olarak sıvı azot içinde ve 37 ° C'de ayarlanmış bir termostatik olarak kontrol edilen ısıtma plakası üzerinde numuneler yerleştirilerek 3 donma / çözülme devrelerine gerçekleştirin. 13.000 g Santrifüj doku (4 10 dakika boyunca ° C). Dikkatle süpernatant kaldırmak ve buz üzerinde tüp içinde tutmak.
4. Büyükbaş hayvan serum albümini ile 0 ve 10 ug / ml arasında, standart protein konsantrasyonları hazırlayın. Sadece tampon maddesi ile boşlukları hazırlayın.
5. Her standart Bradford reaktifi 200 ul ekle. 595 nm standart okuyun. Protein seviyeleri için, damıtılmış su içinde 795 | il Bradford reaktifi 200 ul numune süpernatan 5 ul ekleyin. 595 nm'de her bir örnek okuma ve standart eğri ile protein miktarı belirlenir.
6. 5 _mM MgCl2, 50 mM Tris-HCI, pH 7, _<reaksiyon tamponu hazırlayın/ sub>, etilen glikol tetraasetik asit, 1 mM, 3-kolamidopropil% 0.1) dimetilamonyo] -1-propansülfonat ve ditiotreitol, 1 mM.
7. Pozitif ve negatif reaktif örnekleri elde etmek reaksiyon tamponu ve kaspaz-3 yüzeylerde proteinin 25 ug ekleyin. Negatif numuneler için, proteinin 25 ug, Ac-DEVD-CHO 800 uM 0.4 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul reaksiyon tamponu ilave edin. Pozitif örnekler için, reaksiyon tamponu proteinin 25 ug ve Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul ekle. Üç nüsha halinde tüm negatif ve pozitif örnekleri işleyin. Reaksiyon tamponu ilave edilerek 200 ul kadar Her numunenin son hacim tamamlanması.
8. Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0.5 ul, 0.8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM liziz tamponu 10 ul reaksiyon tampon maddesi 188,7 ul ekleyerek negatif kontrolleri üretir. Pozitif kontroller için, reaksiyon tamponu 189.2 ul, Ac-DEVD-AMC 10 mM, 0.8 ul lizis tamponu 10 ul ekle.
9. Örnekleri inkübe ve37 ^O ° C'de 3 saat süreyle karanlıkta kontroller
10. Her bir numune ve kontrol 600 ul 0.4 M glisin ve NaOH 0.4 M (pH 10) ile reaksiyonu durdurun.
11. 465 nm, 365 nm ve emisyon dalga uyarma dalga boyunda spectrofluorometry ile floresan ölçmek. Bir cam küvet içinde reaksiyona damıtık su 2 ml ilave edilir. Her saniyede 1 puan 10 saniye boyunca kontrolleri ve numuneleri okuyun.
12. Her bir örnekte spesifik aktivitesi niceliğini: ((negatif numuneler eksi pozitif örneklerin floresan) 2,8 ml x hacim floresan) (Protein 25 mg inkübasyon 3 saat x miktarı zaman) bölünmesidir.

Representative Results

Amigdala 8 sham (kontrol) ve üç gün iskemi / reperfüzyon protokolü indüksiyonundan sonra 8 MI sıçanlarda izole edildi. Kaspaz-3 aktivitesi, aktif kaspaz-3 ile ayrıldı ve spectrofluorometry ile tespit edilebilir bir florokrom ile bu dokuda ölçülmüştür. Pozitif ve negatif ölçümler (adımları 3.11, 3.12 ve 3.16 bakınız) her saniyede 1 puan, 10 saniye boyunca üç nüsha olarak gerçekleştirilen ve ölçüldü. Pozitif ve negatif kontroller arasındaki fark hesaplanır ve bu deney sırasında gerçekleştirilen tüm sahte doku farkların ortalaması% 100 olarak ayarlandı. MI sıçanlardan sonuçları bu referansa göre ölçeklenmiştir ve Şekil 1 nihai sonuçları göstermektedir: bu sham (p <0.05) ile karşılaştırıldığında MI farelerde önemli ölçüde daha yüksek etkin olduğunu gösterir.

Şekil 1. Kaspaz-3MI sıçanların amigdala aktivite,% 100 (grup başına 8 sıçan) olarak ayarlanır, sahte kontrol grubunda ortalama aktivite yüzdesi olarak ifade edilir. * Anlamlı gruplar arası fark (p <0.05) gösterir. Veri, ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir.

Discussion

Son 10 yılda bu protokol ile Deneyimlerimiz kritik metodolojik konular belirlenmesine yol açmıştır. İlk olarak, kırılmış buz üzerine bir petri çanağına hızlı beyin diseksiyon hazırlanması kalitesini muhafaza etmek önemlidir. İkinci olarak, doku sonication, diğer kalp (10 saniye) ve dokuların türleri veya böbreklerin (20 saniye) ile karşılaştırıldığında, serebral amigdala daha kısa olduğunu fark edilmelidir. Üçüncü olarak, büyük bir özenle dikkatle örnekleri eklemeden önce alt tabakayı karıştırmak için alınmalıdır. Karıştırma dizisi yetersiz Biz ne zaman değişken sinyaller karşılaştık. Örnekleri okurken Dördüncü olarak, kabarcıklar, kuvars hücrede mevcut olması gerekmektedir. Aksi takdirde, bir sinyal değiştirilebilir.

1 ul daha az hacim önlemek için alt tabaka hacminin artırılması: Biz sonuçların tekrarlanabilirliği artırmak için son yıllarda bir değişiklik yaptı. Yine, küçük varyasyonları izleyen tahliller arasında meydana gelebilecek, ve en az 3 kontrol numuneleri için kullanılmalıdırvaryasyonlar için kontrolü. Bu kontrollerin Floresan tedbirleri ortalaması alınır ve ortalama% 100 olarak belirlenmiştir. Deneysel örneklerde Floresan tedbirleri kontrol numunelerinin yüzde dönüşür.

Tekniğin bir başka sınırlama, bu nedenle kaspaz-3 aktivitesi göz ardı edilebilir, doku sadece bir kısmı kullanıldığı ve. Nitekim, apoptoz zaman penceresi herhangi bir hücrede kısa ve ^1,4,15 örnekleme sırasında komşu bölgelerde oluşuyor olsa bile kaçırmış. Bunun tam tersi de mümkündür: apoptoz kaspaz-3 aktivitesi olduğundan fazla tahmin sonuçlanan doku bölümleri, özellikle yoğun olabilir. Biz böyle TÜNEL deneyleri veya Bax / Bcl2 oranı (bkz) gibi tamamlayıcı teknikler, kalan dokuların (amigdala) kullanmanızı tavsiye ederiz.

Spectrofluorometry Western blot üzerinde, en azından iki avantajı vardır. Birincisi, doğrudan nicel veri üretir. İkincisi, bu enzimatik a ölçerctivity kendisi yerine ilgisiz olabilir, ve protein ifadesi enzimatik etkinlikteki herhangi bir değişiklik olmadan arttırılabilir bilinmektedir proteini veya RNA ekspresyon. Ayrıca, spectrofluorometry diğer dokularda veya farklı hayvan türleri ile yapılabilir ve farklı alt-tabakalar ile ve diğer kaspaz alt-tipleri için ayarlanabilir, böylece güvenli bir karşılaştırma yapılabilir.

Sonuç olarak, bu belgenin o apoptoz 3 gün MI sonrası limbik sistemin bu bölgede meydana kanıt sağlama, amigdala kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için spectrofluorometry kullanımını gösterir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio