Mikroperfusionskammarens Teknik för att undersöka Reglering av mikrokärls permeabilitet i Rat krös

Abstract

Experiment för att mäta permeabilitetsegenskaper av individuellt perfuserade mikrokärl ger en brygga mellan utredning av molekylära och cellulära mekanismer som reglerar vaskulär permeabilitet i odlade endotelceller cellmonoskikt och funktionella valuta egenskaperna hos hela mikrovaskulära sängar. En metod för att cannulate och BEGJUTA venular mikrokärl av råtta tarmkäxet och mäta den hydrauliska konduktiviteten hos microvessel väggen beskrivs. De viktigaste utrustning som behövs innefattar en intravital mikroskop med en stor modifierad scen som stöder mikromanipulatorer att placera tre olika mikroverktyg: (1) en avfasad glasmikropipett att kanylera och BEGJUTA mikrokärls; (2) en glasmikro ockluderingsanordning att övergående blockera perfusion och möjliggöra mätning av transvaskulär vattenflöde rörelse vid en uppmätt hydrostatiskt tryck, och (3) en trubbig glasstav för att stabilisera den mesenteriala vävnaden vid stället för kanylering. Den modifierade Landis mikro-ocklusion technique använder röda blodkroppar suspenderade i den konstgjorda perfusatet som markörer för transvaskulär vätska rörelse, och även möjliggör upprepade mätningar av dessa flöden som experimentella betingelser förändras och hydrostatisk och kolloidosmotiskt tryckskillnad över de mikrokärl är noggrant kontrollerade. Mätningar av hydraulisk konduktivitet först med hjälp av en kontroll perfusat, sedan efter återkanyle av samma mikrokärls med test perfusat möjliggör parade jämförelser av mikrokärls respons under dessa väl kontrollerade förhållanden. Försök att utvidga metoden till mikrokärl i tarmkäx från möss med genetiska modifieringar förväntas ändra kärlpermeabilitet var starkt begränsad på grund av avsaknaden av långa raka och ogrenade mikrokärl i musen tarmkäxet, men den senaste tillgången på råttorna med liknande genetiska modifieringar med hjälp av den crispr / Cas9 tekniken förväntas öppna nya områden för utredning där de metoder som beskrivs häri kan tillämpas.

Introduction

Microperfusion i kärlsystemet innebär fastställande kontrollerat flöde av en artificiell perfusatet med känd sammansättning via en mikropipett i ett blodkärl vanligen mindre än 40 pm i diameter. Den perfusion fartyget ligger inom dess normal vävnad miljö och perfusion med djurets blod fram till tidpunkten för kanyle. När den används tillsammans med ett område av video avbildning eller fluorometriska metoder in situ microperfusion möjliggör mätning av vatten och lösta strömmar över väggarna av mikrokärl under betingelser där de drivande krafterna för dessa flöden är kända och de permeabilitetsegenskaper hos kärlväggen kan direkt utvärderas. Vidare, genom att styra sammansättningen av vätskan som omger mikrokärls i vävnaden (perfusat och superfusate), reglering av mikrokärls permeabilitet och utbyte kan undersökas genom att endotelcellerna bildar mikrokärlsväggen att utsättas för en mängd olika experimental förhållanden (agonister, modifierade perfusion, fluorescerande indikatorer för att mäta intracellulära sammansättning och signalering) för att exakt uppmätta tidsperioder (sek till hr). Dessutom kan ultra eller cytokemiska utvärderingar av viktiga cellulära molekylära strukturer som reglerar barriären undersökas i samma mikrokärl där permeabilitet är direkt mäts. Tillvägagångssättet bildar därmed en brygga mellan utredning av de cellulära och molekylära mekanismer för att modifiera endothelial barriärfunktion i odlade endotelceller cellmonoskikt och utredning i intakta mikrokärl. Se följande recensioner för vidare utvärdering ^1-6.

En begränsning av microperfusion är att det kan endast användas i mikrovaskulära sängar som är tunn, genomskinlig och har tillräcklig strukturell integritet för att möjliggöra kanyle med ett glas mikropipett. Medan tidiga undersökningar används groda mikrokärl i tarmkäxet och tunna kutan pectoris muscle ^7,8, den i särklass mest använda preparatet i däggdjursmodeller är råtta tarmkäxet ^9-15. De flesta undersökningar har fokuserat på akuta förändringar i vaskulär permeabilitet studerades under perioder av 1-4 timmar, men senare undersökningar har utökats till mätningar på enskilda fartyg 24-72 timmar efter en initial perfusion ^12,16. Den nyutvecklade crispr teknik, som lovar att göra mer genetiskt modifierade råttmodeller för att studera vaskulär permeabilitet reglering ¹⁷ bör möjliggöra de metoder som beskrivs i detta meddelande som skall tillämpas i venular mikrokärl i tarmkäxet i dessa viktiga nya råttmodeller.

