Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Abstract

Versuche, um die Durchlässigkeitseigenschaften individuell perfundiert microvessels messen eine Brücke zwischen Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die die vaskuläre Permeabilität in kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und den Funktionsaustauscheigenschaften von Voll mikrovaskulärer Betten. Ein Verfahren, um kanülieren und perfundieren venulären Mikrogefäßen des Rattengekröse und messen die hydraulische Leitfähigkeit des Mikrogefäßwand beschrieben. Die wichtigsten Geräte benötigt umfasst eine Intravitalmikroskop mit einer großen Bühne, die modifizierten Mikromanipulatoren unterstützt zu drei verschiedene Mikrowerk positionieren: (1) eine abgeschrägte Glas-Mikropipette zu kanülieren und Perfusion der Mikrogefäß; (2) eine Glasmikro Okkluder transient zu blockieren Perfusion und ermöglichen die Messung der transvaskulären Wasserströmungsbewegung mit einer gemessenen hydrostatischen Druck, und (3) ein stumpfer Glasstab um den mesenterialen Gewebe an der Stelle der Kanülierung stabilisieren. Die modifizierte Landis Mikro Okklusion technique verwendet Erythrozyten im künstlichen Perfusat als Marker für transvaskuläre Flüssigkeitsbewegung ausgesetzt ist, und ermöglicht auch wiederholte Messungen dieser Ströme als Versuchsbedingungen geändert werden, und hydrostatischen und kolloidosmotischen Druckdifferenz über den Mikrogefäßen werden sorgfältig gesteuert. Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit zunächst unter Verwendung eines Steuer Perfusat, dann nach erneuter Kanülierung der gleichen Mikrogefäß mit den Test Perfusaten ermöglichen Paarvergleiche der Mikrogefäßreaktion unter diesen gut kontrollierten Bedingungen. Versuche, das Verfahren auf Mikrogefäße im Mesenterium von Mäusen mit genetischen Veränderungen erwartet, Gefäßdurchlässigkeit ändern erstrecken waren stark eingeschränkt wegen der Abwesenheit von langen Geraden und unverzweigten Mikrogefäße in der Maus Mesenterium, aber die jüngsten Verfügbarkeit der Ratten, die mit ähnlichen genetischen Veränderungen mit die CRISPR / Cas9 Technologie wird erwartet, dass neue Bereiche der Untersuchung, wo die hier beschriebenen Verfahren angewendet werden kann, zu öffnen.

Introduction

Mikroperfusionskammer im Gefäß gehört der Aufbau gesteuerte Strömung eines künstlichen Perfusat bekannter Zusammensetzung über eine Mikropipette in einem Blutgefäß in der Regel weniger als 40 um im Durchmesser. Die durchströmten Gefäß bleibt innerhalb seiner normalen Gewebeumgebung und ist mit Blut bis das Tier zum Zeitpunkt der Kanülierung perfundiert. Wenn sie in Verbindung mit einer Reihe von Video-Imaging oder fluorometrische Techniken in situ Mikroperfusionskammer verwendet ermöglicht die Messung von Wasser und Stoffströme in den Wänden von Mikrogefäßen unter Bedingungen, wo die treibende Kraft für diese Ströme bekannt sind, und die Durchlässigkeitseigenschaften der Gefäßwand kann direkt ausgewertet. Ferner kann durch Steuern der Zusammensetzung der Flüssigkeit um das Mikrogefäß in dem Gewebe (Perfusat und Superfusat), Regelung der Mikrogefäßdurchlässigkeit und den Austausch kann durch Aktivierung der Endothelzellen Bildung der Mikrogefäßwand, um eine Vielzahl von E ausgesetzt werden untersucht werdenxperimental Bedingungen für präzise gemessen Zeit (Sek hr) (Agonisten, modifizierte Perfusionsbedingungen, Fluoreszenzindikatoren an intrazelluläre Zusammensetzung und Signalisierung zu messen). Zusätzlich können ultra oder cytochemischen Evaluierungen zelluläre Schlüsselmolekülstrukturen Regulieren der Barriere in den gleichen Mikrogefäßen in denen Durchlässigkeit direkt gemessen wird untersucht werden. Der Ansatz bildet dabei eine Brücke zwischen Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen zu Endothelbarriere Funktion in kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und die Untersuchung in intakten Mikrogefäßen zu modifizieren. Auch die folgenden Beiträge zu weiteren Auswertung ^1-6.

Eine Begrenzung der Mikroperfusionskammer ist, dass sie nur in mikrovaskulären Betten, die dünn, transparent sind und eine ausreichende strukturelle Integrität Kanülierung mit einer Glasmikropipette verwendet werden, ermöglichen. Während frühe Untersuchungen verwendet Frosch Mikrogefäße im Mesenterium und dünne Haut pectoris muscle ^7,8, die bei weitem am häufigsten verwendete Zubereitung in Säugermodellen ist die Rattengekröse ^9-15. Die meisten Untersuchungen auf akute Veränderungen der Gefäßdurchlässigkeit untersucht über einen Zeitraum von 1-4 Stunden konzentriert, aber neuere Untersuchungen haben Messungen an einzelnen Schiffen nach einer anfänglichen Perfusion ^12,16 erweitert 24-72 h. Die neu entwickelte CRISPR-Technologie, die zur Untersuchung der vaskulären Permeabilität Regulierung ¹⁷ sollten die in dieser Mitteilung beschriebenen Methoden ermöglichen mehr gentechnisch veränderte Rattenmodellen verfügbar zu machen verspricht, in venulären Mikrogefäßen des Mesenteriums in dieser wichtigen neuen Rattenmodellen angewendet werden.

