Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Abstract

Gli esperimenti per misurare le proprietà di permeabilità dei microvasi irrorati individualmente forniscono un ponte tra studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano la permeabilità vascolare in coltura monostrato di cellule endoteliali e le proprietà di scambio funzionali di interi letti microvascolari. Un metodo per cannulare e perfusione microvasi venulari di ratto mesentere e misurare la conduttività idraulica della parete dei microvasi è descritta. Le principali attrezzature necessarie include un microscopio intravitale con un grande palco modificato che supporta micromanipolatori di posizionare tre differenti microtools: (1) una micropipetta di vetro smussato a cannulare e perfusione microrecipiente; (2) un vetro micro-occlusore per bloccare transitoriamente perfusione e consentire la misurazione di transvascular movimento flusso d'acqua ad una pressione idrostatica misurata, e (3) una bacchetta di vetro smussato per stabilizzare il tessuto mesenterico nel sito di incannulamento. Il Landis micro-occlusione techniq modificatoue utilizza globuli rossi sospese nel perfusato artificiale come marcatori di fluido movimento transvascular, e consente inoltre misurazioni ripetute di questi flussi condizioni sperimentali sono cambiati e differenza idrostatica e colloide pressione osmotica attraverso i microvasi sono attentamente controllati. Le misurazioni della conducibilità idraulica prima con un perfusato controllo, quindi dopo la ri-incannulamento della stessa microvasi con i perfusates prova consentono confronti della risposta dei microvasi in queste condizioni ben controllate associati. I tentativi di estendere il metodo per microvasi nel mesentere di topi con modificazioni genetiche che si prevede di modificare la permeabilità vascolare erano fortemente limitata a causa dell'assenza di lunghi microvasi dritti e ramificati nel mesentere del mouse, ma la recente disponibilità dei ratti con modificazioni genetiche simili utilizzando la tecnologia / Cas9 CRISPR è prevista l'apertura di nuove aree di indagine in cui possono essere applicati i metodi qui descritti.

Introduction

Microperfusione nella vascolatura comporta istituisce controllato flusso di perfusato artificiale di composizione nota mediante una micropipetta in un vaso sanguigno di solito meno di 40 micron di diametro. Il vaso perfuso rimane nel suo ambiente tessuto normale e viene perfuso con dell'animale sangue fino al momento della cannulazione. Quando utilizzato in combinazione con una serie di video di immagini o di tecniche fluorimetrica, in situ microperfusione consente la misurazione dei flussi idrici e dei soluti attraverso le pareti dei microvasi in condizioni quali siano note le forze trainanti di questi flussi e le proprietà di permeabilità della parete vascolare può essere direttamente valutati. Inoltre, controllando la composizione del fluido circostante microrecipiente nel tessuto (perfusato e superfusate), la regolazione della permeabilità microvascolare e di scambio può essere indagata attivando le cellule endoteliali formano la parete microrecipiente essere esposti a una varietà di econdizioni Xperimental (agonisti, le condizioni di perfusione modificate, indicatori fluorescenti per misurare la composizione intracellulare e di segnalazione) per periodi misurati con precisione di tempo (sec a hr). Inoltre, le valutazioni ultrastrutturali o citochimici di chiave strutture molecolari cellulari che regolano la barriera possono essere studiate nelle stesse microrecipienti in cui la permeabilità viene misurata direttamente. L'approccio costituisce così un ponte tra studio dei meccanismi cellulari e molecolari di modificare la funzione di barriera endoteliale in coltura monostrato di cellule endoteliali e indagine microvasi intatti. Vedere le seguenti recensioni per un'ulteriore valutazione ^1-6.

Una limitazione di microperfusione è che può essere utilizzato solo in letti microvascolari che sono sottili, trasparenti e con integrità strutturale sufficiente a consentire incannulazione con una micropipetta di vetro. Mentre i primi accertamenti utilizzati microvasi rana in mesenterio e sottile cutanea pectoris muscle ^7,8, di gran lunga la preparazione più comunemente usato nei modelli di mammiferi è il topo mesentere ^9-15. La maggior parte delle indagini si sono concentrate sui cambiamenti acuti in permeabilità vascolare studiato per periodi di 1-4 ore, ma le indagini più recenti sono state estese a misurazioni su singoli pescherecci 24-72 ore dopo un iniziale perfusione ^12,16. La tecnologia CRISPR recentemente sviluppato, che promette di rendere più modelli di ratto geneticamente modificati per lo studio vascolare regolazione della permeabilità ¹⁷ dovrebbe consentire i metodi descritti nella presente comunicazione da applicare in microvasi venulari del mesentere di questi nuovi importanti modelli di ratto.