Metoden kräver ett inverterat mikroskop utrustad med en specialbyggd mikroskop skede stor nog att rymma både djuret preparatet och minst tre mikromanipulatorer används för att positionsmikroverktyg nära perfusion fartyget och att anpassa en perfusion mikropipett med fartygetlumen. Exempelvis en anpassad plattform för en xy mikroskop skede (ca 90 x 60 cm) kan tillverkas av en 1 cm tjock stålplåt med en rostskyddad beläggning. Scenen är fäst vid en ingenjörsindextabell eller två dove-tail glas monterade i rät vinkel och uppburna på Teflon pelare eller boll överföringar för rörelse i horisontalplanet. En typisk rigg (se figur 2) har mycket gemensamt med mikroskop och mikropositioneringsutrustning som används för en rad intravital mikrocirkulation experiment såsom de att mäta enda kärl blodflödet och hematokrit, lokal syretillförseln genom blod perfusion mikrokärl, reglering av vaskulär glatt muskeltonus, och den lokala mikrovaskulära ansamling av fluorescerande spårämnen injiceras i hela cirkulationen. ^18-26

Den grundläggande aspekten av tekniken är mätning av volymflödet (J _v) över en definierad yta (S) i microvessel väggen. Att uppnådetta via den modifierade Landis tekniken beskriven häri en enkel inverterat mikroskop är tillräckligt. En liten videokamera är monterad på bildporten och videosignalen, med ett tillsatt tidsbas, visas på en videomonitor och registreras antingen i digital form på en dator eller som en digital eller analog signal på en videobandspelare. När väl mikrokärlskanyleras den del av mikrokärls synlig för kameran kan ändras genom att flytta scenen och manipulatorer som en enhet utan att störa kanyler.

Mätning av transvaskulär flöden kan också kombineras med mer detaljerade undersökningar med hjälp av en sofistikerad fluorescensmikroskop med lämpliga filter som riggar används för mätning av lösta ämnen permeabilitet, fluorescerande förhållande övervakning av cytoplasmiskt kalcium eller andra cellulära mekanismer, och konfokal avbildning ^{6,12,13, 27.} En viktig fördel med alla microperfusion metoder är förmågan att göra upprepade mätningar på samma fartygUnder kontrollerad förändring av drivkraft som hydrostatiska och onkotiska tryck, eller inducerade förändringar i fartygs svar på inflammatoriska tillstånd. Den vanligaste konstruktionen är en parad jämförelse av uppmätt hydraulisk konduktivitet (L _p) på samma fartyg med fartyget först perfusion via en mikropipett fylld med en styr perfusat och den röda cellsuspensionen för att etablera en baslinje permeabilitet stat, med en andra pipett med testmedlet till perfusatet. Flera kanyle är möjligt med cykeln upprepas efter reperfusion med kontroll pipett.

Föreliggande protokoll visar kanyler och mikroperfusionskammaren av en venular kärl i rått tarmkäxet att registrera vatten flöden över mikrokärlsväggen och mäta _Lp av kärlväggen, ett användbart index på permeabiliteten av den gemensamma vägen för vatten och lösta ämnen tvärs den intakta endotelial barriär. Förfarandet kallas den modifierade Landis technique eftersom den ursprungliga Landis principen att använda den relativa rörelsen av röda celler som ett mått på transvaskulär vätskeutbytet efter perfusionen är blockerad bevaras ^28, men området av experimentella betingelser (t.ex., de hydrostatiska och albumin onkotiska tryckskillnader över hela mikrokärlsväggen) tillgänglig efter microperfusion är mycket större än i uncannulated blod perfusion mikrokärl ^8,29.

Protocol

Etik uttalande: Alla förfaranden har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Inledande Tillverkning av mikropipetter, rörelsehindrande och blockering

1. Dra flera rena borosilikatglas kapillärrör i halv användning av en elektronisk avdragare justeras så att, när den dras, är den sträckta delen av röret ungefär en cm i längd och de två halvorna är något symmetrisk. Se till att avsmalningen är förenlig med måtten i figur 1. Använd båda halvor för mikropipetter, rörelsehindrande och blockerare.
   1. Bevel mikropipetter med hjälp av en luftdriven slipskivan ³⁰ med 0,5 um slippapper badade med vatten. Ställa in vinkeln på mikropipett hållaren så att det är cirka 30 grader från horisontalen.
   2. Tvätta och torka mikropipetter med användning av sugning för att dra ren aceton genom spetsen och upp axeln. Inspektera mikropipetter (Figur 1A) med en liten upprätt mikroskop med 4 × och 40 × mål försedda med krokodilklämma mikropipett hållare och ett okular hårkors.
   3. Välj mikropipetter med spets öppning ca 50 um lång med en avfasning vars längd / bredd förhållandet är mellan 3,1 och 3,5 och med en kraftigt avsmalnande spets som hjälper penetrera tuffa kollagenfibrer i tarmkäxet.
   4. Lagra 15-20 mikropipetter med något varierande storlek i en dammfri box.
2. Gör rörelsehindrande anordningar som använder drog kapillärrör framställda i steg 1.1). Håll en drog glaskapillärrör kort nära en MICROFLAM att bilda en trubbig ände (Figur 1B). Lagra flera i en dammfri låda.
3. Gör microoccluders använder drog kapillärrör framställda i steg 1.1). Håll en drog kapillärrör under MICROFLAM och böjer försiktigt (med hjälp av en slang adapter, t ex., 23G) den fin spets (ca 4 mm från spets) för att göra en vinkel på nära 120 grader mot axeln (

