تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Abstract

تجارب لقياس خصائص نفاذية microvessels perfused بشكل فردي توفر جسرا بين التحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية تنظيم نفاذية الأوعية الدموية في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانية وخصائص الصرف الوظيفية للأسرة بأكملها الاوعية الدموية الدقيقة. ووصف طريقة ليقني؛ يدخل القنية ويروي microvessels venular من مساريق الفئران وقياس التوصيل الهيدروليكي للجدار microvessel. المعدات الرئيسية اللازمة تشمل مجهر حيوي داخلي مع مرحلة كبيرة المعدلة التي تدعم micromanipulators وضع ثلاث microtools مختلفة: (1) micropipette مشطوف زجاج ليقني؛ يدخل القنية ويروي microvessel. (2) كوب الصغرى مطبق لمنع عابر نضح وتمكين قياس transvascular حركة تدفق الماء عند الضغط الهيدروستاتيكي قياس، و (3) قضيب زجاج حادة لتحقيق الاستقرار في أنسجة المساريقي في موقع إقناء؛ إدخال القنية. وتعديل لانديس الصغرى انسداد TECHNIQرق يستخدم خلايا الدم الحمراء المعلقة في الإرواء الصناعي كعلامات لحركة السوائل transvascular، وأيضا تمكن يتم التحكم بدقة القياسات المتكررة لهذه التدفقات يتم تغيير الظروف التجريبية كما والهيدروستاتيكي والغروي فرق الضغط الأسموزي عبر microvessels. قياسات التوصيل الهيدروليكي لأول مرة باستخدام الإرواء التحكم، ثم بعد إعادة إقناء؛ إدخال القنية من نفس microvessel مع perfusates اختبار تمكين إقران مقارنات بين استجابة microvessel في ظل هذه الظروف تسيطر عليها بشكل جيد. وكانت محاولات لتمديد طريقة لmicrovessels في مساريق الفئران مع التعديلات الجينية المتوقع أن تعديل نفاذية الأوعية الدموية محدودة للغاية بسبب غياب microvessels طويلة مستقيمة وغير متفرع في مساريق الماوس، ولكن مؤخرا بالاطلاع على الفئران مع التعديلات الجينية مماثلة تستخدم ومن المتوقع أن فتح مجالات جديدة للتحقيق حيث الطرق الموضحة في هذه الوثيقة يمكن تطبيقها على كريسبر التكنولوجيا / Cas9.

Introduction

تروية دقيقة في الأوعية الدموية يستلزم إنشاء تسيطر تدفق وسائل الإرواء الاصطناعي للتكوين المعروفة عبر micropipette في أحد الأوعية الدموية عادة ما تكون أقل من 40 ميكرون في القطر. ولا تزال السفينة perfused ضمن بيئة الأنسجة الطبيعية، ويتم مع perfused الدم حتى الحيوان لوقت إقناء؛ إدخال القنية. عندما تستخدم بالاقتران مع مجموعة من تصوير الفيديو أو تقنيات فلوروميتريك، تروية دقيقة في الموقع يتيح قياس الماء والمذاب التدفقات عبر جدران microvessels في ظل الظروف التي لا يعرف القوى الدافعة لهذه التدفقات وخصائص نفاذية جدار الأوعية الدموية يمكن أن يكون تقييم مباشرة. وعلاوة على ذلك، من خلال التحكم في تكوين السائل المحيط microvessel في الأنسجة (الإرواء وsuperfusate)، وتنظيم نفاذية microvessel وتبادل يمكن التحقيق من خلال تمكين الخلايا البطانية التي تشكل الجدار microvessel أن تتعرض لمجموعة متنوعة من البريدشروط xperimental (منبهات، وظروف نضح تعديلها، مؤشرات لقياس الفلورسنت تكوين الخلايا والإشارات) لفترات قياسها بدقة من الزمن (ثانية إلى ساعة). بالإضافة إلى ذلك، التقييمات التركيبية أو cytochemical الهياكل الجزيئية الخلوية الأساسية التي تنظم حاجز يمكن التحقيق في نفس microvessels التي يقاس نفاذية مباشرة. النهج مما يشكل جسرا بين التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتعديل وظيفة حاجز غشائي في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانية والتحقيق في microvessels سليمة. راجع ما يلي استعراض لمزيد من التقييم ^1-6.

وجود قيود على تروية دقيقة هو أنه لا يمكن أن تستخدم إلا في سرير الاوعية الدموية الدقيقة التي هي رقيقة وشفافة ولها السلامة الهيكلية كافية لتمكين إقناء؛ إدخال القنية مع micropipette الزجاج. بينما التحقيقات في وقت مبكر تستخدم microvessels الضفدع في مساريق ورقيقة الجلدي الذبحة مuscle ^7،8، حتى الآن إعداد الأكثر استخداما في نماذج الثدييات هو مساريق الفئران ^9-15. وقد ركزت معظم الدراسات على التغيرات الحادة في نفاذية الأوعية الدموية درس على مدى فترات من 1-4 ساعة، ولكن تم تمديد مزيد من التحقيقات الأخيرة لقياسات على السفن الفردية 24-72 ساعة بعد نضح الأولي ^12،16. التكنولوجيا كريسبر وضعت مؤخرا، والتي وعود لجعل نماذج الفئران المعدلة وراثيا أكثر المتاحة لدراسة الأوعية الدموية تنظيم نفاذية ^{17 ينبغي} تمكين الطرق الموضحة في هذه الاتصالات ليتم تطبيقها في microvessels venular من مساريق في هذه النماذج الهامة الفئران الجديدة.