Das Verfahren erfordert eine inverse Mikroskop mit einem speziell angefertigten Mikroskoptisch groß genug ausgestattet, um sowohl den Tier Vorbereitung und mindestens drei Mikromanipulatoren zur Position in der Nähe des Mikrowerk perfundierten Gefäß und einen Perfusion Mikropipette mit dem Behälter auszurichten verwendet haltenLumen. Zum Beispiel eine individuelle Plattform für einen xy Mikroskoptisch (ca. 90 × 60 cm) aus einer 1 cm dicken Stahlplatte mit einem Rostschutzbeschichtung hergestellt werden. Die Phase auf eine Engineering-Indextabelle oder zwei Schwalbenschwanzschlitten rechtwinklig zur Bewegung in der horizontalen Ebene montiert ist und auf Teflonsäulen oder Kugelrollen abgestützt angebracht ist. Eine typische rig (siehe Abbildung 2) hat viel gemeinsam mit dem Mikroskop und Mikropositionierung Ausrüstung für eine Vielzahl von Intravitalmikrozirkulation Experimente, wie sie verwendet werden, um Einzelgefäß Blutfluss und Hämatokrit, lokalen Sauerstoffversorgung von durchbluteten Mikrogefäße, die Regulierung der vaskulären glatten messen Muskeltonus und der örtliche mikrovaskuläre Akkumulation von fluoreszierenden Indikatoren in den gesamten Kreislauf injiziert. ^18-26

Die grundlegenden Aspekt der Technik ist die Messung der Volumenstrom (J _v) in einer definierten Oberfläche (S) der Mikrogefäßwand. ErreichenDieses über das modifizierte Landis Technik beschrieben eine einfache invertierte Mikroskop ist ausreichend. Eine kleine Videokamera wird auf dem Bild-Port und dem Videosignal angebracht ist, mit einem zusätzlichen Zeitbasis wird auf einem Videomonitor angezeigt und entweder in digitaler Form in einem Computer oder als digitales oder analoges Signal auf einem Videorekorder aufgezeichnet. Sobald die Mikrogefäß kanüliert ist der Teil des Mikrogefäß für die Kamera sichtbar ist, indem die Phase und Manipulatoren als Einheit ohne Unterbrechung der Kanülierung geändert werden.

Die Messung der transvaskulären Ströme kann auch mit mehr detaillierte Untersuchungen mit Hilfe eines hoch entwickelten Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern, wie Bohrinseln für die Messung des gelösten Stoffes Durchlässigkeit, Fluoreszenz-Verhältnis Überwachung der zytoplasmatischen Calcium oder anderen zellulären Mechanismen und konfokale Bildgebung ^6,12,13 verwendet kombiniert ^{werden, 27.} Ein wesentlicher Vorteil aller Mikroperfusionskammer Ansätze ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen zu machen, auf dem gleichen Gefäß, Unter kontrollierten Veränderung der Antriebskraft, wie beispielsweise hydrostatischen und onkotischen Drücke oder induzierte Veränderung der Gefäßreaktionen auf Entzündungszuständen. Die häufigste Design ist eine paarweise Vergleich der gemessenen hydraulischen Leitfähigkeit (L _p) auf dem gleichen Schiff mit dem Gefäß zunächst über eine Mikropipette mit einer Steuer Perfusat und der Erythrozytensuspension gefüllt perfundiert, um eine Grundlinie Lässigkeit Zustand mit einem zweiten Pipette zu etablieren, dann mit dem Testmittel zugesetzt, um dem Perfusat. Mehrere Kanülierungen sind mit dem Zyklus nach der Reperfusion mit dem Steuerpipetten wiederholt möglich.

Dieses Protokoll zeigt die Kanülen sowie Mikroperfusionskammer eines venulären Gefäß Rattengekröse Wasserflüsse über die Mikrogefäßwand erfassen und messen die L _p der Gefäßwand, ein nützlicher Index der Permeabilität des gemeinsamen Syntheseweges für Wasser und gelösten Stoffen durch die intakte endothelialen Barriere. Das Verfahren wird als modifiziert Landis technique, weil die ursprüngliche Landis Prinzip der Verwendung die Relativbewegung der roten Zellen als Maß für die transvaskuläre Flüssigkeitsaustausch nach Perfusion blockiert wird beibehalten ^28, aber die Auswahl der Versuchsbedingungen (beispielsweise die hydrostatische und Albumin onkotischen Druckdifferenzen über die Mikrogefäßwand) nach Mikroperfusion verfügbar ist weit größer als in uncannulated blutet Mikrogefäßen ^8,29.

Protocol

Ethics Statement: Alle Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Vorab Herstellung von Mikropipetten, Einschränkung der Bewegungsfreiheit, und Blockers

1. Ziehen mehreren sauberen Borosilikatglas Kapillarröhrchen Hälfte mit Hilfe eines elektronischen Abzieher so eingestellt, daß, wenn er gezogen wird, ist der gestreckte Abschnitt des Rohrs etwa 1 cm in der Länge und die beiden Hälften sind etwas symmetrisch. Stellen Sie sicher, dass die Verjüngung steht im Einklang mit den Abmessungen in Abbildung 1. Verwenden Sie beide Hälften für Mikropipetten, Verzögerer und Blocker.
   1. Bevel die Mikropipetten mit einem luftbetriebenen Schleifscheibe ³⁰ mit 0,5 & mgr; m-Schleifpapier mit Wasser gebadet. Den Winkel der Mikropipette Halter, so daß es etwa 30 Grad von der Horizontalen.
   2. Gründlich reinigen und abtrocknen die Mikropipetten mit Hilfe Absaugen, um saubere Aceton durch die Spitze und bis der Welle ziehen. Überprüfen Sie die Mikropipetten (1A) mit einem kleinen aufrechten Mikroskop mit 4 × und 40 × Ziele mit einer Krokodilklemme Mikropipette Halter und einem Okular-Strich ausgestattet.
   3. Wählen Mikropipetten mit Spitzenöffnung etwa 50 & mgr; m lang mit einer Fase, deren Länge / Breite-Verhältnis zwischen 3,1 und 3,5 und mit einem stark verjüngenden Punkt, dringen in die harte Kollagenfasern im Mesenterium hilft.
   4. Speichern 15-20 Mikropipetten aus leicht unterschiedlicher Größe in einer staubfreien Feld.
2. Machen Verzögerer mit gezogen Kapillaren in Schritt 1.1) hergestellt. Halten Sie eine gezogen Glaskapillarrohr kurz in der Nähe einer Mikroflamme, um ein stumpfes Ende (1B) zu bilden. Bewahren Sie mehrere in einer staubfreien Feld.
3. Machen microoccluders Verwendung gezogen Kapillaren in Schritt 1.1) hergestellt. Halten Sie eine gezogen Kapillare unter einem Mikroflamme und vorsichtig biegen (unter Verwendung eines Schlauchadapter, z. B. 23G) die feine Spitze (ca. 4 mm von der Spitze), um einen Winkel von fast 120 Grad, um die Welle zu machen (