2. Animal Förberedelser och kirurgi

1. Söva hane (350-450 g) eller Sprague-Dawley-råttor (200-300 g) med pentobarbitalnatrium (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) via subkutan injektion; skydda tarmkäxet genom att inte använda intraperitoneal injektion.
2. Under hela kirurgiska ingrepp och experimentella protokoll, upprätthålla anestesi genom kompletterande injektioner (30 mg / kg) som behövs. Bestäm djup anestesi genom tå nypa eller hornhinnan reflex. Efter slutförandet av den experimentella proceduren, euthanize råttan via pentobarbital överdos eller intra-hjärt injektion av mättad kaliumklorid under narkos.

3. Förbered Solutions och Erytrocyter för användning som Flow Markers

1. Förbered däggdjurs Ringers lösning för superfusate och kontroll perfusat lösning (typiskt däggdjur Ringers lösning innehållande 10 mg / ml fettsyrafri bovinserumalbumin, BSA).
   1. Filter perfusat genom 0,2 fim sprutfilter för att avlägsna små partiklar som kan blockera mikropipett spets; filter i små ren behållare.
2. Förbered erytrocyter genom att rita ca 0,2 ml blod från svansvenen hos anestetiserad råtta i en 20G nål på en liten spruta innehållande 0,05 ml heparin (1000 U / ml) och överför till en 15 ml centrifugrör innehållande ca 14 ml däggdjurs Ringers lösning lösning .
   1. Centrifug att försiktigt packa röda blodkroppar (om max 200 x g under 7 min). Tappa av supernatanten och återsuspendera de röda blodkropparna i Ringers lösning.
   2. Efter centrifugering och avlägsnande supernatant tre gånger lämnar de packade röda blodkroppar i botten av röret för senare användning. Observera att detta förfarande minskar blodplättar i slut perfusat till mindre än 0,1% av normala nivåer ^31.

4. Placera Tissue på AnimalBricka

1. Raka buk bedövad råtta underifrån naveln till xiphoid process. Se till att det rakade området sträcker sig runt den högra sidan (till råtta placeras på höger sida), så att håret inte bildar en veke för att dra superfusate ur vävnaden väl. Ta bort skära hår med en fuktad kompress eller vävnad.
   1. Håll huden med en trubbig sågtandade pincett och göra en centrumlinjesnitt (2-3 cm lång) genom huden med hjälp av en robust sax. Med en fin (iris) sax göra en liknande snitt genom linea alba, lyfta bukväggen med räfflade pincett för att undvika skador på tarmen.
   2. Med djuret på sin sida på djuret facket försiktigt dra ut tarmen från bukhålan med hjälp av bomullspinne applikatorer (trä stick) indränkt i Ringers lösning och trubbiga sågtandade pincett. Ordna tarmen i vävnaden väl så att tarmkäxet är draperad över pelaren för visning genom mikroskop noga med att undvika att röra tarmkäxet (potentially skada mikrokärl) med antingen pincett eller bomull.
      Obs: Djuret facket (figur 2A) kan konstrueras från plexiglas och kräver en vävnad väl (ca 3 mm djup), en optiskt klar pelare (t.ex. polerad kvarts ca 2 cm dia och 5 mm hög.), Och en värmande dyna justeras för att bibehålla djurets temperatur. Tjockleken på pelaren får inte överstiga arbetsavståndet av målet.
2. Placera djuret facket på mikroskop scenen så att tarmkäxet är synlig genom okularen.
3. Placera en gravitationsmatad dropplinjen att kontinuerligt superfuse krös med däggdjurs Ringers lösning hölls vid 35-37 ° C. Använd gaskuddar för att hålla tarmen på plats, bidra till att bibehålla fukt och uppsuga överskottet Ringers lösning från ytan. Justera flödet och aspirera utflödet att upprätthålla en konsekvent superfusate tjocklek.
4. Identifiera målgrupp venular mikrokärl, som ärogrenade segment nedströms konvergerande flöde, en eller två grenar distalt sanna kapillärerna. Hitta en ogrenad kärl (helst 600 till 1000 um i längd) med rask blodflöde och fria från vita blodkroppar fastnar på kärlväggen.
5. Placera testmikrokärl i mitten av mikroskopfält och flytta rainer i läge nära den valda kanylestället.