يتطلب أسلوب مجهر مقلوب مجهزة مرحلة المجهر عرف بني كبيرة بما يكفي لاحتواء كل من اعداد الحيوانات وثلاثة على الأقل micromanipulators تستخدم لموقف microtools بالقرب من السفينة perfused ومحاذاة micropipette نضح مع السفينةالتجويف. يمكن على سبيل المثال أن ملفقة منصة مخصصة لمرحلة المجهر XY (حوالي 90 × 60 سم) من مسطحات الصلب 1 سم مع طلاء مقاوم للصدأ. يتم إرفاق مرحلة إلى جدول مؤشر الهندسة أو شريحتين-حمامة ذيل شنت في الزوايا وعلى أعمدة تفلون أو نقل الكرة للحركة في المستوى الأفقي. A تلاعب نموذجي (انظر الشكل 2) لديه الكثير من القواسم المشتركة مع المجهر وmicropositioning المعدات المستخدمة لمجموعة من التجارب دوران الأوعية الدقيقة حيوي داخلي مثل تلك لقياس واحد تدفق الأوعية الدموية والهيماتوكريت، والتسليم الأكسجين المحلي microvessels الدم perfused، وتنظيم الأوعية الدموية على نحو سلس قوة العضلات، وتراكم الاوعية الدموية الدقيقة المحلي لاستشفاف الفلورية حقنها في الدورة الدموية بأكمله. ^18-26

الجانب الأساسي من هذه التقنية هو قياس حجم التدفق (J _ت) عبر مساحة محددة (S) من الجدار microvessel. لإنجازهذا عبر تقنية انديس تعديل الموصوفة هنا المجهر المقلوب بسيط هو كاف. هي التي شنت كاميرا فيديو صغيرة على المنفذ صورة وإشارة الفيديو، مع قاعدة الوقت المحتسب بدل الضائع، يتم عرضها على شاشة الفيديو وتسجيلها إما في شكل رقمي على الكمبيوتر أو إشارة رقمية أو التناظرية على مسجل الفيديو. بمجرد مقنى وmicrovessel جزء من microvessel مرئية للكاميرا يمكن تغيير عن طريق تحريك خشبة المسرح والمتلاعبين كوحدة دون تعطيل إقناء؛ إدخال القنية.

قياس التدفقات transvascular يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع التحقيقات أكثر تفصيلا باستخدام مجهر مضان متطورة مع الفلاتر المناسبة مثل الحفارات المستخدمة لقياس نفاذية المذاب، ورصد نسبة الفلورسنت من الكالسيوم حشوية أو الآليات الخلوية الأخرى، ومتحد البؤر التصوير ^{6،12،13، 27.} والميزة الرئيسية لجميع المناهج تروية دقيقة هي القدرة على اتخاذ تدابير المتكررة، على السفينة نفسها، في ظل تغير تسيطر عليها القوة الدافعة مثل الضغوط الهيدروستاتيكي وoncotic، أو تغيير يتسبب في ردود السفينة إلى حالات الالتهابات. التصميم الأكثر شيوعا هو المقترنة المقارنة من قياس التوصيل الهيدروليكي (L _ص) على نفس السفينة مع السفينة perfused أولا عن طريق micropipette مليئة الإرواء السيطرة وتعليق الخلايا الحمراء لإقامة دولة نفاذية خط الأساس، ثم مع ماصة الثانية مع وكيل اختبار تضاف إلى الإرواء. cannulations المتعددة ممكنة مع دورة متكررة بعد ضخه مع ماصة السيطرة.

يوضح هذا البروتوكول إقناء؛ إدخال القنية وتروية دقيقة من سفينة venular في مساريق الفئران لتسجيل تدفقات المياه عبر الجدار microvessel وقياس L _{p من} جدار الوعاء الدموي، وهو مؤشر مفيد للنفاذية مسار مشترك للمياه والأملاح عبر سليمة حاجز غشائي. يتم استدعاء الإجراء لانديس TECHNIQ تعديلرق لأن المبدأ لانديس الأصلي من استخدام الحركة النسبية للخلايا الدم الحمراء كإجراء الصرف السائل transvascular بعد حظره هو الحفاظ على ²⁸ التروية، ولكن مجموعة من الظروف التجريبية (على سبيل المثال، فإن الاختلافات ضغط oncotic الهيدروستاتيكي وزلال عبر الجدار microvessel) تتوفر بعد تروية دقيقة هي أكبر بكثير مما كانت عليه في uncannulated الدم perfused microvessels ^8،29.

Protocol

بيان الأخلاق: تم استعراض جميع الإجراءات واعتمادها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. تصنيع أولي بال micropipettes، Restrainers، والحاجزون

1. سحب عدة أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية نظيفة في نصف باستخدام مجتذب الإلكترونية تعديلها بحيث، عند سحبها، الجزء الممتد من الأنبوب حوالي 1 سم في الطول ونصفين هما متماثل إلى حد ما. تأكد من أن تفتق يتسق مع الأبعاد في الشكل 1. استخدام كل شطر عن بال micropipettes، restrainers وحاصرات.
   1. شطبة على بال micropipettes باستخدام الهواء يحركها طحن عجلة ³⁰ مع 0.5 ميكرون ورقة جلخ استحم بالماء. ضبط زاوية من حامل micropipette بحيث تكون حوالي 30 درجة من الأفقي.
   2. اغسل وجفف بال micropipettes باستخدام الشفط لسحب الأسيتون النظيفة من خلال طرف ويصل رمح. تفقد بال micropipettes (الشكل 1A) باستخدام مجهر تستقيم صغير مع 4 × 40 × والأهداف مزودة حامل micropipette مقطع التمساح والشبيكة العدسة.
   3. اختر بال micropipettes مع تلميح افتتاح حوالي 50 ميكرون طويل مع شطبة طوله / نسبة العرض ما بين 3.1 و 3.5 و مع نقطة مدبب بشكل حاد مما يساعد على اختراق ألياف الكولاجين صعبة في مساريق.
   4. تخزين 15-20 بال micropipettes بمساحات مختلفة قليلا في مربع خالية من الغبار.
2. جعل restrainers باستخدام الأنابيب الشعرية سحبت أعدت في الخطوة 1.1). عقد أنبوب زجاجي الشعرية سحبت لفترة وجيزة قرب microflame لتشكيل نهاية حادة (الشكل 1B). تخزين عدة في مربع خالية من الغبار.
3. جعل microoccluders باستخدام الأنابيب الشعرية سحبت أعدت في الخطوة 1.1). عقد الأنابيب الشعرية سحبت تحت microflame وبلطف ثني (باستخدام محول الأنابيب، على سبيل المثال، 23G) غيض غرامة (حوالي 4 ملم من غيض) لجعل زاوية ما يقرب من 120 درجة إلى رمح (