Il metodo richiede un microscopio rovesciato dotato di un palco microscopio su misura sufficientemente grande per contenere sia la preparazione degli animali e almeno tre micromanipolatori utilizzato per posizionare microtools vicino alla nave perfuso e per allineare una micropipetta perfusione con la navelumen. Ad esempio una piattaforma personalizzata per un palco microscopio xy (circa 90 × 60 cm) può essere fabbricata da una piastra di acciaio dello spessore di 1 cm con un rivestimento antiruggine. Lo stadio è collegato a una tabella indice ingegneria o due slitte a coda di rondine montate ad angolo retto e supportati su pilastri teflon o trasferimenti a sfere per il movimento nel piano orizzontale. Un impianto tipico (vedi figura 2) ha molto in comune con il microscopio e microposizionamento attrezzature utilizzate per una serie di esperimenti microcircolazione intravitale come quelli per misurare il flusso unico dei vasi sanguigni e dell'ematocrito, il trasporto di ossigeno locale sangue perfusione microvasi, regolazione di vascolare liscio il tono muscolare, e l'accumulo microvascolare locale dei traccianti fluorescenti iniettate nel suo complesso circolazione. ^18-26

L'aspetto fondamentale della tecnica è la misura della portata (J _v) attraverso una superficie definita (S) della parete microvascolare. Realizzarequesto tramite la tecnica Landis modificato qui descritta una semplice microscopio invertito è adeguata. Una piccola videocamera è montata sulla porta immagine e il segnale video, con una base tempo aggiunto, viene visualizzato su un monitor video e registrate in forma digitale su un computer o un segnale digitale o analogico su un videoregistratore. Una volta microrecipiente si incannula la porzione di microvasi visibile alla telecamera può essere modificato spostando la fase e manipolatori come unità senza interrompere la cannulazione.

Misurazione dei flussi transvascular può anche essere combinato con indagini più dettagliate utilizzando un sofisticato microscopio a fluorescenza con filtri appropriati, quali impianti utilizzati per la misurazione di soluto permeabilità, controllo rapporto fluorescente di calcio citoplasmatico o di altri meccanismi cellulari, e confocale ^{6,12,13, 27.} Un vantaggio fondamentale di tutti gli approcci microperfusione è la capacità di fare misure ripetute, sulla nave, Sotto cambiamento controllato di forza motrice, come pressioni idrostatiche e oncotica, o cambiamento indotto nella risposta dei vasi alle condizioni infiammatorie. Il tipo più comune è un confronto accoppiato di conduttività idraulica misurata (L _p) sulla nave con il vaso prima perfuso con una micropipetta riempito con un perfusato controllo e sospensione di eritrociti per stabilire uno stato basale permeabilità, quindi con una seconda pipetta con l'agente di test aggiunto perfusato. Molteplici cannulazioni sono possibili con il ciclo ripetuto dopo riperfusione con la pipetta di controllo.

Il presente protocollo dimostra la cannulazione e microperfusione di un vaso venulare nel ratto mesentere registrare flussi di acqua attraverso la parete microvessel e misurare la L _p della parete del vaso, un indice utile della permeabilità del percorso comune per l'acqua e soluti attraverso intatto barriera endoteliale. La procedura si chiama techniq Landis modificatoue perché il principio originale Landis di utilizzare il movimento relativo dei globuli rossi come misura di scambio fluido transvascular dopo perfusione è bloccato è conservato ^28, ma la gamma di condizioni sperimentali (ad esempio, le differenze di pressione oncotica idrostatica e albumina attraverso la parete microrecipiente) disponibile dopo microperfusione è di gran lunga maggiore rispetto al sangue perfuso uncannulated microvasi ^8,29.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale.

1. Fabbricazione preliminare di Micropipette, la limitazione dei movimenti, e bloccanti

1. Estrarre diversi tubi capillari di vetro borosilicato pulite in metà con un estrattore elettronico regolato in modo che, quando viene tirato, la porzione allungata del tubo è di circa 1 cm di lunghezza e le due metà sono piuttosto simmetriche. Assicurarsi che il cono è coerente con le dimensioni in figura 1. Utilizzare le due metà per micropipette, la limitazione dei movimenti e bloccanti.
   1. Bevel le micropipette con un'aria azionato mola ^{30 con} 0,5 micron carta abrasiva bagnata con acqua. Impostare l'angolo del supporto micropipetta in modo che sia di circa 30 gradi rispetto all'orizzontale.
   2. Lavare accuratamente e asciugare le micropipette utilizzando aspirazione a tirare acetone pulita attraverso la punta e il pozzo. Ispezionare le micropipette (Figura 1A) con un piccolo microscopio verticale con 4 × 40 × e gli obiettivi dotati di un supporto micropipetta coccodrillo e un reticolo oculare.
   3. Selezionare le micropipette con apertura punta di circa 50 micron di lunghezza con uno smusso il cui rapporto lunghezza / larghezza è compresa tra 3.1 e 3.5 e con un punto di profonda rastrematura che aiuta a penetrare le fibre di collagene dure nel mesentere.
   4. Conservare 15-20 micropipette di leggermente diverse dimensioni in una scatola senza polvere.
2. Fai la limitazione dei movimenti che utilizzano tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare di vetro tirato brevemente vicino a un microfiamma per formare una punta smussata (Figura 1B). Conservare diversi in una scatola senza polvere.
3. Fai microoccluders utilizzando tubi capillari tirato previste al punto 1.1). Tenere un tubo capillare tirato sotto un microfiamma e delicatamente piegare (tramite un adattatore tubi, ad es., 23G) la punta fine (circa 4 mm dalla punta) a formare un angolo di quasi 120 gradi all'albero (