5. Fyll Mikropipett och Mount i Holder

1. Strax före kanyle, upphäva de röda blodkropparna i perfusatet. Lägg 7 il packade röda blodkroppar till 0,5 ml perfusat i en ren borsilikat provrör. Obs: Hematokrit på 1-3% kan användas, men konsekvent hematokrit kommer att leda till enhetliga perfusionsvätskan koncentrationer av ämnen som frigörs från de röda blodkropparna.
2. Montera en 1 ml spruta med en 23G slangadapter och PE 50 slang (5-15 cm längd). Rita perfusatet / röd cellblandningen in i sprutan. Vänd sprutan för att blanda och utvisa alla bubblor från slangar ochadapter. För ökad effektivitet, passar slang till flera sprutor före försöket startar och hålla dem i en dammfri låda eller plastpåse.
3. Fyll mikropipett genom att flytta fram slangen i den stora änden av mikropipett tills den ligger an mot det avsmalnande området. Applicera en mild snabbt tryck på sprutkolven för att fylla mikropipett spetsen. Obs: En liten ström eller droppe bör vara synlig på tips till bevis fullständig fyllning.
4. Dra slangen medan försiktigt trycka på kolven för att fylla större delen av mikropipett axeln. Ta bort små bubblor i den breda axeln genom att försiktigt vicka mikropipetten axeln. Obs: Ett liknande förfarande har illustrerats ^32.
5. Placera mikropipett i en pipett hållare med en sidoport som medger en kontinuerlig fluidanslutning till en vattenmanometer. Se till att innehavaren, som är fäst vid en hydraulisk driv används för att styra mycket fin frammatning av mikropipett, är i en liten vinkel (15-25 °)mot horisontalplanet så att kanten på mikropipett avsmalning inte träffar tarmen eller facket.
6. Montera den hydrauliska enheten på en rörlig mikromanipulator, som har x, y och z-enheter för att möjliggöra nära anpassning till testkärlet (Figur 2).
7. Justera det hydrostatiska tryck som appliceras på fluiden i mikropipetten med användning av en spruta eller vattenfylld gummi glödlampa att ändra höjden av vätska i vattenmassan av manometern till ca 40 cmH ₂ O ovan tarmkäxet.
8. Kanylera mikrokärls så snart som möjligt efter fyllning av pipetten; röda blodkroppar sedimenterar till botten av pipetten, så att efter ca 40 minuter mycket få röda celler kommer att strömma in i kärlet.

6. Microcannulation och Microvascular Tryckmätning

1. Innan du placerar fyllda mikropipett under mikroskop, tryck försiktigt som hindrar på vävnaden nära microvessel applicera tillräcklig kraft för att gripa vävnaden. Ritarainer tillbaka, något sträckning vävnaden i linje med den mikrokärls så att spänningarna i de mesenteriala kollagenfibrerna är i linje med kärlet.
   1. Rikta in mikropipett med fartyget och sänk den i sikte genom okularen. Placera toppen just uppströms den valda kanylestället och sänka den på vävnaden, så att den partiellt hindrar flöde i kärlet, men inte ockludera den.
2. Kanylera kärlet genom drivning pipettspetsen långsamt i kärllumen med hjälp av hydrauliska driv. Var noga med att inte driva igenom den nedre sidan av fartyget.
   Anmärkning: Som mikropipett kommer in i hålrummet, perfusatet tvättar snabbt blodet i kärlet ut ur lumen och perfusatet fritt strömmar in i djurets cirkulations distalt testmikrokärl, förskjuta en del av den normala blodperfusionen i kärlen nedströms.
3. Sänk perfusionstrycket genom att justera manometern tills blodet (vilket indikerasgenom djurets röda blodkroppar) dras tillbaka in i perfunderade segmentet; detta bestämmer tryckbalansen där de röda blodkropparna oscillera försiktigt i kärllumen och mäter hydrostatiska mikrokärlstryck _(Pc) vid den distala änden av mikrokärlssegmentet. Behåll fartyg perfusion vid alla tryck över denna balans tryck.

7. Microocclusion och insamling av data

1. Valfritt steg: Innan du använder mikrotillslutningsanordningen för att blockera fartyget, tryck in i vävnaden i ett icke-använt området tarmkäxet långt ifrån alla fartyg så att spetsen ackumulerar en fin dyna av vävnad som skyddar den experimentella fartyg under upprepad mikro- ocklusioner.
2. Placera blockerare ovanför den perfunderade kärlet nära den nedre kanten av mikroskopfält.
3. Anteckna följande med video och ljud.
   1. Verbalt registrera platsen för blockadstället och den nedre skärmkanten som kan ses på okularet hårkorset.
   2. Med spetsenav blockerare placeras strax ovanför mikrokärls använder fina z kontroll av mikromanipulator för att försiktigt sänka blockeraren tills flödet i kärlet är tilltäppt. Notera manometer trycket _(Pc) på ljud. Ansök ocklusion typiskt för 3-10 sekunder, och släpp sedan, åter gratis perfusion. Flytta blocket webbplats upp kärlet mot pipettspetsen i 5-10 um steg baserade på tid (> 5 min efter initial blocket på en plats), antal ocklusioner (3-5), för att förhindra kärlväggen skador på blocket platsen .