2. إعداد الحيوانية وجراحة

1. تخدير الذكور (350-450 جم) أو إناث فئران سبراج داولي (200-300 غرام) مع الصوديوم بنتوباربيتال (80-100 ملغ / كغ، سيغما الدريخ، P3761) عن طريق الحقن تحت الجلد. حماية مساريق عن طريق عدم استخدام الحقن داخل الصفاق.
2. في جميع أنحاء العمليات الجراحية التجريبية والبروتوكولات، والحفاظ على التخدير عن طريق الحقن التكميلية (30 ملغ / كلغ) حسب الحاجة. تحديد عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص القدمين أو منعكس القرنية. بعد الانتهاء من إجراء التجارب، الموت ببطء الفئران عن طريق جرعة زائدة بنتوباربيتال أو الحقن داخل القلب من كلوريد البوتاسيوم المشبعة تحت التخدير.

3. إعداد حلول والكريات الحمر لاستخدامها بوصفها علامات تدفق

1. يعد حل الثدييات قارع الأجراس لsuperfusate وحل التحكم الإرواء (عادة الثدييات حل رينغر تحتوي على 10 ملغ / مل الأحماض الدهنيةالحرة ألبومين المصل البقري، BSA).
   1. مرشح الإرواء من خلال 0.2 ميكرون مرشحات حقنة لإزالة الجسيمات الصغيرة التي قد منع غيض micropipette. تصفية في حاوية نظيفة صغيرة.
2. إعداد الكريات الحمراء عن طريق رسم حوالي 0.2 مل دم من الوريد ذيل فأر تخدير في إبرة 20G على حقنة صغيرة تحتوي على 0.05 مل الهيبارين (1000 U / مل)، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على حوالي 14 مل الثدييات حل حل رينغر .
   1. أجهزة الطرد المركزي لحزمة بلطف خلايا الدم الحمراء (حوالي كحد أقصى 200 × ز لمدة 7 دقائق). رسم من طاف واعادة تعليق الخلايا الحمراء في حل رينغر.
   2. بعد الطرد المركزي وإزالة طاف ثلاث مرات تترك الخلايا الحمراء معبأة في الجزء السفلي من أنبوب لاستخدامها لاحقا. لاحظ أن هذا الإجراء يقلل من الصفائح الدموية في perfusates النهائي إلى أقل من 0.1٪ من المستويات العادية ^31.

4. ترتيب الأنسجة على الحيوانصينية

1. حلق البطن من الفئران تخدير من أسفل السرة إلى عملية الخنجري. تأكد من أن منطقة حلق تمتد في جميع أنحاء الجانب الأيمن (على الفئران وضعت على الجانب الأيمن) حتى أن الشعر لا تشكل الفتيل لرسم superfusate من الأنسجة بشكل جيد. إزالة الشعر قطع مع الشاش المبللة أو الأنسجة.
   1. عقد الجلد مع ملقط مسنن حادة وجعل شق خط الوسط (2-3 سم) من خلال الجلد باستخدام مقص قوي. باستخدام غرامة (القزحية) مقص جعل شق مماثل من خلال الخط ألبا، ورفع جدار البطن مع ملقط مسنن لتجنب إتلاف القناة الهضمية.
   2. مع الحيوان على جانبها على علبة الحيوان، وسحب بلطف خارج القناة الهضمية من تجويف البطن باستخدام أدوات تطبيقها من القطن ذات الرؤوس (عصا خشبية) غارقة في حل قارع الأجراس وملقط مسنن حادة. ترتيب القناة الهضمية في الأنسجة بشكل جيد بحيث يتم رايات مساريق على عمود للعرض من خلال المجهر مع الحرص على تجنب لمس مساريق (بوتيهإتلاف ntially microvessels) مع أي ملقط أو القطن.
      ملاحظة: علبة الحيوان (الشكل 2A) يمكن بناؤها من زجاجي ويتطلب الأنسجة بشكل جيد (حوالي 3 ملم العميقة)، ركنا واضحا بصريا (على سبيل المثال، الكوارتز المصقول حوالي 2 سم ديا و 5 ملم عالية)، ومنصة الاحترار تعديل للحفاظ على درجة حرارة الحيوان. سمك عمود يجب ألا تتجاوز المسافة عمل الهدف.
2. ضع علبة الحيوان على المسرح المجهر بحيث مساريق مرئيا من خلال العدسات.
3. ضع خط بالتنقيط بالجاذبية لsuperfuse باستمرار مساريق مع حل الثدييات رينغر الحفاظ على 35-37 درجة مئوية. استخدام قطع من الشاش لعقد الأمعاء في المكان، وتساعد على الاحتفاظ بالرطوبة، والفتيل حل الزائدة رينغر من السطح. ضبط تدفق ونضح المخلفات للحفاظ على سمك superfusate ثابت.
4. تحديد الهدف microvessels venular، والتي هيقطاعات غير متفرع المصب من تدفق متقاربة، واحد أو اثنين من الفروع البعيدة إلى الشعيرات الدموية الحقيقية. العثور على سفينة غير متفرع (من الناحية المثالية، 600 إلى 1000 ميكرومتر في الطول) وجود تدفق الدم السريع وخالية من الخلايا البيضاء إصرارها على جدار الوعاء الدموي.
5. وضع اختبار microvessel في وسط الميدان المجهر ونقل رادع في موقف بالقرب من موقع إقناء؛ إدخال القنية المختار.