2. Vorbereitung der Tiere und Chirurgie

1. Anästhesiert männliche (350-450 g) oder weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (200-300 g) mit Natriumpentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) subkutan injiziert; Schutz des Mesenteriums indem keine intraperitoneale Injektion.
2. Gesamten chirurgischen Verfahren und experimentelle Protokolle, Aufrechterhaltung einer Narkose durch zusätzliche Injektionen (30 mg / kg) nach Bedarf. Bestimmen Sie Narkosetiefe durch toe Prise oder Hornhautreflex. Nach Beendigung des experimentellen Verfahrens, euthanize die Ratte über Pentobarbitalüberdosis oder intrakardiale Injektion von gesättigtem Kaliumchlorid unter Anästhesie.

3. Bereiten Solutions und Erythrozyten zur Verwendung als Durchfluss Markers

1. Vorbereitung Säugerringerlösung für Superfusat und Steuerungs Perfusatlösung (typischerweise Säuger Ringerlösung, die 10 mg / ml Fettsäurekostenlos Rinderserumalbumin, BSA).
   1. Filter Perfusat durch 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter, um winzige Partikel, die die Mikropipettenspitze blockieren könnten, zu entfernen; Filter in kleine sauberen Behälter.
2. Vorbereitung Erythrozyten, indem etwa 0,2 ml Blut aus der Schwanzvene der narkotisierten Ratte in einer 20G-Nadel auf einer kleinen Spritze mit 0,05 ml Heparin (1000 U / ml) und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit etwa 14 ml Säugerringerlösung Lösung .
   1. Zentrifuge vorsichtig packen roten Zellen (ca. max 200 g für 7 min). Beziehen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die roten Zellen in Ringer-Lösung.
   2. Nach Zentrifugieren und Entfernen verlassen Stand dreimal die gepackten roten Zellen, die in der Unterseite des Rohres für eine spätere Verwendung. Man beachte, dass diese Vorgehensweise reduziert Blutplättchen in der endgültigen perfusates auf weniger als 0,1% des normalen Niveaus ^31.

4. Ordnen Sie die Tissue auf dem TierTray

1. Rasieren Sie den Bauch des narkotisierten Ratten von unten Nabel bis Schwertfortsatz. Sicherzustellen, daß die rasierten Bereich erstreckt sich um die rechte Seite (für Ratten auf der rechten Seite angeordnet), so daß das Haar nicht einen Docht zu bilden, um das Superfusat aus dem Gewebe heraus und ziehen. Entfernen Cut Haare mit einem befeuchteten Gaze oder Gewebe.
   1. Halten Sie die Haut mit einem stumpfen gezahnten Pinzette und eine Mittellinie Schnitt (2-3 cm lang) durch die Haut mit ein robustes Schere. Mit einem feinen (Iris) Schere machen einen ähnlichen Schnitt durch die Linea alba, die Aufhebung der Bauchwand mit Wellenzange um eine Beschädigung der Darm.
   2. Mit dem Tier auf seiner Seite auf dem Tier Fach, ziehen Sie vorsichtig den Darm aus der Bauchhöhle mit Wattestäbchen (Holzstab) in Ringer-Lösung und stumpf gezähnten Zange eingeweicht. Ordnen Sie die gut in das Gewebe gut, so dass das Mesenterium wird über die Säule für die Betrachtung durch das Mikroskop die Pflege zu vermeiden, berühren Sie die Gekröse (pote drapiertntially beschädigen Mikrogefäßen) entweder mit einer Pinzette oder Baumwolle.
      Hinweis: Das Tier Fach (2A) aus Plexiglas gebaut werden und erfordert eine Gewebe gut (ca. 3 mm tief), ein optisch klares Säule (zB poliert Quarz ca. 2 cm Durchmesser und 5 mm hoch.) Und eine wärmende Unterlage so eingestellt, daß das Tier Temperatur aufrechtzuerhalten. Die Dicke der Säule muß der Arbeitsabstand der Objektiv nicht überschreiten.
2. Die Position des Tieres Tablett auf dem Mikroskoptisch, so dass das Mesenterium durch die Okulare sichtbar ist.
3. Positionieren Sie einen der Schwerkraft gespeiste Tropflinie kontinuierlich superfuse das Mesenterium mit Säugetier-Ringer-Lösung bei 35-37 ° C gehalten. Verwenden Gaze-Pads, die gut in Position zu halten, zu helfen, Feuchtigkeit zu speichern und zu saugen überschüssige Ringer-Lösung von der Oberfläche. Stellen Sie die Strömung und saugen Sie den Abfluß, um eine konsistente Superfusat Dicke zu erhalten.
4. Identifizieren Sie Ziel venulären Mikrogefäße, die sindunverzweigte Segmenten nachgeschaltet konvergenten Strömungs eine oder zwei Verzweigungen distal wahre Kapillaren. Finden Sie einen unverzweigten Gefäß (idealerweise 600 bis 1000 & mgr; m in der Länge) mit flotten Durchblutung und frei von weißen Blutkörperchen kleben an der Gefäßwand.
5. Positionieren Sie den Testmikrogefäß in der Mitte des Mikroskopfeld und bewegen Sie den Verzögerer in die richtige Position in der Nähe der gewählten Kanülierungsstelle.