Preparazione degli animali 2. e Chirurgia

1. Anestetizzare maschile (350-450 g) o ratti femmina Sprague-Dawley (200-300 g) con sodio pentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) per via sottocutanea; proteggere il mesentere non usando iniezione intraperitoneale.
2. Nel corso procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l'anestesia con iniezioni supplementari (30 mg / kg) in base alle esigenze. Determinare profondità dell'anestesia per pizzico piedi o riflesso corneale. Dopo il completamento della procedura sperimentale, eutanasia ratto con pentobarbital sovradosaggio o iniezione intra-cardiaca di cloruro di potassio saturo sotto anestesia.

3. Preparare Soluzioni e eritrociti da utilizzare come flusso Marcatori

1. Preparare la soluzione dei mammiferi di Ringer per superfusate e soluzione di controllo perfusato (mammiferi soluzione di Ringer contenente 10 mg / ml di acido grasso in generegratis albumina sierica bovina, BSA).
   1. Filtro perfusato attraverso 0,2 micron filtri siringa per rimuovere le particelle molto piccole che potrebbero bloccare la punta micropipetta; filtrare nel piccolo contenitore pulito.
2. Preparare eritrociti disegnando circa 0,2 ml di sangue dalla vena della coda del topo anestetizzato in un ago 20G in una piccola siringa contenente 0,05 ml di eparina (1.000 U / ml) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente circa 14 ml di mammifero soluzione Ringer .
   1. Centrifuga per imballare delicatamente le cellule rosse (circa max 200 × g per 7 minuti). Aspirare il surnatante e risospendere i globuli rossi in soluzione di Ringer.
   2. Dopo centrifugazione e la rimozione del supernatante tre volte lasciano i globuli rossi concentrati nella parte inferiore del tubo per un uso successivo. Si noti che questa procedura riduce piastrine nei perfusates finali a meno dello 0,1% dei livelli normali ^31.

4. Disporre il tessuto sul AnimalVassoio

1. Radere l'addome del topo anestetizzato da sotto l'ombelico al processo xifoideo. Assicurarsi che l'area rasata estende intorno al lato destro (per ratto posto sul lato destro) in modo che i capelli non forma uno stoppino per disegnare il superfusate fuori del tessuto ben. Rimuovere i peli tagliati con una garza bagnata o tessuto.
   1. Tenere la pelle con un ottuso pinza dentata e fare un'incisione linea centrale (lunga 2-3 cm) attraverso la pelle utilizzando un paio di forbici robuste. Utilizzando una multa (iris) forbici fanno un'incisione simile attraverso la linea alba, sollevando la parete addominale con una pinza dentata per evitare di danneggiare l'intestino.
   2. Con l'animale su un fianco sul vassoio animale, estrarre delicatamente l'intestino dalla cavità addominale utilizzando applicatori con punta in cotone (bastone di legno) imbevute di soluzione di Ringer e pinze dentellate smussato. Disporre l'intestino nel tessuto bene in modo che il mesentere è drappeggiato su colonna per la visualizzazione al microscopio facendo attenzione a non toccare il mesentere (potentially danneggiando microvasi) sia con pinze o cotone.
      Nota: Il vassoio animale (Figura 2A) può essere costruito da plexiglas e richiede un tessuto ben (circa 3 mm di profondità), una colonna otticamente trasparente (ad esempio, quarzo lucidato circa 2 cm di diametro e 5 mm di altezza.), E un tampone riscaldamento regolato per mantenere la temperatura dell'animale. Lo spessore del pilastro non deve superare la distanza di lavoro dell'obiettivo.
2. Posizionare il vassoio animale sul palco microscopio in modo che il mesentere è visibile attraverso gli oculari.
3. Posizionare una linea di gocciolamento per gravità a superfuse continuamente mesentere con la soluzione dei mammiferi di Ringer mantenuta a 35-37 ° C. Utilizzare garze per tenere l'intestino in luogo, contribuire a mantenere l'umidità e favorire la soluzione in eccesso di Ringer fuori dalla superficie. Regolare il flusso e aspirare l'effluente di mantenere uno spessore superfusate coerente.
4. Identificare bersaglio microvasi venulari, che sonosegmenti non ramificate a valle del flusso convergente, uno o due rami distali ai veri capillari. Trovare un vaso non ramificato (idealmente, da 600 a 1.000 micron di lunghezza) che hanno attivo il flusso di sangue e privo di globuli bianchi che spuntano sulle pareti del serbatoio.
5. Posizionare microrecipiente prova nel centro del campo ottico e spostare il dispositivo di immobilizzazione nella posizione vicino al sito cannulazione prescelto.