5. تعبئة Micropipette وجبل في حامل

1. فقط قبل cannulating، تعليق الخلايا الحمراء في الإرواء. إضافة 7 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء معبأة إلى 0.5 مل سائل الإرواء في نظيفة أنبوب اختبار البورسليكات. ملاحظة: Hematocrits من 1-3٪ يمكن استخدامها، ولكن سوف الهيماتوكريت ثابت يؤدي إلى تركيزات الإرواء متسقة من أي المواد التي تطلق من خلايا الدم الحمراء.
2. تناسب حقنة 1 مل مع محول 23G أنابيب وأنابيب PE 50 (5-15 سم طول). رسم سائل الإرواء / أحمر خليط الخلية إلى المحقنة. عكس حقنة لخلط وطرد جميع فقاعات من أنابيب ومحول. لزيادة الكفاءة، وتناسب أنابيب لعدة الحقن قبل بدء التجربة والاحتفاظ بها في مربع مجانا الغبار أو كيس من البلاستيك.
3. ملء micropipette من خلال دفع الأنابيب في نهاية كبيرة من micropipette حتى يتاخم المنطقة مدبب. تطبيق دفعة سريعة لطيف على المكبس حقنة لملء غيض micropipette. ملاحظة: هناك تيار صغير أو قطرات يجب أن يكون مرئيا في تلميح إلى أدلة تعبئة كاملة.
4. سحب الأنبوب في حين دفع بلطف على المكبس لملء جزء أوسع من رمح micropipette. إزالة الفقاعات الصغيرة في رمح واسع من قبل عبها بعناية رمح micropipette. ملاحظة: تم توضيح إجراء مماثل ^32.
5. وضع micropipette في حامل ماصة مع منفذ الجانب الذي يسمح اتصال السائل المستمر لمقياس الماء. تأكد من أن حامل، والتي يتم تركيبها على محرك هيدروليكي تستخدم للسيطرة على النهوض بشكل جيد جدا من micropipette، هو في زاوية طفيف (15-25 درجة)إلى أفقي بحيث حافة تفتق micropipette لا تصل القناة الهضمية أو صينية.
6. تركيب محرك هيدروليكي على micromanipulator المنقولة، التي لديها X، Y، Z ومحركات لتمكين محاذاة قريبة من وعاء الاختبار (الشكل 2).
7. ضبط الضغط الهيدروستاتيكي تطبيقها على السوائل في micropipette باستخدام حقنة أو مملوءة بالماء لمبة المطاط لتغيير ارتفاع السوائل في عمود الماء لمقياس ضغط الدم إلى نحو 40 شركة بيت إدارة المال _{2 O} فوق مساريق.
8. يقني؛ يدخل القنية في microvessel في أقرب وقت ممكن بعد ملء ماصة. خلايا الدم الحمراء تترسب في القاع من ماصة، وذلك بعد حوالي 40 دقيقة عدد قليل جدا من خلايا الدم الحمراء سوف تتدفق في الإناء.

6. Microcannulation والاوعية الدموية الدقيقة قياس الضغط

1. قبل تحديد المواقع micropipette شغل تحت المجهر، اضغط بلطف رادع على الأنسجة بالقرب من microvessel استخدام القوة الكافية لقبضة الأنسجة. رسمرادع الظهر، وتمتد قليلا الأنسجة تمشيا مع microvessel بحيث يتم الانحياز تشدد في ألياف الكولاجين المساريقي مع السفينة.
   1. محاذاة micropipette مع السفينة وخفضه إلى عرض من خلال العدسات. مكان غيض فقط المنبع للموقع إقناء؛ إدخال القنية المختار وخفضه على النسيج بحيث يعرقل جزئيا التدفق داخل السفينة، ولكن لا تسد عليه.
2. يقني؛ يدخل القنية السفينة من قبل القيادة طرف ماصة ببطء في التجويف سفينة باستخدام محرك هيدروليكي. يجب الحرص على عدم المضي قدما في الجانب السفلي من السفينة.
   ملاحظة: كما يدخل micropipette التجويف، والإرواء يغسل بسرعة الدم في الأوعية من التجويف وسائل الإرواء بحرية تدفقات للتداول القاصي الحيوان لاختبار microvessel مما أدى إلى تهجير بعض نضح الدم الطبيعي في الأوعية المصب.
3. خفض ضغط التروية من خلال تعديل مقياس ضغط الدم إلى الدم (كما هو مبينبواسطة خلايا الدم الحمراء الحيوان) ويوجه مرة أخرى في الجزء perfused. يحدد هذا الضغط التوازن فيها خلايا الدم الحمراء تتذبذب برفق في التجويف السفينة ويقيس الضغط الهيدروستاتيكي microvessel (P _ج) في نهاية البعيدة للقطاع microvessel. الحفاظ على سفينة نضح في كل الضغوط فوق هذا الضغط التوازن.

7. Microocclusion وجمع البيانات

1. خطوة اختيارية: قبل استخدام مطبق الصغير لمنع السفينة، اضغط عليه في الأنسجة في منطقة غير المستخدمة من مساريق بعيدا عن أي سفينة بحيث غيض يتراكم لوحة رائعة من الأنسجة التي تحمي السفينة التجريبية خلال الدقيقة المتكررة انسداد.
2. وضع مانع فوق السفينة perfused بالقرب من الحافة السفلى من مجال المجهر.
3. تسجيل يلي مع الفيديو والصوت.
   1. فظيا تسجيل موقع لموقع كتلة وانخفاض حافة الشاشة كما يظهر من خلال الشبيكة العدسة.
   2. مع طرفمن مانع وضعت للتو فوق microvessel، استخدام جهاز التحكم ض غرامة من micromanipulator لخفض بلطف مانع حتى يتم المغطي تدفق في السفينة. ملاحظة الضغط مقياس ضغط الدم (P _ج) على الصوت. تطبيق انسداد عادة ل3-10 ثانية، ثم الإفراج عنهم، استعادة التروية مجانا. نقل الموقع كتلة تصل السفينة نحو غيض ماصة في 5-10 ميكرون خطوات على أساس الوقت (> 5 دقائق بعد كتلة الأولي في موقع)، وعدد من انسداد (3-5)، لمنع سفينة أضرار الجدار في موقع كتلة .