5. Füllen Mikropipette und Mount in Halter

1. Kurz vor Kanülierung, auszusetzen: die Erythrozyten im Perfusat. Hinzufügen 7 ul gepackter roter Zellen auf 0,5 ml Perfusat in einem sauberen Borosilikat Reagenzglas. Hinweis: Hämatokritwerte von 1-3% können verwendet werden, aber im Einklang Hämatokrit wird, um konsistente Perfusat Konzentrationen von Stoffen aus den roten Blutkörperchen freigesetzt führen.
2. Eine 1-ml-Spritze mit einer 23G-Schlauchadapter und PE 50 Schläuchen (5-15 cm Länge). Zeichnen Sie das Perfusat / rot Zellgemisch in die Spritze. Kehren Spritze zu mischen und zu vertreiben alle Luftblasen aus Schlauch undAdapter. Für mehr Effizienz, fit Schlauch an mehreren Spritzen vor dem Beginn des Experiments und halten sie in einer staubfreien Karton oder Plastikbeutel.
3. Füllen der Mikropipette durch Vorschieben der Rohrleitung in das große Ende der Mikropipette bis es den sich verjüngenden Bereich anliegt. Tragen Sie eine sanfte kurzer Druck auf den Spritzenkolben, um die Mikropipettenspitze zu füllen. Hinweis: Eine kleine Stream oder Tropfen sollte an der Spitze sichtbar sein, um eine vollständige Füllung nachzuweisen.
4. Ziehen Sie den Schlauch unter leichtem Druck auf den Kolben, um den breiteren Teil des Mikropipette Welle zu füllen. Entfernen Sie kleine Blasen in der breiten Welle durch vorsichtiges Schwenken der Mikropipette Welle. Hinweis: Ein ähnliches Verfahren wurde ³² dargestellt.
5. Platzieren der Mikropipette in eine Pipettenhalter mit einer Seitenöffnung, die eine kontinuierliche Fluidverbindung mit einem Wassermanometer ermöglicht. Sicherzustellen, dass der Halter, der mit einem hydraulischen Antrieb verwendet werden, um sehr feine Weiterentwicklung der Mikropipette unter Kontrolle gebunden ist, in einem kleinen Winkel (15-25 °)zur Horizontalen, so dass der Rand der Mikropipette Verjüngung nicht traf den Darm oder Fach.
6. Montieren Sie den hydraulischen Antrieb auf einer beweglichen Mikromanipulator, der x, y und z-Antrieben muss eine enge Abstimmung mit dem Testgefäß (Abbildung 2) zu ermöglichen.
7. Einstellen des hydrostatischen Drucks auf das Fluid in der Mikropipette unter Verwendung einer Spritze oder wassergefüllte Gummiblase, die Höhe der Flüssigkeit in der Wassersäule des Manometers bis ungefähr 40 cmH _{2 O} oberhalb des Mesenteriums ändern.
8. Kanülieren die Mikrogefäß so bald wie möglich nach dem Füllen der Pipette; Erythrozyten setzen sich am Boden der Pipette, so dass nach etwa 40 Minuten sehr wenige Erythrozyten in den Behälter fließen.

6. Microcannulation und mikrovaskuläre Druckmessung

1. Vor der Positionierung des gefüllte Mikropipette unter dem Mikroskop, vorsichtig auf die Rückhalteeinrichtung auf das Gewebe in der Nähe des Mikrogefäß eine ausreichende Kraft zum Greifen des Gewebes. Zeichnen Sie dieRestrainer zurück, das Gewebe in Übereinstimmung mit der Mikrogefäß leicht ausdehnt, so daß die Spannungen in den mesenterialen Kollagenfasern werden mit dem Behälter ausgerichtet ist.
   1. Richten Sie die Mikropipette mit dem Behälter und setzen Sie sie in den Blick durch die Okulare. Setzen Sie die Spitze kurz vor dem gewählten Kanülierungsstelle und senken Sie es auf das Gewebe, so dass es teilweise behindert Fluss innerhalb des Gefäßes, aber nicht zu verschließen ist.
2. Kanülieren das Gefäß durch Antreiben der Pipettenspitze langsam in das Gefäßlumen mit dem hydraulischen Antrieb. Achten Sie darauf, durch die untere Seite des Behälters zu drücken.
   Hinweis: Da die Mikropipette in die Lumen, das Perfusat schnell wäscht das Blut in den Behälter aus dem Lumen und Perfusat frei fließt in Umlauf distal des Tieres auf die Probe microvessel verdrängen einige der normalen Durchblutung in den nachgeschalteten Behälter.
3. Senken Sie den Perfusionsdruck durch Einstellen der Manometer, bis das Blut (wie angegebenvon roten Zellen des Tieres) zurück in den perfundierten Segment gezogen wird; dies bestimmt die ausgeglichene Druck, wo die roten Zellen vorsichtig oszillieren im Gefäßlumen und misst den hydrostatischen Mikrogefäßdruck (P _c) an dem distalen Ende des Mikrogefäßsegment. Pflegen Gefäßdurchblutung bei allen Drücken oberhalb dieses Gleichgewicht Druck.

7. Microocclusion und Erhebung von Daten

1. Optionaler Schritt: Vor der Verwendung der Mikro-Okkluder, um den Behälter zu sperren, drücken Sie sie in das Gewebe in einem nicht verwendeten Bereich des Mesenterium weit von jedem Schiff, so dass die Spitze sammelt sich eine feine Polster aus Gewebe, das die Versuchsgefäß während wiederholter Mikro schützt Verschlüsse.
2. Setzen Sie den Blocker oberhalb des durchströmten Behälter in der Nähe des unteren Randes des Mikroskops ein.
3. Nehmen Sie die folgende mit Video und Audio.
   1. Mündlich erfassen die Position des Blocks Website und unteren Bildschirmrand auf der Okular-Strich gesehen.
   2. Mit der Spitzedes Blockers gerade oberhalb des Mikrogefäß platziert Mit dem Fein z Steuerung des Mikromanipulators sanft absenken Blocker, bis die Strömung im Behälter verschlossen wird. Beachten Sie das Manometer Druck (P _c) auf Audio. Bewerben Okklusion in der Regel für 3-10 sec und dann freigeben, die Wiederherstellung frei Perfusion. Bewegen Sie den Block Website bis das Schiff in Richtung auf die Pipettenspitze in 5-10 um Schritte basierend auf Zeit (> 5 min nach dem ersten Block an einem Standort), die Anzahl der Verschlüsse (3-5), um Gefäßwandschäden am Block Website zu verhindern .