5. Riempire Micropipetta e il Monte di Holder

1. Poco prima cannulating, sospendere i globuli rossi del perfusato. Aggiungere 7 ml di globuli rossi concentrati a 0,5 ml perfusato in una provetta pulita borosilicato. Nota: ematocrito del 1-3% può essere utilizzato, ma ematocrito coerente porterà a concentrazioni perfusato coerenti di eventuali sostanze rilasciate dai globuli rossi.
2. Montare una siringa da 1 ml con un adattatore tubi 23G e PE 50 tubi (5-15 cm di lunghezza). Disegna la / miscela di cellule rosso perfusato nella siringa. Capovolgere la siringa per mescolare ed espellere tutte le bolle dal tubo eadattatore. Per una maggiore efficienza, la tubazione adatta a diverse siringhe prima dell'inizio dell'esperimento e tenerli in una scatola senza polvere o sacchetto di plastica.
3. Riempire il micropipetta avanzando il tubo nel grande fine della micropipetta fino a che non confina con la regione rastremata. Applicare una spinta rapida delicato sulla stantuffo della siringa per riempire la punta micropipetta. Nota: Un piccolo ruscello o di goccioline devono essere visibili sulla punta di evidenziare riempimento completo.
4. Ritirare il tubo mentre spingendo delicatamente lo stantuffo per riempire la parte più larga dell'albero micropipetta. Rimuovere piccole bolle nel vasto pozzo muovendo con cautela l'albero micropipetta. Nota: Una procedura simile è stata illustrata ^32.
5. Posizionare la micropipetta in un supporto pipetta con una porta laterale che consente un collegamento di fluido continuo ad un manometro ad acqua. Assicurarsi che il titolare, che è attaccato ad un azionamento idraulico utilizzato per controllare l'avanzamento molto fine della micropipetta, è con una leggera angolazione (15-25 °)all'orizzontale in modo che il bordo del cono micropipetta non colpisce l'intestino o il vassoio.
6. Montare l'azionamento idraulico su un micromanipolatore mobile, che ha x, y, z e unità per consentire stretto allineamento al recipiente di prova (figura 2).
7. Regolare la pressione idrostatica applicata al fluido nella micropipetta con una siringa o bulbo di gomma pieno d'acqua per modificare l'altezza del liquido nella colonna d'acqua del manometro a circa 40 cm H ₂ O sopra mesentere.
8. Incannulare microrecipiente appena possibile dopo il riempimento della pipetta; globuli rossi si depositano sul fondo della pipetta, in modo che dopo circa 40 min pochissimi globuli rossi fluirà nel recipiente.

6. Microcannulation e microvascolari pressione misura

1. Prima di posizionare la micropipetta pieno sotto il microscopio, premere delicatamente il restrainer sul tessuto pressi microrecipiente applicare una forza sufficiente per afferrare il tessuto. Disegnare larestrainer indietro, leggermente l'allungamento dei tessuti in linea con microrecipiente modo che le sollecitazioni nelle fibre di collagene mesenterici sono allineate con il vaso.
   1. Allineare la micropipetta con la nave e abbassarlo in vista attraverso gli oculari. Posizionare la punta appena a monte del sito di incannulamento scelto e abbassarlo sul tessuto in modo che ostruisce parzialmente il flusso all'interno del recipiente, ma non occlude esso.
2. Incannulare la nave guidando la punta della pipetta lentamente nel lume del vaso con l'azionamento idraulico. Fare attenzione a non spingere attraverso il lato inferiore del recipiente.
   Nota: Poiché la micropipetta entra nel lumen, il perfusato lava rapidamente il sangue nel vaso di lume e perfusato liberamente sfocia circolazione distale degli animali alla microrecipiente prova, spostando parte del normale perfusione sanguigna nei vasi a valle.
3. Abbassare la pressione di perfusione regolando manometro finché il sangue (come indicatoda globuli rossi dell'animale) viene tirato indietro nel segmento perfusione; questo determina la pressione equilibrio in cui i globuli rossi oscillano dolcemente nel lume del vaso e misura la pressione idrostatica microvasi (P _c) all'estremità distale del segmento microvasi. Mantenere nave perfusione a tutte le pressioni di cui sopra questa pressione equilibrio.

7. Microocclusion e raccolta dei dati

1. Passaggio facoltativo: Prima di utilizzare il micro-occlusore per bloccare la nave, premere in tessuto, in una zona non utilizzata di mesentere lontano da ogni nave in modo che la punta si accumula un bel blocco di tessuto che protegge la nave sperimentale durante micro ripetuto occlusioni.
2. Posizionare il blocco di sopra del recipiente perfuso vicino al bordo inferiore del campo del microscopio.
3. Registrare il seguente con il video e l'audio.
   1. Verbalmente registrare la posizione del sito di blocco e il bordo schermo inferiore come visto sul reticolo oculare.
   2. Con la puntadel bloccante posta proprio sopra il microvasi, utilizzare il controllo z multa di micromanipolatore per abbassare delicatamente il blocco fino a quando il flusso nel serbatoio è occluso. Nota la pressione manometro (P _c) audio. Applicare l'occlusione di solito per 3-10 secondi, quindi rilasciare, ripristinando la perfusione gratuito. Spostare il sito blocco la nave verso la punta della pipetta in 5-10 micron passi in base al tempo (> 5 min dopo il blocco iniziale in un sito), il numero di occlusioni (3-5), per evitare di danneggiare parete del vaso presso il sito del blocco .