8. تحليل البيانات وقياس L _ص (نفاذية المياه)

1. أثناء تشغيل الفيديو، تحديد المسافة الأولية (ℓ ₀₎ من خلية حمراء علامة لموقع الانسداد باستخدام صورة لميكرومتر المرحلة والمواقف المعروفة على الصور. تحديد السرعة الأولية (dℓ / دينارا) للخلية علامة من موقفها في عدة إطارات خلال ثانية 3-10 من الصور المسجلة. ردعالألغام في دائرة نصف قطرها السفينة (ص) من الصور التي التقطت خلال الانسداد (الشكل 3).
2. حساب J _{ت /} S لكل انسداد باسم (dℓ / دينارا) × (1 / ℓ ₀₎ × (ص / 2). حساب L _ص في الضغط المستمر باسم (J _{ت /} S) مقسوما على ضغط القيادة (الضغط microvessel - الضغط الاسموزي الغروانية فعال، وانظر مناقشة).

Representative Results

ويبين الشكل 4 نتائج قياس مدار الساعة من التغييرات في L _ص في الفئران venular microvessel مقنى تباعا مع أربعة perfusates ³³ تم استخدام حجم L _ص محسوبة على الضغط المستمر كمقياس للتغييرات في microvessel جدار النفاذية، لأول مرة في سيطرة الدولة مع الإرواء تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري ثم عندما تعرضت السفينة إلى براديكينين كيل التهابات (لبنك) باستخدام micropipette الثاني تحتوي على 10 نانومتر لبنك. تسبب براديكينين زيادة عابرة في L _ص أن عاد نحو القيمة السيطرة على احقا 10-15 دقيقة. ثم أعيد perfused-السفينة مع تحكم الإرواء لمدة 30 دقيقة لإعادة تأسيس خط الأساس مستقرة. عندما perfused في microvessel باستخدام micropipette الرابع مع نفس التركيز من لبنك وكذلك 1 ميكرومتر سفينغوزين-1-phospate (S1P) في الإرواء، والموهن الاستجابة للبنك كبير. درجةتم العثور على توهين عندما perfused لبنك وS1P في الوقت نفسه أن تكون مماثلة لتلك التي تقاس في التجارب الأخرى التي تم إضافتها S1P إلى الإرواء تصل إلى 20 دقيقة قبل التعرض لللبنك. هذه النتائج تدل على قوة تكون قادرة على إجراء قياسات متعددة من L _{p على} سفينة واحدة، وتبين أن عمل وكيلا مثل S1P لتحقيق الاستقرار في جدار الوعاء الدموي في وجود عامل التهابي يمكن أن تحل لفترات زمنية على ترتيب بضع ثوان. في أوعية منفصلة أجريت دراسات التحكم بها مع بروتوكول مماثل في غياب S1P لإظهار أن توهين للاستجابة لبنك لم يكن بسبب الحساسية المفرطة.

بالنسبة لبعض تصاميم تجريبية من المهم لتقدير كل من معامل الانعكاس المذاب لجزيء (σ) وL _ص. ويتم إنجاز هذا أفضل من خلال قياس J _الخامس في الضغوط المتعددة على كل microvessel الفردية ويبين الشكل 5 تجربة طن كلاهما L _ص والضغط oncotic الفعال من 5٪ الزلال في الإرواء (π _الزلال = 27 بيت إدارة المال _{2 O} في 37 ° C) قدرت في ظل الظروف عندما لم يكن هناك الزلال في الأنسجة المحيطة microvessel الفئران. في هذه التجارب J _{ت /} تم قياس S في ثلاثة الضغوط المختلفة. وL _ص هو المنحدر من العلاقة بين J _{ت /} S والضغط، واعتراض على محور الضغط هو الفرق الفعال الضغط oncotic عبر جدار الوعاء الدموي (σΔπ).

الشكل 1. Microtools للنضح من microvessels الفردية. (A) A micropipette لإقناء؛ إدخال القنية من microvessels الفئران مع طرف مشطوف. (B) A رادع لعقد مساريق الأنسجة مستقرة بالقرب من موقع إقناء؛ إدخال القنية. (C) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. تلاعب حيوي داخلي لتروية دقيقة. (A) نظرة عامة على علبة الحيوان مع micromanipulators وmicrotools الموجهة على الزجاج عمود. (B) مرحلة معدنية كبيرة شنت على طاولة الهندسة والمحامل الداعمة. (C) مخدرة الفئران مع microtools في مراكز للتروية دقيقة من microvessel. (D) إغلاق عرض من مساريق خلال التجربة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا فيقو إعادة.