8. Analyse von Daten und Messung der L _{p (Wasserdurchlässigkeit)}

1. Während der Wiedergabe, bestimmen die Anfangsabstand (ℓ _{0) von} einer Markierung von roten Blutkörperchen an die Okklusions-Stelle unter Verwendung eines Bildes einer Objektmikrometer und die bekannten Positionen in den Bildern. Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit (dl / dt) des Markers Zelle von ihrer Position in mehreren Rahmen während des 3-10 sec von aufgezeichneten Bildern. AbschreckenMinen das Schiff Radius (r) aus den Bildern während der Okklusion (Abbildung 3) übernommen.
2. Berechnen J _v / S für jede Okklusion (dl / dt) x (1 / ℓ _0), x (r / 2). Berechnen L _p auf einem konstanten Druck (J _{v /} S) dividiert durch den Antriebsdruck (Mikrogefäßdruck - effektive kolloidosmotischen Druck, siehe Diskussion).

Representative Results

Figur 4 zeigt die Ergebnisse aus der Messung der Zeitverlauf von Änderungen des L _p in einem Ratten venulären microvessel nacheinander mit vier perfusates kanüliert. ³³ Die Grße L _p auf einem konstanten Druck wurde berechnet als Maß für die Änderungen in der Mikrogefäßwanddurchlässigkeit verwendet wird, zunächst im Steuerzustand mit einem Perfusat, das 1% Rinderserumalbumin, dann, wenn der Behälter auf dem Entzündungsmittel Bradykinin (Bk) unter Verwendung eines zweiten Mikropipette, enthaltend 10 nM Bk belichtet. Bradykinin verursacht eine vorübergehende Steigerung der L _p, der über den nachfolgenden 10-15 min in Richtung Steuerwert zurückgeführt. Das Gefäß wurde dann mit Steuerung Perfusat wieder perfundiert 30 Minuten die Wiederherstellung einer stabilen Basislinie. Wenn der Mikrogefäß wurde mit einem vierten Mikropipette mit der gleichen Konzentration von Bk sowie 1 uM Sphingosin-1-Phosphat (S1P) im Perfusat perfundiert wurde die Reaktion auf Bk deutlich abgeschwächt. Der Grad derDämpfung, wenn Bk und S1P wurden gleichzeitig perfundiert wurde gefunden, ähnlich der in anderen Experimenten, bei denen S1P zum Perfusat bis 20 min vor dem Aussetzen gegen Bk hinzugefügt gemessen wird. Diese Ergebnisse zeigen die Leistung in der Lage, mehrere Messungen der L _p auf einem einzigen Behälter zu machen und zu zeigen, dass die Behandlung mit einem Mittel wie S1P an der Gefäßwand in Gegenwart eines Entzündungsmittel stabilisieren können, um Zeitperioden zu lösen der Größenordnung von wenigen Sekunden. In getrennten Gefäßen wurden Kontrollstudien mit einem ähnlichen Protokoll in Abwesenheit S1P geführt, um zu zeigen, daß die Dämpfung des Bk Antwort war nicht auf Anaphylaxie.

Bei einigen Versuchsanordnungen ist es wichtig, sowohl den gelösten Stoff Reflexionskoeffizienten für ein Makromolekül (σ) und der L _p abzuschätzen. Dies wird am besten durch Messung J _v bei mehreren Drücken auf den einzelnen Mikrogefäß durchgeführt. 5 zeigt ein Experiment In die sowohl L _p und die effektive onkotischen Druck von 5% Albumin im Perfusat (π _Albumin = 27 cmH _{2 O} bei 37 ° C) wurden unter Bedingungen bestimmt werden, wenn es kein Albumin in der Umgebung des Rattenmikrogefäßgewebe. In diesen Experimenten J _v / S wurde bei drei verschiedenen Drücken gemessen. Das L _{p die} Steigung der Beziehung zwischen J _v / S und Druck und der Schnittpunkt auf der Druckachse ist die effektive onkotischen Druckdifferenz an der Gefäßwand (σΔπ).

Abbildung 1. Mikrowerkzeuge für die Perfusion einzelner Mikrogefäßen. (A) einer Mikropipette zur Kanülierung Rattenmikrogefäße mit einer abgeschrägten Spitze. (B) eine Rückhalte zum Halten Mesenterium Gewebe stabil in der Nähe der Stelle der Kanülierung. (C) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Intravital-Rig für Mikroperfusion. (A) Übersicht der Tierschale mit Mikromanipulatoren und Mikrowerk über Glassäule ausgerichtet. (B) Große Metall-Bühne, auf Engineering-Tisch und Stützlager montiert. (C) narkotisierten Ratten mit Mikrowerkzeuge in der Position für Mikroperfusion eines Mikrogefäß. (D) Schließen Sie die Ansicht von Mesenterium während eines Experiments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figu ansehen re.