8. Analisi dei dati e valutazione di _L p (acqua permeabilità)

1. Durante la riproduzione video, determinare la distanza iniziale (ℓ ₀₎ da una cella rossa marcatore per il sito dell'occlusione dall'uso di un'immagine di un micrometro e le posizioni note sulle immagini. Determinare la velocità iniziale (dℓ / dt) della cella marcatore dalla sua posizione in diversi frame durante la 3-10 sec di immagini registrate. Dissuadereminiera il raggio del serbatoio (r) dalle immagini scattate durante l'occlusione (Figura 3).
2. Calcola J _v / S per ogni occlusione (dℓ / dt) × (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Calcolare L _p ad una pressione costante (J _v / S) diviso per la pressione di pilotaggio (pressione microvasi - efficace pressione osmotica colloide; vedi Discussione).

Representative Results

La Figura 4 mostra i risultati di misurazione del decorso temporale delle variazioni di L _p in un ratto venulare microvasi cannulato successivamente con quattro perfusates. ³³ L'entità di L _p calcolata a pressione costante è stato usato come una misura delle variazioni di microvasi permeabilità della parete, prima nello stato di controllo con un perfusato contenente 1% di albumina sierica bovina poi, quando la nave è stata esposta per la bradichinina agente infiammatorio (Bk) utilizzando un secondo micropipetta contenente 10 nM Bk. La bradichinina ha causato un aumento transitorio _L p che ha restituito il valore verso il controllo della successiva 10-15 minuti. Il vaso è stato poi ri-perfusi con controllo perfusato per 30 min a ristabilire una linea di base stabile. Quando la microvasi è stato perfuso con una quarta micropipetta con la stessa concentrazione di Bk e 1 mM sfingosina-1-fosfato (S1P) nel perfusato, la risposta a Bk era significativamente attenuato. Il grado diattenuazione quando Bk e S1P stati perfusi allo stesso tempo è risultato simile a quello misurato in altri esperimenti in cui S1P stato aggiunto al perfusato fino a 20 minuti prima dell'esposizione Bk. Questi risultati dimostrano il potere di essere in grado di effettuare misurazioni multiple di L _p su un unico recipiente, e indicano che l'azione di un agente come S1P per stabilizzare la parete del vaso in presenza di un agente infiammatorio può essere risolto in periodi di tempo su dell'ordine di pochi secondi. In recipienti separati sono stati effettuati studi di controllo con un protocollo simile in assenza di S1P per dimostrare che l'attenuazione della risposta Bk non era dovuta ad anafilassi.

Per alcuni disegni sperimentali è importante stimare sia il coefficiente di riflessione del soluto per un macromolecola (σ) e L _p. Questo si ottiene meglio misurando J _v a molteplici pressioni di ciascun individuo microrecipiente. Figura 5 mostra un esperimento in che sia L _p e la pressione oncotica efficace del 5% di albumina nel perfusato (π _albumina = 27 cmH ₂ O a 37 ° C) sono stati stimati in condizioni in cui non c'era albumina nel tessuto circostante microrecipiente ratto. In questi esperimenti J _v / S è stata misurata a tre diverse pressioni. La L _p è la pendenza del rapporto tra J _v / S e pressione, e l'intercetta sull'asse pressione è la differenza effettiva pressione oncotica attraverso la parete del serbatoio (σΔπ).

Figura 1. Microtools per la perfusione di singoli microvasi. (A) Una micropipetta per incannulamento di microvasi ratto con una punta smussata. (B) Un dispositivo di immobilizzazione per azienda di tessuti mesentery stabile nei pressi del sito di incannulamento. (C) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. rig intravitale per microperfusione. (A) Presentazione di vassoio animale con micromanipolatori e microtools orientati su colonna in vetro. (B) fase Large Metal montato sul tavolo di ingegneria e cuscinetti di supporto. (C) anestetizzati ratto con microtools in posizione per microperfusione di un microvasi. (D) Vista vicina di mesentere durante un esperimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figu ri.