الشكل 3. قياس معدل الترشيح في وحدة المساحة باستخدام تقنية لانديس تعديلها. ويبين هذا التخطيطي لmicrovessel مقنى واحد مع micropipette وقضيب الاغلاق وضعه فوق السفينة. مباشرة بعد يسد microvessel، والمسافة (ℓ ₀₎ بين علامة RBC السفر على محور من microvessel المغطي وموقع الانسداد يتم تسجيلها بحيث يمكن تتبع مسار خلية لمدة 5-10 ثانية بعد انسداد. تستخدم الموقف المبدئي (ℓ ₀₎ والسرعة الأولية (dℓ / دينارا) للخلية لحساب متوسط ​​معدل الترشيح لكل وحدة مساحة من الجدار microvessel بين الخلية علامة وموقع الانسداد. ثم يتم رفع microoccluder، ونضح كفلت مجانية قبل أن يتم إجراء قياسات إضافية.كوم / ملفات / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إظهار الرقم 4. البيانات التمثيلية التي سفينغوزين-1-فوسفات (S1P) تثبيط يعمل بسرعة جدا براديكينين (لبنك و 10 نانومتر). تسبب في زيادة عابرة في microvessel L _ص. S1P تطبيقها كما بالتزامن مع براديكينين الثاني اختبار (لبنك) تحول دون الحادة لبنك استجابة بالنسبة إلى الأول لبنك. تدل هذه البيانات على أن وقت التعرض لعامل اختبار يمكن تعديلها لتقييم حركية تفعيل استجابة المثبطة. على وجه التحديد، S1P تطبيقها بالتزامن فقط مع لبنك تحول دون بقوة الاستجابة لبنك. كان S1P 1 ميكرومتر، وكان لبنك 10 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. قياس J _{ت /} S تحت ضغوط متعددة تمكن كلا L _ص والضغط oncotic فعال لأن تقاس، وتدفق الترشيح، J _{ت /} S، تم قياس في هذه السفينة على مختلف microvessel الضغوط الهيدروستاتيكي خلال نضح مع BSA (50 ملغ مل ^{- 1؛} π = 27 بيت إدارة المال _{2 O)،} في حين كان حمم مساريق مع حل رينغر خالية من البروتين. المنحدر للعلاقة بين J _{ت /} S والضغط هو L _ص واعتراض على محور ضغط يشير إلى الفرق الفعال الضغط oncotic عبر جدار الوعاء الدموي. في هذه التجربة كان ليرة لبنانية 1.2 × 10 ^-7 (سم ثانية ^-1 بيت إدارة المال _{2 O} ^-1) وكان σΔπ 24 بيت إدارة المال ₂ O. <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تفاصيل L الحسابات _ص. على الرغم من أن تحدث حركة السوائل transvascular بينما perfused السفينة بحرية، وهذا التبادل هو أبعد ما يكون صغير جدا بحيث لا يمكن قياسها خلال نضح الحرة لأنها عادة ما تكون أقل من 0.01٪ من معدل نضح السفينة. ومع ذلك، عندما نضح توقف عابر التي تسد microvessel، وتدفق transvascular (أي الترشيح) يقاس من حركة خلايا الدم الحمراء علامة في التجويف كعمود من السوائل بين الخلايا الحمراء علامة وموقع الانسداد يقصر كما هو موضح في الشكل (3). واعتمادا على تعقيد وطول بروتوكول تجريبي سفينة غير متفرع وهناك حاجة إلى 600 ميكرومتر في الطول 1000.

عندما لا يتم المغطي السفينة والضغط مقياس ضغط الدم يقود تدفق من خلال microvessel، وانخفاض الضغط عبر طرف ماصة كبير بحيث ضغط microvessel خلال نضح الحرة هي عادة فقطقليل من بيت إدارة المال ₂ 0 فوق الضغط المصب. في المقابل، خلال انسداد انخفاض الضغط عبر ماصة صغيرة جدا بسبب السوائل تدخل ببطء التجويف سفينة ليحل محل تصفية السوائل عبر جدار الوعاء الدموي. وبالتالي انسداد خلال الضغط الهيدروستاتيكي في لمعة الأوعية الدموية (P _ج) يساوي أن مجموعة من مقياس ضغط الدم. الضغط oncotic في الأنسجة المساريقي لا يكاد يذكر، وذلك مباشرة بعد انسداد، يتم قياس حركات السوائل transvascular من خلايا علامة حمراء حيث يتم الضغط الهيدروستاتيكي المعروفة والضغط oncotic في التجويف سفينة يساوي الوقت المعين في الإرواء. مع القياسات المتتالية L _ص، يتم فقدان طول السفينة في كل مرة يتم تقدمت الموقع الكتلة. بالإضافة إلى ذلك، recannulation المتعاقبة يقلل متاح طول السفينة.

ويقدر تدفق السوائل transvascular في وحدة المساحة من جدار الوعاء الدموي (J _{ت /} S) من المعدل الذي يبلغ طوله يقاس من عمود الماء في microvالتجويف ايسيل بين الخلايا الحمراء علامة وموقع الانسداد إما تقصير (صافي الترشيح) أو يطيل (صافي استيعاب). والافتراض هو أن خلايا الدم الحمراء ازدهار محايد تتحرك على طول محور من التجويف سفينة يمكن استخدامها لتتبع سرعة متوسط ​​عمود الماء في الخلايا المحيطة بها (نسبة سرعة الخلايا الحمراء على أنها تعني سرعة المياه بالقرب 1.8 ل6 ميكرون الخلايا الحمراء في وعاء 30 ميكرون قطر). ^8،14 وهكذا إذا كانت سرعة خلية علامة (في ميكرون / ثانية) نحو مانع هي V ميكرون / ثانية على أول ثانية 2-5 بعد انسداد، ونصف قطر السفينة هو ص، وحجم السوائل التي تمت تصفيتها عبر الجدار microvessel بين تلك الخلية الحمراء وموقع الانسداد (J _ت) هو πr ^{2 V} ميكرون ³ / ثانية على افتراض microvessel وأسطواني. وعلاوة على ذلك منطقة من microvessel أسطواني (S) بين تلك الخلية علامة وموقع الانسداد هو 2πrℓ، حيث ℓ هي المسافة الأولية بين الخلية علامةوموقع الانسداد. وبالتالي فإن متوسط ​​تدفق transvascular الأولي في وحدة المساحة (J _{ت /} S) في الضغط التي وضعتها مقياس المياه الواقع الافتراضي / (2ℓ).