Abbildung 3. Messung der Filtrationsrate pro Flächeneinheit mit modifizierten Landis-Technik. Dieses Bild zeigt einen einzelnen Mikrogefäß mit einer Mikropipette und einer verschließenden Stab über dem Behälter positioniert kanüliert. Unmittelbar nach dem Verschließen der Mikrogefäß, wobei der Abstand (ℓ ₀₎ zwischen dem Marker RBC unterwegs auf der Mittellinie des eingeschlossenen Mikrogefäß und der Verschlussstelle so aufgezeichnet ist, dass die Zelle Trajektorie für 5-10 sec nach Okklusion folgen. Die Ausgangsposition (ℓ _0), und die Anfangsgeschwindigkeit (dl / dt) der Zelle verwendet werden, um die durchschnittliche Filtrationsrate pro Flächeneinheit der Mikrogefäßwand zwischen dem Marker-Zelle und der Stelle des Verschlusses zu berechnen. Die microoccluder wird dann angehoben, und freie Durchblutung festgestellt, bevor weitere Messungen durchgeführt werden.com / files / ftp_upload / 53.210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Repräsentative Daten zeigen, dass Sphingosin-1-Phosphat (S1P) Hemmung sehr schnell wirkt Bradykinin (Bk; 10 nM). Zu einer vorübergehenden Erhöhung der Mikrogefäß L _p. S1P aufgebracht, wie gleichzeitig mit zweiten Bradykinin (Bk) Test der akuten Bk Reaktion relativ zur ersten Bk gehemmt. Diese Daten zeigen, dass die Zeit der Exposition gegenüber einem Testmittel modifiziert werden, um die Kinetik der Aktivierung eines inhibitorischen Reaktion zu bewerten. Speziell angewendet S1P gleichzeitige nur Bk stark hemmte die Bk Antwort. S1P wurde 1 & mgr; M und Bk betrug 10 nM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5. Messung der J _v / S an mehreren Drücke ermöglicht sowohl L _p und die wirksame onkotischen Druck gemessen werden soll. Der Filtrationsfluß, J _v / S wurde in diesem Behälter bei verschiedenen hydrostatischen Drücken microvessel während der Perfusion mit BSA (50 gemessenen mg ml ^{- 1;} π = 27 cmH _{2 O),} während das Mesenterium wurde mit proteinfreien Ringer-Lösung gebadet. Die Steigung der Beziehung zwischen J _v / S und der Druck ist der L _{p und} dem Schnittpunkt auf der Druckachse zeigt die effektive onkotischen Druckdifferenz an der Gefäßwand. In diesem Experiment war der Lp 1,2 ^× 10 -7 (cm ^s -1 cm H _{2 O} ^-1) und die σΔπ war 24 cm H ₂ O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Details von L _p Berechnungen. Obwohl transvaskulären Flüssigkeitsbewegung auftritt, während das Schiff frei durchströmt, ist ein solcher Austausch viel zu klein, um im freien Durchblutung gemessen, weil es in der Regel weniger als 0,01% des Schiffes Perfusionsrate werden. Jedoch, wenn die Perfusion transient durch Verschließen der Mikrogefäß, transvaskulär Strom gestoppt (dh Filtration) von der Bewegung des Markers roten Zellen in das Lumen als die Fluidsäule zwischen einem Marker roten Zelle und der Stelle des Verschlusses gemessen wird, verkürzt, wie in Figur 3. In Abhängigkeit von der Komplexität und Länge des experimentellen Protokolls für eine unverzweigte Gefäß 600 bis 1000 um in der Länge erforderlich ist.

Wenn der Behälter nicht verschlossen und der Manometerdruck treibt Fluss durch die Mikrogefäß ist der Druckabfall an der Pipettenspitze groß, so daß Mikrogefäßdruckes während freie Perfusion typischerweise nur einenwenige cm H _{2 0} über dem Ausgangsdruck. Dagegen während einer Okklusion der Druckabfall an der Pipette sehr klein ist aufgrund des Fluid langsam in das Gefäßlumen auf Fluidfilter über die Gefäßwand zu ersetzen. Wodurch während des Verschlusses der hydrostatische Druck im Gefäßlumen (P _c) entspricht diese Menge vom Manometer. Die onkotischen Druck in der mesenterialen Gewebe vernachlässigbar, so dass unmittelbar nach der Okklusion, sind transvaskulären Flüssigkeitsbewegungen von Marker roten Zellen gemessen, wo der hydrostatische Druck ist bekannt, und die onkotischen Druck im Gefäßlumen gleich diesem Satz im Perfusat ist. Mit aufeinanderfolgenden Messungen von L _p ist Gefäßlänge bei jedem Drücken der Blockstelle vorgeschoben hat. Darüber hinaus aufeinander recannulation reduziert Verfügung Schiffslänge.

Die transvaskulären Flüssigkeitsströmung pro Flächeneinheit der Behälterwand (J _{v /} S) wird aus der Rate geschätzt, dass eine gemessene Länge der Wassersäule in der MicroVEssel Lumen zwischen einem Marker roten Zelle und der Verschlussstelle entweder verkürzt (netto Filtration) oder verlängert (Netto-Reabsorption). Die Annahme ist, dass neutral schwimmend roten Zellen, die sich entlang der Mittellinie der Gefäßlumen kann verwendet werden, um die mittlere Geschwindigkeit der Wassersäule die Zelle umgibt (das Verhältnis der Erythrozytengeschwindigkeit auf Wassergeschwindigkeit bedeuten verfolgen ist nahe 1,8 für einen 6 um Erythrozyten in einem 30 & mgr; m Durchmesser Gefäß). ^8,14 Daher, wenn die Geschwindigkeit eines Markierungszelle (in um / s) in Richtung der Blocker V & mgr; m / sec über der ersten 2-5 sec nach dem Verschluß und der Behälter Radius r, ist das Volumen des Fluids über die Mikrogefäßwand zwischen dem roten Zelle und der Stelle des Verschlusses (J _v) filtriert & pgr; r ^{2 V} & mgr; m ³ / s unter der Annahme der Mikrogefäß zylindrisch ist. Weiter wurde die Fläche einer zylindrischen Mikrogefäß (S) zwischen dieser Marker-Zelle und der Verschlussstelle ist 2πrℓ, wobei ℓ der anfängliche Abstand zwischen der Markierungszelleund der Verschlussstelle. So ist die durchschnittliche anfängliche transvaskulären Strömung pro Flächeneinheit (J _{v /} S) bei dem Druck durch das Wasser Manometer Vr / (2ℓ) eingestellt.