Figura 3. Misurazione della velocità di filtrazione per unità di superficie con la tecnica Landis modificato. Questo schema mostra un singolo microrecipiente cannulata con una micropipetta e un'asta occlusione posizionata sopra la nave. Subito dopo occludendo microrecipiente, la distanza (ℓ ₀₎ tra il marcatore RBC viaggiando sulla linea centrale del microvasi occluso e il sito dell'occlusione è registrato in modo che la traiettoria cella può essere seguita per 5-10 secondi dopo l'occlusione. La posizione iniziale (ℓ ₀₎ e velocità iniziale (dℓ / dt) della cella vengono utilizzati per calcolare la velocità di filtrazione medio per unità di superficie di parete microvascolare tra la cellula marcatore e il sito di occlusione. Il microoccluder viene poi portata, e la perfusione gratuito stabilita prima ulteriori misurazioni sono fatti.com / file / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Dati rappresentativi mostrano che sfingosina-1-fosfato (S1P) inibizione agisce molto velocemente bradichinina (Bk; 10 Nm). Ha causato un aumento transitorio dei microvasi _L p. S1P applicato come in concomitanza con la seconda bradichinina (BK) prova inibito la acuta Bk risposta relativa alla prima Bk. Questi dati dimostrano che il tempo di esposizione ad un agente di test può essere modificato per valutare la cinetica di attivazione di una risposta inibitoria. Nello specifico, S1P concomitanza applicato solo con Bk fortemente inibito la risposta Bk. S1P è stato di 1 micron e Bk era 10 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Misurazione di J _v / S a pressioni multiple consente sia L _p e la pressione oncotica efficace da misurare. Il flusso di filtrazione, J _v / S, è stata misurata in questo vaso a varie pressioni idrostatiche microvasi durante la perfusione con BSA (50 mg ml ^{- 1;} π = 27 cm H _{2 O),} mentre il mesentere era bagnata con una soluzione di Ringer priva di proteine. La pendenza della relazione tra J _v / S e pressione è la L _p e l'intercetta sull'asse pressione indica la differenza di pressione oncotica efficace attraverso la parete del vaso. In questo esperimento la Lp era 1,2 × ¹⁰ -7 (cm ^sec-1 _cmH2O ^-1) e il σΔπ era 24 cmH ₂ O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Dettagli dei calcoli _p L. Anche se il movimento fluido transvascular si verifica mentre la nave è liberamente perfuso, tale scambio è troppo piccolo per essere misurato durante la perfusione libero perché è in genere inferiore allo 0,01% del tasso di perfusione nave. Tuttavia, in condizioni di perfusione viene transitoriamente fermato occludendo microrecipiente, flusso transvascular (cioè, filtrazione) è misurata dal movimento dei globuli rossi marcatori nel lume della colonna di fluido tra una cellula rossa marcatore e il sito dell'occlusione accorcia come mostrato in Figura 3. A seconda della complessità e lunghezza del protocollo sperimentale una nave non ramificato è necessaria 600 a 1000 micron di lunghezza.

Quando la nave non è occlusa e la pressione del manometro sta guidando flusso attraverso microrecipiente, la caduta di pressione attraverso la punta della pipetta è grande in modo che la pressione microvascolare durante la perfusione libero è tipicamente solopochi cmH ₂ 0 sopra della pressione a valle. Al contrario, durante un'occlusione la caduta di pressione attraverso la pipetta è molto piccola a causa fluido entrando lentamente il lume del vaso per sostituire il filtraggio del fluido attraverso la parete del vaso. Così, durante l'occlusione della pressione idrostatica nel lume del vaso (P _c) è uguale a quella impostata dal manometro. La pressione oncotica nel tessuto mesenterico è trascurabile, quindi immediatamente dopo l'occlusione, movimenti fluidi transvascular dai globuli rossi marcatori sono misurate dove la pressione idrostatica è nota e la pressione oncotica nel lume del vaso è uguale a quella impostata nel perfusato. Con misurazioni successive di L _p, lunghezza della nave viene persa ogni volta che il sito blocco è avanzata. Inoltre, successiva recannulation riduce disponibile lunghezza dell'imbarcazione.

Il flusso del fluido transvascular areica parete del serbatoio (J _v / S) è stimato dal prezzo che una lunghezza misurata della colonna d'acqua nel microVlumen Essel tra una cellula rossa marcatore e il sito dell'occlusione o riduce (filtrazione netto) o prolunga (riassorbimento netto). L'ipotesi è che le cellule rosse galleggiamento neutro spostano lungo la linea centrale del lume del vaso possono essere utilizzati per monitorare la velocità media della colonna d'acqua che circonda la cella (il rapporto tra la velocità eritrocitaria significare velocità dell'acqua è vicino a 1,8 per un 6 micron globuli rossi in un recipiente 30 micron di diametro). ^8,14 Pertanto, se la velocità di una cella di riferimento (in micron / sec) verso il blocco è V micron / sec sul primo 2-5 sec dopo l'occlusione, e il raggio del serbatoio è R, il volume di liquido filtrato attraverso la parete microvessel tra tale eritrocitaria e il sito di occlusione (J _v) è πr ² V ³ micron / sec assumendo microrecipiente è cilindrica. Inoltre l'area di una microvascolare cilindrica (S) tra quella cella marcatore e il sito dell'occlusione è 2πrℓ, dove ℓ è la distanza iniziale tra la cella marcatoree il sito dell'occlusione. Così il flusso transvascular media iniziale per unità di superficie (J _v / S) alla pressione impostata dal manometro ad acqua Vr / (2ℓ).