8. Analys av data och mätning av L _p (Vattenpermeabilitet)

1. Under videouppspelning, kontrollera den initiala avståndet (ℓ ₀₎ från en markör av röda blodkroppar till tilltäppningsplatsen med hjälp av en bild av en scen mikrometer och kända positioner på bilderna. Bestäm utgångshastigheten (dl / dt) av markör cellen från sin position i flera ramar under 3-10 sekunder inspelade bilder. Detergruvan fartyget radie (r) från bilder tagna under ocklusion (Figur 3).
2. Beräkna J _{v /} S för varje ocklusion som (dl / dt) x (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Beräkna _Lp vid ett konstant tryck som (J _{V / s)} dividerat med drivtrycket (mikrokärlstryck - effektiv kolloidosmotiskt tryck; se diskussion).

Representative Results

Figur 4 visar resultaten från mätning av tidsförloppet av förändringar i L _p i en råtta venular mikrokärls kanyl successivt med fyra perfusat. ³³ Storleken av L _p beräknas vid en konstant tryck användes som ett mått på förändringar i microvessel vägg permeabilitet, först i kontroll tillstånd med en perfusat innehållande 1% bovinserumalbumin sedan när fartyget utsattes för inflammatoriska medlet bradykinin (Bk) med en andra mikropipett innehållande 10 nM Bk. Bradykinin orsakade en övergående ökning av L _p som återvände till kontrollvärdet över den efterföljande 10-15 min. Kärlet sedan åter perfusion med styr perfusat i 30 minuter för att återupprätta en stabil baslinje. När mikrokärl perfunderades med hjälp av en fjärde mikropipett med samma koncentration av Bk samt 1 iM sfingosin-1-fosfat (S1P) i perfusatet, var svaret på Bk betydligt försvagad. Graden avdämpning när Bk och S1P perfunderades samtidigt befanns vara liknande den som mäts i andra experiment där S1P sattes till perfusatet upp till 20 minuter före exponering för Bk. Dessa resultat visar kraften i att kunna göra flera mätningar av L _p på ett enda kärl, och visar att verkan av ett medel såsom S1P att stabilisera kärlväggen i närvaro av en inflammatoriskt medel kan lösas på tidsperioder på i storleksordningen några få sekunder. I separata kärl kontrollstudier utfördes med ett liknande protokoll i frånvaro av S1P att visa att dämpningen av Bk svar inte berodde på anafylaxi.

För vissa experimentella konstruktioner är det viktigt att uppskatta både löst ämne reflektionskoefficienten för en makromolekyl (σ) och _Lp. Detta åstadkommes bäst genom att mäta J _{v vid} flera tryck på varje enskild mikrokärls. Figur 5 visar ett experiment in som både _Lp och den effektiva onkotiskt tryck av 5% albumin i perfusatet (π _albumin = 27 cmH ₂ O vid 37 ° C) uppskattades under förhållanden när det fanns ingen albumin i vävnaden som omger råtta mikrokärls. I dessa experiment J _{v /} S mättes vid tre olika tryck. L _{p är} lutningen hos förhållandet mellan J _{v /} S och tryck, och skärningen på tryckaxeln är den effektiva skillnaden onkotiska trycket tvärs över kärlväggen (σΔπ).

Figur 1. Mikro för perfusion av enskilda mikrokärl. (A) En mikropipett för kanylering av råttmikrokärl med en avfasad spets. (B) fixerings för att hålla tarmkäxet vävnaden stabil nära platsen för kanyler. (C) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Intravital rigg för microperfusion. (A) Överblick av djur bricka med mikromanipulatorer och mikroverktyg orienterade över glaspelare. (B) Stor metall skede monterad på verkstadsbordet och stödlager. (C) bedövades råttan med mikroverktyg i läge microperfusion av en microvessel. (D) Motivet verkar närmare av tarmkäxet under ett experiment. Klicka här för att se en större version av denna Figu re.