Die einfachste Schätzung des Behälters l _p wird vorgenommen, wenn die onkotischen Drucks des Perfusats wurde niedrig relativ zu der Mikrogefäß Druck (typischerweise 3,6 cmH _{2 O,} onkotischen Druck von Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 10 mg / ml und einer Kapillare eingestellt Druck, der größer als 30 cm H _{2 O).} L _p wird berechnet als (J _{v /} S) / (P _c -3) cm / sec / cm H _{2 O,} weil das Albumin Reflexionskoeffizienten (σ _Albumin) in dem Steuerungszustand in der Nähe von 0,9. Mit diesem Ansatz raschen Veränderungen in L _p mit einer Zeitauflösung in der Größenordnung von 1 min lässt sich durch freien Fluss zwischen aufeinanderfolgenden Maßnahmen der J _v / S bei konstantem Druck, wie in den repräsentativen Ergebnissen in Abbildung 4 dargestellt. Der obige Ansatz ig gemessen werdenNORES kleine Änderungen des onkotischen Druck von Albumin, die zu weniger als 1 fällt cmH _{2 O,} wenn der Reflexionskoeffizient fällt unter 0,5, aber der Fehler in der Schätzung von L _p bleibt weniger als 5%, als P _c ist größer als 30 cm H _{2 O} .

Wenn eine genaue Messung sowohl des L _{p und} Reflexionskoeffizienten ist erforderlich, J _{v /} S wird an einer Reihe von Mikrogefäßdrücke unter der erwarteten wirksamen onkotischen Druck des Testmakromoleküls gemessen. Die Steigung der Beziehung zwischen J _v / S und Druckmaßnahmen L _p und dem Schnittpunkt auf der Druckachse beim Nettofluss Null Maßnahmen σπ (Abbildung 5). Die Demonstration, dass Jv linear mit druckabhängig ist auch eine wichtige Bestätigung der Verwendung von einzelnen Druckmessungen mit dem oben beschriebenen einfacheres Protokoll (Abbildung 4), wenn die onkotischen Druckdifferenz niedrig im Vergleich zu hydrostatischen Presseure.

Mögliche Fehlerquellen. Es gibt mehrere Probleme, die eine genaue Messung beeinträchtigen. Nicht ordnungsgemäße Verschließen des Gefäßes oder eine Beschädigung der Gefäßwand an den Okklusionsstelle Ergebnisse in Fluidleck über die Okklusions-Stelle, und die Bewegung des Markierungszellen in Richtung der Verschlussstelle schneller als die aufgrund der transvaskulären Austausch. In der Erwägung, Marker-Zellen in der Regel bewegen sich langsam in Richtung der Verschlussstelle, doch erreichen sie dies nicht tun, wird ein Leck angezeigt, wenn Marker-Zellen zu verfolgen den ganzen Weg zu den Okkluder. Auf der anderen Seite, zum Scheitern der Pipette in die Mikrogefäßlumen am Kanülierungsstelle versiegeln Ergebnisse in Unterschätzung der J _v / S. Flüssigkeitsleck von der Pipette zu dem Superfusat oder Gefßlumens stromauf der Kanülierungsstelle zu einer erheblichen Druckabfall an der Pipettenspitze. Ein solches Leck erfasst wird, wenn Zellen in der Mikropipettenspitze Strömung mit höherer Geschwindigkeit als in dem stromabwärtigen Gefäß luMänner des verschlossenen Gefäßes. Sorgfältige Neupositionierung der Mikropipette dichtet in der Regel wie ein Leck. Ein anderes Problem entsteht, wenn die L _p der Gefäßwand ist nicht einheitlich, mit in der Regel mit einer oder mehreren Stellen der lokalisierten Schäden oder Entzündungen. Marker-Zellen zu verfolgen auf der Website, wenn die meisten transvaskulären Strömung dort konzentriert. Erythrozyten Bewegung misst noch transvaskulär fließen, aber das Maß J _v / S ist nicht repräsentativ für den größten Teil der Wandfläche in dem Testabschnitt.

Bedeutung des Verfahrens in Bezug auf bestehenden Verfahren. Die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um die Regulation der endothelialen Schranke und transvaskulären Austausch untersuchen sind (1) in vitro-Messung der Austausch über kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und (2) Messung der Tracer-Anreicherung in eine Gewebeprobe nach der Tracer wird intravenös in den ganzen Tier injiziert. Experimente in kultivierten Endothelzellen Monoschichten favored da die zellulären Funktionen können mehr direkt geändert werden, es ist genügend Zellmaterial zur genauen Bewertung molekularer Ereignisse in Endothelzellen vorhanden. Jedoch unter den meisten Kulturbedingungen die Endothelzellen in der Regel nicht die Barriere bilden Vertreter der vaskulären Permeabilität in vivo. Das modifizierte Landis Technik oben beschrieben wurde gezeigt, dass eine robuste und zuverlässige Methode, um die Regulation der endothelialen Barriere-Funktion in intakten venulären microvessels untersuchen. In den Händen eines erfahrenen Prüfer gepaart Messungen der Durchlässigkeit unter Kontroll- und Testbedingungen, bei denen ein Teil der in der Zellkultur verwendet Ansätze (zB Bildgebung von Zellkomponenten, Änderung der Signalwege) angewendet werden kann. Die Bedeutung von Experimenten in intakten Mikrogefäße durch die signifikante Unterschiede zwischen den Mechanismen, die Schranke regeln einzeln perfundiert microve nachgewiesenssels und denen oft in kultivierten Endothelzellen Monoschichten beschrieben. Beispiele sind Reaktionen auf scheren, Thrombin Belichtung und den Beitrag der Kontraktionsmechanismen zu entzündlichen Spaltbildung ^2-6,9,16. Messungen der Tracer-Akkumulation in einer intakten Gefäßbett bewahrt mehr normale physiologische Funktion, sondern direkte Untersuchung der realen Veränderungen in der Gefäßdurchlässigkeit sind gefährdet, da Tracer-Anreicherung kann als Folge der erhöhten Durchblutung (vergrößerte Oberfläche für den Austausch) zu erhöhen, mit oder ohne eine Erhöhung der Durchlässigkeit der Wand. Wodurch das Ausmaß einer Durchlässigkeit zu erhöhen schätzt sein, wenn Vasodilatation erhöht die Anzahl der durchströmten Gefäßen und damit insgesamt gelösten Stoff Akkumulation größer ist als die aufgrund der vaskulären Permeabilität allein ³⁴ zu erhöhen.