La stima più semplice della nave _L p è fatto se la pressione oncotica del perfusato è stata impostata bassa rispetto alla pressione microvasi (tipicamente 3,6 _cmH2O, la pressione oncotica di albumina sierica bovina ad una concentrazione di 10 mg / ml e un capillare pressione superiore a 30 cm H _{2 O).} L _p è calcolato come (J _v / S) / (P _c -3) cm / sec / cm H ₂ O perché il coefficiente di riflessione di albumina (σ _albumina) nello stato di controllo è vicino a 0,9. Con questo approccio rapidi cambiamenti nella L _p con una risoluzione temporale dell'ordine di 1 min può essere misurata stabilendo flusso libero tra misure successive di J _v / S a pressione costante come mostrato nei risultati rappresentativi in Figura 4. Il ig approccio sopraNores piccoli cambiamenti nella pressione oncotica di albumina che rientrano a meno di 1 cmH ₂ O quando il coefficiente di riflessione è inferiore a 0,5, ma l'errore nella stima di _L p rimane meno del 5% quando P _c è maggiore di 30 cmH ₂ O .

Quando è richiesta una misurazione precisa sia coefficiente L _p e riflessione, J _v / S è misurata ad una serie di pressioni microvasali sotto l'effettiva pressione oncotica prevista della macromolecola test. La pendenza della relazione tra J _v / S e misure di pressione L _p e l'intercetta sull'asse pressione quando il flusso netto è pari a zero σπ misure (Figura 5). La dimostrazione che Jv è correlata linearmente alla pressione è anche un importante convalida dell'impiego di misure di pressione singoli utilizzando il protocollo più semplice sopra descritta (figura 4) quando la differenza di pressione oncotica è bassa rispetto alla pressa idrostaticaUre.

Possibili fonti di errore. Ci sono diversi problemi che compromettono la misura esatta. La mancata occlude correttamente il serbatoio o danni alla parete del vaso i risultati sito dell'occlusione a perdita di liquido oltre il sito dell'occlusione, e il movimento delle cellule marcatori verso il sito dell'occlusione più veloce di quella dovuta allo scambio transvascular. Mentre le cellule marcatori normalmente si muovono lentamente verso il sito dell'occlusione, ma non raggiungono esso, una perdita è indicato se le cellule marcatori seguire tutto il senso alla occlusore. D'altra parte, il fallimento per sigillare la pipetta nel lume microrecipienti presso il sito incannulamento risultati in sottovalutazione di J _v / S. Perdita di liquido dalla pipetta alla superfusate o lume del vaso a monte del sito di incannulamento provoca una caduta di pressione significativo attraverso la punta della pipetta. Viene rilevata una tale perdita quando le cellule nel flusso punta micropipetta a velocità superiori a quelle della lu recipiente a valleuomini del vaso occluso. Riposizionamento attento del solito micropipetta sigilla una tale perdita. Un altro problema si verifica se la L _p della parete del vaso non è uniforme, di solito avere con uno o più siti di danno localizzato o infiammazione. Cellule tracciatore al sito se la maggior parte del flusso transvascular è concentrato lì. Movimento cellulare Red misura ancora transvascular flusso, ma la misura J _v / S non è rappresentativo della maggior parte della zona della parete all'interno del segmento di prova.

Importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti. I due metodi più comunemente utilizzati per indagare la regolazione della endoteliale permeabilità barriera e scambio transvascular sono (1) nella misurazione di cambio tra colture monostrato di cellule endoteliali e (2) la misura di accumulo del tracciante in vitro un campione di tessuto dopo il tracciante viene iniettato per via endovenosa nel intero animale. Gli esperimenti in coltura monostrato cellule endoteliali sono favored perché le funzioni cellulari possono essere più direttamente modificati e c'è materiale cellulare sufficienti per una valutazione dettagliata degli eventi molecolari in cellule endoteliali. Tuttavia nella maggior parte delle condizioni di coltura delle cellule endoteliali di solito non costituiscono rappresentante barriera di permeabilità vascolare in vivo. La tecnica di Landis modificato sopra descritto è stato dimostrato di essere una tecnica robusta e affidabile per studiare la regolazione della funzione di barriera endoteliale in microvasi venulari intatti. Nelle mani di un investigatore esperto accoppiato misure di permeabilità in condizioni di controllo e di verifica in cui alcuni degli approcci utilizzati in coltura cellulare (ad es, l'imaging di componenti cellulari, modifica dei percorsi di segnalazione) può essere applicata. L'importanza di esperimenti in microvasi intatti è stata dimostrata da mostra differenze significative tra i meccanismi che regolano barriera di permeabilità in microve perfuso singolarmentessels e quelli spesso descritti in monostrati endoteliali in coltura. Gli esempi includono risposte a taglio, l'esposizione trombina, e il contributo dei meccanismi contrattili di formazione divario infiammatorio ^2-6,9,16. Misure di accumulo del tracciante in un letto vascolare intatto conserva funzione più normale fisiologica ma indagini dirette di cambiamenti reali nella permeabilità vascolare sono compromessa a causa di accumulo di tracciante può aumentare come risultato di un aumento della perfusione (maggiore superficie di scambio) con o senza un aumento del permeabilità della parete. Pertanto la portata di un aumento di permeabilità può essere sovrastimato quando vasodilatazione aumenta il numero di vasi perfusi e quindi l'accumulo totale di soluto è maggiore di quello dovuto aumento della permeabilità vascolare sola ^34.