Figur 3. Mätning av filtrationshastigheten per ytenhet med hjälp av modifierade Landis teknik. Denna schematiska visar en enda mikrokärls kanyl med en mikropipett och en ockluderande stång placerad över fartyget. Omedelbart efter tillsluta mikrokärls, avståndet (ℓ ₀₎ mellan markören RBC reser på centrumlinjen för ockluderade mikrokärls och tilltäppningsplatsen registreras så att cell bana kan följas under 5-10 s efter ocklusion. Den initiala positionen (ℓ ₀₎ och utgångshastigheten (dl / dt) av cellen används för att beräkna den genomsnittliga filtreringshastigheten per enhetsarea av mikrokärlsväggen mellan markörcellen och platsen för ocklusion. Den microoccluder höjs sedan och gratis perfusion etablerade innan ytterligare mätningar görs.com / filer / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Representativa data visar att sfingosin-1-fosfat (S1P) hämning agerar mycket snabbt bradykinin (BK; 10 nM). Orsakade en övergående ökning av mikrokärls _Lp. S1P tillämpas samtidigt med andra bradykinin (BK) testet inhiberade akut Bk svar i förhållande till första Bk. Dessa data visar att tiden för exponering för ett testmedel kan modifieras för att utvärdera kinetiken för aktivering av en hämmande respons. Specifikt S1P tillämpade samtidigt endast med Bk inhiberade starkt Bk svar. S1P var en iM och Bk var 10 nM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Mätning av J _{v /} S vid flera tryck möjliggör både _Lp och den effektiva onkotiskt tryck som skall mätas. Den filtreringsflödet, J _{V / s,} uppmättes i detta kärl vid olika mikrokärlshydrostatiska tryck under perfusionen med BSA (50 mg ml ^{- 1,} π = 27 cmH ₂ O), medan tarmkäxet badades med proteinfritt Ringers lösning. Lutningen av förhållandet mellan J _{v /} S och tryck är L _{p och} skärningen på tryckaxeln anger det effektiva skillnaden onkotiska trycket tvärs över kärlväggen. I detta experiment var den Lp 1,2 x 10 ^-7 (cm sek ^-1 cmH ₂ O ^-1) och σΔπ var 24 cmH ₂ O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Uppgifter om L _s beräkningar. Även transvaskulär vätska rörelse uppstår när fartyget är fritt perfusion, är sådant utbyte alldeles för liten för att mätas vid fri perfusion eftersom det är typiskt mindre än 0,01% av fartygets perfusionshastigheten. När emellertid perfusion transient stoppas genom ockluderar mikrokärls, transvaskulär flöde (dvs filtrering) mäts från förflyttning av markör röda celler i lumen som kolonnen av vätska mellan en markör av röda celler och platsen för ocklusionen förkortar såsom visas i Figur 3. Beroende på komplexiteten och längden på försöksprotokollet en ogrenad kärl 600 till 1000 um i längd behövs.

När fartyget inte är tilltäppt och manometer trycket driver flödet genom mikrokärls, är tryckfallet över pipettspetsen stora så att mikrokärlstryck under fri perfusionen är endast ett typisktfåtal cmH ₂ 0 ovanför nedströmstrycket. Däremot vid en ocklusion tryckfallet över pipetten är mycket liten på grund av vätske långsamt kommer in i kärllumen för att ersätta fluidfiltrering över kärlväggen. Således under ocklusion det hydrostatiska trycket i kärl lumen (P _c) lika stor som fastställts av manometern. Det onkotiska trycket i mesenteriala vävnaden är försumbar, så omedelbart efter ocklusion är transvaskulär flytande rörelser från markör röda celler mätt där det hydrostatiska trycket är känd och onkotiskt trycket i kärlet lumen är lika med den som fastställs i perfusatet. Med successiva mätningar av L _p, är fartygets längd förlorat varje gång blocket platsen är avancerad. Dessutom minskar successivt recannulation tillgängliga fartygets längd.

Den transvaskulär vätskeflöde per ytenhet av kärlväggen (J _{v /} S) beräknas från den kurs som en uppmätt längd av kolonnen av vatten i microvEssel lumen mellan en markör röda blodkroppar och tilltäppningsplatsen antingen förkortar (netto filtrering) eller förlänger (nettoåterupptag). Antagandet är att neutral flytkraft röda celler som rör sig längs mittlinjen av kärllumen kan användas för att spåra medelhastigheten av vattenpelaren som omger cellen (förhållandet mellan röda blodkroppar hastighet till vattnets medelhastigheten är nära 1,8 för en 6 ^ m röda blodkroppar i ett kärl 30 | im diameter). ^8,14 Om sålunda hastigheten hos en markörcell (i ^ m / sek) mot blockeraren är V ^ m / s under de första 2-5 sek efter ocklusion, och kärlet radien är r, är volymen av vätska filtreras över microvessel väggen mellan den röda blodkroppar och platsen för ocklusion (J _v) πr ² V im ³ / sek förutsatt att microvessel är cylindriska. Vidare området för en cylindrisk mikrokärls (S) mellan denna markörcell och tilltäppningsplatsen är 2πrℓ, där ℓ är den initiala avståndet mellan markörcellenoch tilltäppningsplatsen. Sålunda skall genomsnitts initiala transvaskulär flödet per ytenhet (J _{V / s)} vid det tryck som anges av vattenmanometer Vr / (2ℓ).