Zukünftige Anwendungen. Die Palette von Optionen, um zelluläre Struktur und Funktion unter den gleichen Bedingungen, wie Durchlässigkeit von indi ändernnen Schiffe direkt gemessen wird während Mikroperfusion wird voraussichtlich weiter steigen. Weiterhin wird erwartet, dass die Anwendung der Verfahren in gentechnisch veränderten Rattengekröse kann ein Langzeitproblem, das für die genetisch veränderten Mäusen bestanden hat lösen. Genauer gesagt, wenn gentechnisch veränderte Mäuse Verfügung wurde es wurde erwartet, dass Mikroperfusion könnte erweitert werden, um Mikrogefäße in ihren Mesenterialgefäße untersuchen. Während einige Mikroperfusion Experimente haben in Mikrogefäßen der Maus Mesenterium ³⁵ abgeschlossen ist, haben Mäuse in der Regel weniger Mikrogefäße in ihrer mesenterialen Gewebe als Ratten, und diese Schiffe sind oft kurz und stark verzweigten, im Gegensatz zu besser geeignet länger (> 500 & mgr; m) gerade Gefäße, kann bei Ratten gefunden werden. So Experimente, um die Modulation des transvaskulären Austausch untersuchen in genetisch Mäuse auf Assays, wie der Miles ^{34 oder} den technisch anspruchsvoll, aber zuverlässiger Tracer Experimente, die Maßnahme verlassenÄnderungen sowohl in vaskulären und extravaskuläre Akkumulation von fluoreszierenden radioaktiv markierter Testsonden ^36.

Modifikationen des Verfahrens. In den obigen Protokollen Veränderungen Perfusat Zusammensetzung erforderliche Änderung der Mikropipetten. Ein alternativer Ansatz ist es, die Mikropipette in situ Nachfüllen mit einer Nachfüllung Vorrichtung. Diese Prozedur wurde durchgeführt, wie im Detail ³⁷ beschrieben. Die Einschränkung ist, dass die Zeit, um die Zusammensetzung des Perfusats in der Pipette zu ändern, ist nicht so schnell wie durch eine Pipette Ersatz erreicht, aber das Verfahren ist besonders nützlich, wenn es notwendig ist, ein Mikrogefäß für längere Zeiträume durchströmen.

Das gleiche Mikroperfusion fahren kann um Permeabilitätskoeffizienten gemessen werden, um fluoreszenz solute ^31,38-40 beschriftet. In diesem Fall die einzelnen Lauf Mikropipette wird durch einen doppelläufigen (theta) Pipette ⁴¹ ersetzt und das Gefäß perfundiertabwechselnd mit der Test fluoreszierenden gelösten Stoffe zu Gewebeakkumulation relative Messung zum Inhalt Lumen, und das gleiche Perfusat ohne fluoreszierenden gelösten Stoff, das Gewebe zu löschen und wiederholtes Messen des gelösten Akkumulation. Bei Messungen der transvaskulären Wasserströme sind mit den Messungen des gelösten Stoffes Permeabilitätskoeffizient mit fluoreszenzmarkierten Test gelösten Stoffen kombiniert werden, Fluoreszenzindikatoren der intrazellulären Zusammensetzung oder konfokale Bildgebung von Zellbestandteilen wird ein anspruchsvoller computergesteuerten Fluoreszenzmikroskop benötigt. Da diese Untersuchungen erfordern in der Regel Objektive mit stärkerer Vergrößerung und viel kürzeren Arbeitsabstand, wird der Quarzsäule verwendet, um das Mesenterium halten Sie von einem Deckglas mit einem Plexiglas-Unterstützung innerhalb des Gewebes auf dem besten Mikroskop Schale verklebt ersetzt. Die erhöhte Verfügbarkeit von 3-D-Drucker, werden hochpräzise Fertigung von individuellen Löffeln, die den engen Toleranz erforderlich, um größere diamete positionieren treffen erlaubenR-Objektive mit kürzeren Arbeitsabstand relativ zu ausgewählten Mikrogefäßen.

Die Verfügbarkeit von nutzbaren Mikrogefäße im Mesenterium variiert mit dem Alter, Geschlecht und Stamm. Daher sind die Möglichkeiten der Rattenstamm und die Verwendung der männlichen oder weiblichen auf spezifische Fragen abhängen gerichtet. Für viele unserer jüngsten Studien haben wir männliche Sprague-Dawley-Ratten, die in unserem Tiereinrichtung mindestens eine Woche bei etwa 3-4 Monate alt, an der Zeit, die wir finden sie in der Regel zur Verfügung langen, geraden mesenterialen Mikrogefäßen akklimatisiert werden vor der Anwendung verwendet wird. Im Gegensatz dazu haben unsere Kolleginnen und Kollegen erfolgreich weiblichen Sprague-Dawley-Ratten von 2-3 Monaten ¹³ Jahren verwendet.

Die Rolle der roten Blutzellen. Die primäre Rolle der roten Zellen, wie oben beschrieben wurde, um zu verfolgen transvaskulären Wasserbewegung unter der Annahme, die Zelle fungierte als inert, neutral tariert Indikatoren für Wasser fließt, nachdem die Mikrogefäße wurden verschlossen. Zusätzlich zu dieser grundlegenden Rolle, esist nun anerkannt, daß die roten Zellen, zur Stabilität der Barriere durch Zuführen S1P zum Perfusat wenn Albumin in Gegenwart ^31,42,43. Es gibt mehrere wichtige Implikationen dieser Beobachtungen. In Abwesenheit von Erythrozyten oder mit der Verwendung von alternativen inerten Fließmarkierungen das Basislässigkeit wahrscheinlich weniger stabil zu sein. Es wird empfohlen, dass die Messungen der S1P sollte in allen Experimenten verwendet in Mikroperfusionskammer perfusates erfolgen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse HL44485 und HL28607 unterstützt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

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Molecular Biology Ausgabe 103 Mikroperfusion Ratte Mesenterium hydraulische Leitfähigkeit Permeabilität Landis Technik