يتم إجراء أبسط تقدير سفينة L _ص إذا كان قد تم تعيين ضغط oncotic من الإرواء منخفضة نسبة إلى الضغط microvessel (عادة 3،6 بيت إدارة المال _{2 O،} والضغط oncotic من ألبومين المصل البقري بتركيز 10 ملغ / مل والشعرية ضغط أكبر من 30 بيت إدارة المال ₂ O). يتم احتساب L _ص باسم (J _{ت /} S) / (P _ج -3) سم / ثانية / سم H _{2 O} لأن معامل الانعكاس الزلال _{(الألبومين} σ) في ولاية سيطرة على مقربة من 0.9. مع التغيرات السريعة هذا النهج في L _ص مع قرار الوقت من أجل من 1 دقيقة يمكن قياسها عن طريق إنشاء التدفق الحر بين التدابير المتعاقبة J _{ت /} S في الضغط المستمر كما هو مبين في نتائج ممثل في الشكل (4). إن النهج IG أعلاهnores التغييرات الطفيفة في ضغط oncotic من الألبومين التي تقع إلى أقل من 1 بيت إدارة المال _{2 O} عندما ينخفض ​​معامل انعكاس أقل من 0.5، ولكن الخطأ في تقدير L _ص لا يزال أقل من 5٪ عند P _ج أكبر من 30 بيت إدارة المال _{2 O} .

عندما يتطلب القياس الدقيق لكلا L _ص والتفكير معامل، J _{ت /} تقاس S في سلسلة من الضغوط microvessel تحت ضغط oncotic فعال المتوقعة للاختبار جزيء. المنحدر للعلاقة بين J _{ت /} S والتدابير ضغط L _ص والتقاطع على المحور الضغط عندما صافي التدفق التدابير الصفر σπ (الشكل 5). المظاهرة التي JV يرتبط خطيا للضغط هي أيضا التحقق من صحة المهم استخدام قياسات الضغط واحد باستخدام بروتوكول بساطة هو موضح أعلاه (الشكل 4) عندما يكون الفرق بين الضغط oncotic هو انخفاض نسبة إلى الصحافة الهيدروستاتيكيلدى عودتهم.

المصادر المحتملة للخطأ. هناك العديد من المشاكل التي تهدد القياس الدقيق. عدم انسداد صحيح السفينة أو الأضرار التي لحقت جدار الوعاء الدموي في نتائج موقع انسداد في تسرب السوائل الماضي موقع الانسداد، وحركة الخلايا علامة تجاه موقع الانسداد أسرع من ذلك بسبب تبادل transvascular. في حين أن الخلايا علامة تتحرك عادة ببطء تجاه موقع الانسداد، ولكن لا تصل إلى ذلك، يشار إلى تسرب إذا خلايا علامة تتبع كل وسيلة للمطبق. من ناحية أخرى، وعدم ختم ماصة في تجويف microvessel في موقع إقناء؛ إدخال القنية النتائج في التقليل من J _{ت /} S. تسرب السوائل من ماصة للsuperfusate أو إلى التجويف السفينة المنبع للموقع إقناء؛ إدخال القنية يسبب انخفاض ضغط كبير عبر طرف ماصة. تم الكشف عن هذا تسرب عندما الخلايا في تدفق طرف micropipette في سرعة أعلى من تلك الموجودة في لو السفينة المصبالرجال من السفينة المغطي. اعادة تموضع دقيق من micropipette عادة الأختام مثل هذا التسرب. وتنشأ مسألة مختلفة إذا كان L _{p من} جدار الوعاء الدموي ليست موحدة، وجود عادة مع واحد أو أكثر من مواقع الأضرار المحلية أو التهاب. خلايا علامة تتبع إلى الموقع إذا يتركز معظم تدفق transvascular هناك. حركة الخلايا الحمراء لا تزال يقيس تدفق transvascular، ولكن هذا الاجراء J _{ت /} S لا يمثل أكثر من منطقة الجدار داخل الجزء الاختبار.

أهمية الأسلوب فيما يتعلق بأساليب القائمة. طريقتين الأكثر استخداما للتحقيق في تنظيم البطانية نفاذية الجدار وتبادل transvascular هي (1) في المختبر قياس التبادل عبر مثقف الطبقات الوحيدة الخلية البطانية و(2) قياس تراكم التتبع في عينة الأنسجة بعد التتبع يتم حقن عن طريق الوريد في الحيوان كله. وو التجارب في تربيتها الطبقات الوحيدة الخلية البطانيةavored لأن الوظائف الخلوية يمكن تعديلها بشكل مباشر وهناك المواد الخلوية كافية لإجراء تقييم مفصل للأحداث الجزيئية في الخلايا البطانية. ولكن في معظم الظروف ثقافة الخلايا البطانية عادة لا تشكل ممثل حاجز نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي. وقد أثبتت هذه التقنية لانديس تعديل المذكورة أعلاه أن تكون تقنية قوية وموثوق بها للتحقيق في تنظيم وظيفة حاجز غشائي في microvessels venular سليمة. في يد محقق من ذوي الخبرة يقترن قياسات النفاذية في ظل ظروف مراقبة واختبار فيها بعض من الأساليب المستخدمة في زراعة الخلايا (على سبيل المثال، والتصوير من المكونات الخلوية، وتعديل مسارات الإشارات) يمكن تطبيقها. وقد أثبتت أهمية التجارب في microvessels سليمة من خلال إظهار فروق ذات دلالة إحصائية بين الآليات التي تنظم نفاذية حاجز في microve perfused بشكل فرديssels وهذه غالبا ما يوصف في الطبقات الوحيدة البطانية مثقف. ومن الأمثلة الردود على القص، والتعرض الثرومبين، ومساهمة آليات مقلص لتشكيل فجوة التهابات ^2-6،9،16. قياسات لتراكم التتبع في سرير الأوعية الدموية سليمة تحافظ على أكثر من وظيفة فسيولوجية طبيعية ولكن التحقيق المباشر للتغييرات حقيقية في نفاذية الأوعية الدموية للخطر بسبب تراكم التتبع قد يزيد نتيجة زيادة التروية (زيادة المساحة السطحية للتبادل) مع أو بدون زيادة في نفاذية جدار. وبالتالي مدى زيادة نفاذية قد بالغت عندما يزيد توسع الأوعية عدد السفن perfused وبالتالي تراكم مجموع المذاب أكبر من ذلك بسبب زيادة في نفوذية الأوعية الدموية وحدها ^34.