Den enklaste uppskattningen av kärl _Lp görs om det onkotiska trycket av perfusatet har satts låg i förhållande till mikrokärlstryck (typiskt 3,6 cmH ₂ O, det onkotiska trycket av bovint serumalbumin vid en koncentration av 10 mg / ml och en kapillär tryck som är större än 30 cmH ₂ O). L _p beräknas som (J _{v /} S) / (P _c -3) cm / sek / cm _H2O eftersom albuminreflektionskoefficienten (σ _albumin) i styr staten är nära 0,9. Med detta tillvägagångssätt snabba förändringar i _Lp med en tidsupplösning av storleksordningen en minut kan mätas genom att fastställa fritt flöde mellan successiva åtgärder om J _{v /} S vid konstant tryck, såsom visas i de representativa resultaten i figur 4. Detta tillvägagångssätt IGNores små förändringar i onkotiska trycket av albumin som faller till mindre än 1 cmH ₂ O när reflektionskoefficienten faller under 0,5, men felet i uppskattningen av L _p fortfarande mindre än 5% när P _c är större än 30 cmH ₂ O .

När det krävs noggrann mätning av både L _p och reflektionskoefficienten, J _{v /} S mäts vid en serie av mikrokärlstryck under den förväntade onkotiska trycket av testmakromolekyl. Lutningen av förhållandet mellan J _{v /} S och tryckåtgärder L _p och skärningen på tryckaxeln när nettoflöde är noll åtgärder σπ (Figur 5). Demonstrationen att Jv är linjärt relaterad till trycket är också en viktig validering av användningen av enhetstryckmätningar med hjälp av enklare protokollet beskrivet ovan (fig 4) när det onkotiska tryckskillnaden är låg i förhållande till hydrostatiskt tryckURE.

Möjliga felkällor. Det finns flera problem som komprometterar korrekt mätning. Underlåtenhet att korrekt ockludera kärlet eller skada på kärlväggen vid tilltäppningsplatsen resulterar i vätskeläckage förbi tilltäppningsplatsen, och förflyttning av markörceller mot tilltäppningsplatsen snabbare än på grund av transvaskulär utbyte. Medan markörceller röra sig normalt långsamt mot tilltäppningsplatsen, men inte nå den, är en läcka anges om markerings celler spåra hela vägen till tillslutningen. Å andra sidan, för att inte försluta pipetten in i mikrokärls lumen vid kanyle plats resulterar i underskattning av J _{v /} S. Vätskeläckage från pipetten till superfusate eller till kärllumen uppströms kanyler webbplats orsakar en signifikant tryckfall över pipettspetsen. En sådan läcka upptäcks när celler i mikropipett spetsen flödet vid en högre hastighet än i nedströms kärlet lumän av det tillslutna kärlet. Noggrann ompositionering av mikropipett tätar vanligtvis en sådan läcka. En annan fråga uppstår om _Lp av kärlväggen inte är enhetlig, vanligen med ett eller flera ställen av lokala skador eller inflammation. Marker celler spåra till platsen om de flesta transvaskulär flöde koncentreras där. Röda blodkroppar rörelse mäter fortfarande transvaskulär flöde, men åtgärden J _{v /} S är inte representativt för det mesta av väggområdet i testsegmentet.

Betydelsen av metoden med hänsyn till befintliga metoder. De två vanligaste metoderna för att undersöka regleringen av endotel barriär permeabilitet och transvaskulär utbyte är (1) in vitro mätning av utbyte mellan odlade endotel cellmonoskikt och (2) mätning av spår ackumulering i ett vävnadsprov efter spårämnet injiceras intravenöst i hela djuret. Experiment i odlade endoteliala cellmonoskikt är favored eftersom de cellulära funktioner kan mer direkt modifieras och det finns tillräckligt cellulärt material tillgängligt för detaljerad utvärdering av molekylära händelser i endotelceller. Men under de flesta odlingsbetingelser endotelcellerna brukar inte bilda barriär representativ för vaskulär permeabilitet in vivo. Den modifierade Landis ovan beskrivna tekniken har visat sig vara ett robust och tillförlitlig teknik för att undersöka regleringen av endothelial barriärfunktion i intakta venular mikrokärl. I händerna på en erfaren utredare parade mätningar av permeabilitet under kontroll och testförhållanden där några av de metoder som använts i cellkultur (t.ex. avbildning av cellkomponenter, modifiering av signalvägar) kan tillämpas. Vikten av experiment i intakta mikrokärl har visats genom att visa signifikanta skillnader mellan de mekanismer som reglerar barriär permeabilitet i individuellt perfusion microvessels och de beskrivs ofta i odlade endotelceller monolager. Som exempel kan nämnas svar på skjuvning, trombin exponering och bidrag kontraktila mekanismer för inflammatoriska gap bildning ^2-6,9,16. Mätningar av spår ackumulering i en intakt kärlbädd bevarar mer normal fysiologisk funktion utan direkt undersökning av verkliga förändringar i vaskulär permeabilitet äventyras eftersom spår ackumulering kan öka till följd av ökad perfusion (ökad yta för utbyte) med eller utan en ökning av permeabiliteten av väggen. Således omfattningen av en permeabilitet ökning kan överskattas när vasodilatation ökar antalet perfunderade fartyg och därmed totalt lösta ämnen ackumulering är större än den som på grund av ökad vaskulär permeabilitet enbart ^34.