Le future applicazioni. La gamma di opzioni per modificare la struttura e la funzione cellulare nelle stesse condizioni come permeabilità indivasi individuali è direttamente misurati durante si prevede microperfusione ad aumentare. Inoltre si prevede che l'applicazione dei metodi di geneticamente modificato mesentere ratto può risolvere un problema a lungo termine che esiste da topi geneticamente modificati. In particolare, quando i topi geneticamente modificati, si sono resi disponibili ci si aspettava che microperfusione potrebbe essere esteso per indagare microvasi nei loro vasi mesenterici. Mentre alcuni esperimenti microperfusione sono stati completati in microvasi di topo mesenterio ^35, topi hanno generalmente un minor numero di microvasi nel loro tessuto mesenterica dei ratti, e questi vasi sono spesso brevi e molto ramificata, in contrapposizione ai più lunghi (> 500 micron) le navi dritte più adatti che può essere trovato nei ratti. Così esperimenti per indagare la modulazione di scambio transvascular in topi geneticamente hanno fatto affidamento sulle analisi come il Miles ^{34 o} gli esperimenti tracciante tecnicamente impegnativi, ma più affidabili che misuranocambiamenti sia vascolare e l'accumulo extravascolare di fluorescenza di sonde radiomarcate ^36.

Le modifiche del metodo. Nei protocolli di cui sopra, i cambiamenti nella composizione perfusato necessario cambiamento di micropipette. Un approccio alternativo è di riempire la micropipetta in situ utilizzando un'apparecchiatura di riempimento. Questa procedura è stata realizzata come descritto in dettaglio ^37. La limitazione è che il tempo per cambiare la composizione del perfusato nella pipetta non è veloce come ottenuto mediante sostituzione pipetta, ma il procedimento è particolarmente utile se è necessario un microvasi perfusione per periodi di tempo prolungati.

Lo stesso microperfusione avvicinato può essere estesa per misurare i coefficienti di permeabilità per etichettato fluorescente soluto ^31,38-40. In questo caso l'unica micropipetta canna viene sostituito da un doppio canna (theta) pipetta ⁴¹ ed il vaso è perfusoalternativamente con il soluto di prova fluorescente per misurare tessuto accumulo rispetto al lumen contenuti, e lo stesso perfusato senza soluto fluorescente per cancellare il tessuto e consentono misurazioni ripetute di accumulazione soluto. Quando misurazioni di flussi di acqua transvascular devono essere combinati con le misurazioni di soluto coefficiente di permeabilità utilizzando soluti prova fluorescente, indicatori fluorescenti di composizione intracellulare, o confocale di componenti cellulari, è necessario un più sofisticato microscopio a fluorescenza computer controllato. Da queste indagini richiedono solitamente lenti con maggiore ingrandimento e la distanza di lavoro molto più breve, il pilastro di quarzo utilizzato per contenere mesentere è sostituito da un vetrino di vetro incollato su un supporto di plexiglas all'interno del tessuto e sul vassoio microscopio. La maggiore disponibilità di stampanti 3D, permetterà la produzione di alta precisione di vassoi personalizzati, che soddisfano la tolleranza stretta necessaria per posizionare più grande diametelenti r con breve distanza di lavoro rispetto al microvasi selezionati.

La disponibilità di microvasi utilizzabili nel mesentere varia con l'età, il sesso, e la tensione. Pertanto, le scelte di ceppo di ratto e l'uso di maschio o femmina dipende dalle domande specifiche affrontati. Per molti dei nostri studi recenti abbiamo utilizzato ratti maschi Sprague-Dawley, che sono acclimatati nel nostro stabulario almeno una settimana prima dell'uso a circa all'età di 3-4 mesi e in quel momento si trovano in genere hanno a disposizione lunghe, diritte microvasi mesenterica. Al contrario, i nostri colleghi hanno usato con successo femminile ratti Sprague-Dawley di 2-3 mesi ¹³ di età.

Il ruolo dei globuli rossi. Il ruolo principale dei globuli rossi come descritto sopra è stato quello di tracciare transvascular movimento dell'acqua assumendo la cellula ha agito come inerte, neutro indicatori galleggianti d'acqua scorre dopo i microvasi sono stati occlusi. Oltre a questo ruolo fondamentale,è ora riconosciuto che le cellule rosse contribuiscono alla stabilità della barriera fornendo S1P al perfusato quando albumina nel presente ^31,42,43. Ci sono diverse importanti implicazioni di queste osservazioni. In assenza di globuli rossi o con l'uso di marcatori alternativi flusso inerte la permeabilità basale è probabilmente meno stabile. Si raccomanda che le misure di S1P devono essere effettuate in tutti perfusates utilizzati negli esperimenti microperfusione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL44485 e HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

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Biologia Molecolare Numero 103 microperfusione ratto mesentere conducibilità idraulica permeabilità tecnica Landis