التطبيقات المستقبلية. إن مجموعة من الخيارات لتعديل الهيكل الخلوي وظيفة تحت نفس الشروط نفاذية إيندييتم قياس السفن المفردة مباشرة أثناء ومن المتوقع أن يزيد تروية دقيقة. وعلاوة على ذلك فإنه من المتوقع أن تطبيق الأساليب المعدلة وراثيا في مساريق الفئران قد يحل مشكلة طويلة الأجل التي وجدت للفئران معدلة وراثيا. على وجه التحديد، عندما أصبحت الفئران المعدلة وراثيا المتاحة وكان من المتوقع أن تروية دقيقة ويمكن أن يمتد إلى التحقيق microvessels في الأوعية المساريقي بهم. في حين تم الانتهاء من بعض التجارب تروية دقيقة في microvessels من الماوس مساريق ^35، الفئران عموما أقل microvessels في الأنسجة المساريقي بهم من الفئران، وهذه السفن غالبا ما تكون قصيرة وتشعبت للغاية، خلافا لأطول (> 500 ميكرون) سفن مستقيمة أكثر مناسبة أن يمكن العثور عليها في الفئران. وهكذا تجارب للتحقيق في التشكيل الصرف transvascular في راثيا اعتمدت الفئران على فحوصات مثل مايلز ³⁴ أو تطلبا من الناحية الفنية، ولكن أكثر موثوقية التجارب التتبع التي تقيستغييرات في كل من الأوعية الدموية وتراكم خارج الأوعية الفلورسنت تحقيقات اختبار radiolabelled ^36.

إدخال تعديلات على هذه الطريقة. وفي البروتوكولات المذكورة أعلاه، والتغيرات في تركيبة سائل الإرواء المطلوبة تغير بال micropipettes. نهج بديل هو إعادة ملء micropipette في الموقع باستخدام جهاز إعادة تعبئتها. وقد تم إنجاز هذا الإجراء كما هو موضح بالتفصيل ^37. الحد هو أن الوقت لتغيير تركيبة سائل الإرواء في ماصة ليس بالسرعة التي تحققت عن طريق استبدال ماصة، ولكن هذا الإجراء مفيد خاصة إذا كان ذلك ضروريا ليروي لmicrovessel لفترات طويلة من الزمن.

نفس تروية دقيقة اقترب يمكن تمديدها لقياس معامل نفاذية لfluorescently المسمى المذاب ^31،38-40. في هذه الحالة يتم استبدال micropipette واحد الماسورة التي كتبها مزدوجة الماسورة (ثيتا) ماصة ⁴¹ والسفينة هو perfusedبالتناوب مع المذاب اختبار الفلورسنت لقياس الأنسجة تراكم نسبة إلى التجويف المحتوى، ونفس الإرواء دون المذاب الفلورسنت لمسح الأنسجة ويسمح القياس المتكرر لتراكم الأملاح في التربة. عندما قياسات تدفق المياه transvascular هي لتكون جنبا إلى جنب مع قياسات معامل نفاذية المذاب باستخدام المواد المذابة اختبار fluorescently المسمى، مؤشرات الفلورسنت من تكوين الخلايا، أو التصوير متحد البؤر من المكونات الخلوية، لا بد من الكمبيوتر التي تسيطر عليها المجهر مضان أكثر تطورا. وبما أن هذه التحقيقات تتطلب عادة العدسات مع تضخم أعلى وأقصر من ذلك بكثير المسافة العمل، يتم استبدال عمود الكوارتز تستخدم لعقد مساريق قبل الانزلاق غطاء زجاجي لصقها على دعم زجاجي داخل الأنسجة بشكل جيد على علبة المجهر. زيادة توافر طابعات 3-D، سيسمح تصنيع عالية الدقة من الصواني المخصصة، والتي تلبي التسامح ضيق اللازمة لوضع diamete أكبرالعدسات ص أقصر مسافة العمل بالنسبة إلى microvessels المحدد.

توافر microvessels قابلة للاستخدام في مساريق يختلف مع تقدم العمر والجنس والسلالة. ولذلك، فإن الخيارات من سلالة من الفئران واستخدام ذكرا أو أنثى سيعتمد على الأسئلة المحددة التي تجري معالجتها. بالنسبة للعديد من الدراسات التي أجريناها مؤخرا استخدمنا ذكور فئران سبراج داولي التي تأقلم في منشأة الحيوانية لدينا أسبوع واحد على الأقل قبل الاستخدام في حوالي سن 3-4 أشهر في الوقت الذي نجد لديهم عموما المتاحة طويلة، microvessels المساريقي على التوالي. على النقيض من ذلك، استخدمت زملائنا بنجاح إناث فئران سبراج داولي من 2-3 أشهر ^من العمر 13 عاما.

كان دور خلايا الدم الحمراء. ويتمثل الدور الرئيسي لخلايا الدم الحمراء كما هو موضح أعلاه لتعقب transvascular حركة المياه على افتراض الخلية تصرفت الخاملة ومحايد المؤشرات الواعدة من تدفق المياه بعد المغطي للmicrovessels. بالإضافة إلى هذا الدور الأساسي، فإنهومن المسلم به الآن أن الخلايا الحمراء تساهم في استقرار الحاجز من خلال تزويد S1P إلى الإرواء عندما الألبومين في ^31،42،43 الحاضر. هناك عدة آثار هامة من هذه الملاحظات. في حالة عدم وجود خلايا الدم الحمراء أو مع استخدام علامات تدفق خامل بديلة من المرجح أن تكون أقل استقرارا نفاذية خط الأساس. فمن المستحسن أن قياسات S1P ينبغي بذل في جميع perfusates المستخدمة في التجارب تروية دقيقة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL44485 وHL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 103، تروية دقيقة، الفئران، مساريق، التوصيل الهيدروليكي، النفاذية، تقنية لانديس