Framtida tillämpningar. Utbudet av alternativ för att modifiera cellstruktur och funktion på samma villkor som permeabilitet indiskilda fartyg direkt mäts under microperfusion förväntas öka. Dessutom är det förväntas att tillämpningen av metoderna i genetiskt modifierade råtta tarmkäxet kan lösa ett långsiktigt problem som har funnits i genetiskt modifierade möss. Speciellt när genetiskt modifierade möss blev tillgängliga det var väntat att microperfusion skulle kunna utvidgas för att undersöka mikrokärl i sina mesenteriala fartyg. Medan vissa microperfusion experiment har slutförts i mikrokärl från mus tarmkäxet ^35, möss har i allmänhet färre mikrokärl i deras mesenterisk vävnad än råttor, och dessa fartyg är ofta korta och mycket grenade, i motsats till mer lämpliga längre (> 500 nm) raka fartyg som kan hittas i råttor. Således experiment för att undersöka modulering av transvaskulär utbyte i genetiskt möss har förlitat sig på analyser såsom Miles ^{34 eller} tekniskt krävande, men mer tillförlitliga spårämnesförsök som mäterförändringar i både kärl och extravaskulär ansamling av fluorescerande radiomärkta testsonder ^36.

Modifieringar av metoden. I ovanstående protokoll, förändringar i perfusatet sammansättning krävs byte av mikropipetter. Ett alternativt tillvägagångssätt är att fylla på mikropipett in situ med användning av en påfyllningsanordning. Detta förfarande har åstadkommits såsom beskrivits i detalj ^37. Begränsningen är att tiden för att ändra sammansättningen av perfusatet i pipetten är inte lika snabb som uppnås med pipett ersättare, men förfarandet är särskilt användbart om det är nödvändigt att BEGJUTA en mikrokärls under längre tidsperioder.

Samma microperfusion närmade kan utökas för att mäta permeabilitetskoefficienter att fluorescerande lösta ämnet ^31,38-40. I detta fall enda pipa mikropipett ersätts med en dubbelpipig (theta) pipett ⁴¹ och kärlet är perfunderadväxelvis med test fluorescerande löst ämne för att mäta vävnadsackumulering relativt lumen innehåll, och samma perfusatet utan den fluorescerande lösta ämnet att rensa vävnad och tillåta upprepad mätning av löst ämne ackumulering. När mätningar av transvaskulär vattenflöden ska kombineras med mätningar av lösta ämnen permeabilitetskoefficienten använder fluorescerande prov lösta ämnen, fluorescerande indikatorer för intracellulär sammansättning eller konfokal avbildning av cellulära komponenter, är en mer sofistikerad datorstyrda fluorescensmikroskop krävs. Eftersom dessa undersökningar kräver vanligtvis objektiv med högre förstoring och mycket kortare arbetsavstånd, är kvarts pelare används för att hålla tarmkäxet ersättas med en glaskupa slip limmas på en plexiglas stöd i vävnaden väl på mikroskopfacket. Den ökade tillgången på 3-D skrivare, kommer att tillåta hög precision tillverkning av egna brickor, som uppfyller den smala tolerans som krävs för att placera större diameter linser med kortare arbetsavstånd i förhållande till utvalda mikrokärl.

Tillgången till användbara mikrokärl i tarmkäxet varierar med ålder, kön och stam. Därför, varvid val av stam av råtta och användningen av manliga eller kvinnliga kommer att bero på de specifika frågor som ställs. För många av våra nya studier har vi använt Sprague-Dawley som är acklimatiserad i vår djuranläggning minst en vecka före användning på om ålder 3-4 månader då tycker vi att de i allmänhet har tillgängliga långa, raka mesenteriska mikrokärl. Däremot har våra kollegor framgångsrikt använt Sprague-Dawley råttor av 2-3 månader ¹³ ålder.

Rollen för de röda blodkropparna. Den primära roll röda blodkroppar som beskrivits ovan var att spåra transvaskulär vattenrörelse antagande cellen agerade som inert, neutral flytkraft indikatorer för vatten rinner efter mikrokärl var tilltäppt. Utöver denna grundläggande roll, detnu erkänt att de röda blodkropparna bidrar till stabiliteten av barriären genom att tillföra S1P till perfusatet när albumin i nuvarande ^31,42,43. Det finns flera viktiga konsekvenser av dessa observationer. I avsaknad av röda blodkroppar eller med hjälp av alternativa inert flödesmarkörer kommer sannolikt att vara mindre stabil baslinje permeabilitet. Det rekommenderas att mätningar av S1P bör göras i alla perfusat används i microperfusion experiment.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag HL44485 och HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

Molecular Biology mikroperfusionskammarens råtta krös hydraulisk konduktivitet permeabilitet Landis teknik