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Immunology and Infection

एसी-6 फीडर सिस्टम का उपयोग आम लिम्फायड progenitors से Murine Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की इन विट्रो पीढ़ी में

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) मैं संक्रमण के लिए या भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के दौरान जवाब में सक्रिय कर रहे हैं कि (IFN-आई) के उत्पादन की कोशिकाओं इंटरफेरॉन शक्तिशाली प्रकार हैं। दुर्भाग्य से, पीडीसी समारोह के अध्ययन लसीकावत् अंगों में उनके कम आवृत्ति द्वारा रुकावट है, और इन विट्रो डीसी पीढ़ी के लिए मौजूदा तरीकों मुख्य रूप से पीडीसी से अधिक सीडीसी के उत्पादन के पक्ष में। यहाँ हम कुशलतापूर्वक इन विट्रो में आम लसीकावत् पूर्वज (CLPs) से पीडीसी उत्पन्न करने के लिए एक अनूठा तरीका मौजूद है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा से CLPs शुद्ध और FLT3 ligand की उपस्थिति में γ-किरणित एसी 6 फीडर कोशिकाओं के साथ coculturing द्वारा पीडीसी उत्पन्न करने के लिए कैसे विवरण का वर्णन किया। इस संस्कृति प्रणाली की एक अनूठी विशेषता CLPs एसी 6 कोशिकाओं के नीचे की ओर पलायन और cobblestone क्षेत्र कोशिकाओं के गठन, पीडीसी के विस्तार के लिए एक महत्वपूर्ण कदम हो जाते हैं। आकृति विज्ञान अलग डीसी, अर्थात् पीडीसी और सीडीसी, 7 की एक रचना के साथ के बाद लगभग 2 सप्ताह उत्पन्न किया गयाइष्टतम परिस्थितियों में 0-90% पीडीसी। आमतौर पर, इस विधि द्वारा उत्पन्न पीडीसी की संख्या मोटे तौर पर वरीयता प्राप्त CLPs की संख्या का 100 गुना है। इसलिए, इस मजबूती के साथ इन कोशिकाओं के विकास और समारोह में आगे की पढ़ाई की सुविधा के लिए आवश्यक पीडीसी की बड़ी संख्या को उत्पन्न करने के लिए, जिसके साथ एक उपन्यास प्रणाली है।

Introduction

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वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि पेशेवर प्रतिजन कोशिकाओं पेश कर रहे हैं। डीसी विषम हैं, वे मोटे तौर पर दो आबादी में वर्गीकृत किया जा सकता है, पारंपरिक DCS (सीडीसी) और plasmacytoid DCS (पीडीसी) 2,3। लसीकावत् अंगों के अलावा, सीडीसी और पीडीसी भी फेफड़े, आंत, और त्वचा के 2 सहित ऊतकों में पाए जाते हैं। सीडीसी और पीडीसी की आकृति विज्ञान डेन्ड्राइट अनुमानों की तरह और अधिक प्लाज्मा सेल की तरह किया जा रहा है पीडीसी के आकार का प्रदर्शन करते सीडीसी के साथ, अलग है। इसके अलावा, आम माउस डीसी मार्कर, CD11c, अधिक उच्च पीडीसी पर की तुलना में सीडीसी पर व्यक्त की है। पीडीसी 2 की तुलना में MHC वर्ग द्वितीय के उच्च स्तर और costimulatory अणुओं का इजहार, जो दोनों के CD24 + सीडीसी, - सीडीसी और CD11b - इसके अलावा, सीडीसी आगे CD11b + CD24 में विभाजित किया जा सकता है। परिपक्व पीडीसी, दूसरे हाथ पर, चुनिंदा Siglec-एच और BST2 4 व्यक्त करने के लिए दिखाया गया है। एफunctionally, सीडीसी पीडीसी रहे हैं की तुलना कोशिकाओं पेश बेहतर प्रतिजन होते हैं; हालांकि, पीडीसी मैं वायरस के संक्रमण या सूजन उत्तेजना 5 पर इंटरफेरॉन प्रकार का एक विशाल राशि का उत्पादन कर सकते हैं।

दोनों सीडीसी और पीडीसी अल्पकालिक हैं, और इसलिए, लगातार अस्थि मज्जा (बीएम) 6.7 भीतर पूर्वज से मंगाया जाना चाहिए। घातक विकिरणित चूहों में आम माइलॉयड पूर्वज (CMPs) और आम लसीकावत् पूर्वज (CLPs) के दत्तक हस्तांतरण सीडीसी और पीडीसी दोनों प्रजातियों 8-10 से उत्पन्न हो सकता है कि यह दर्शाता है। हालांकि, RAG1 / 2 को व्यक्त करने और IGH ठिकाना 11,12 पर पुन: व्यवस्थित डीजे खंडों के अधिकारी है कि पीडीसी के एक सबसेट है। इन कोशिकाओं को भी B220 मार्कर की अभिव्यक्ति, न्यूक्लिक एसिड संवेदन रिसेप्टर्स (TLR7 / TLR9), और प्रतिलेखन कारक (Spib और Bcl11a) 13 सहित बी लिम्फोसाइटों, साथ आणविक समानता का हिस्सा है, लसीकावत् वंश के हस्ताक्षर माना जा रहा है सभी सुविधाएँ। इसलिए, सीएलपीक्योंकि वंश समानता के पीडीसी की इन विट्रो पीढ़ी के लिए अच्छा विकल्प हो सकता है।

इंसानों और चूहों में दोनों सीडीसी और पीडीसी की आवृत्ति बहुत कम है, जबकि 6, डीसी, विशेष रूप से सीडीसी (जैसे जीएम- CSF 11,14 या FLT3 ligand के रूप में साइटोकिन्स, की उपस्थिति में बी.एम. या पूर्वज से इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता फ्लोरिडा ) फीडर मुफ्त सिस्टम 11,15,16 के प्रयोग से। दुर्भाग्य से, हालांकि, यह फ्लोरिडा 11,15,16 का उपयोग कर इन विट्रो में पीडीसी की बड़ी संख्या के उत्पादन के लिए संभव नहीं है। पहले हम पीडीसी कुशलता से एसी-6 फीडर सिस्टम 17 का उपयोग कर CLPs से इन विट्रो में उत्पन्न किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया। संस्कृति प्रणाली में एसी-6 stromal सेल लाइन का उपयोग करने का लाभ यह है कि सेल सेल से संपर्क करें और CLPs से पीडीसी की बड़ी संख्या की पीढ़ी का समर्थन करने वाले साइटोकिन्स के स्राव प्रदान करता है। इस प्रणाली के साथ उत्पादन काफी मजबूत है, नीचे वर्णित प्रक्रियाओं से सावधान प्रतिकृति मैं आवश्यक हैn आदेश पीडीसी के कुशल पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए।

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Protocol

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C57BL / 6 प्रकार के जंगली चूहों राष्ट्रीय प्रयोगशाला पशु केंद्र (NLAC), ताइवान से खरीदे गए थे। सभी चूहों नस्ल और विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। प्रोटोकॉल और पशु उपयोग प्रक्रियाओं की समीक्षा की और मेडिसिन के नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय कॉलेज के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (परमिट नंबर: 20120075) द्वारा अनुमोदित किया गया। इसके अलावा, शोधकर्ताओं प्रयोगों प्रदर्शन करते हुए पशुओं में दर्द, पीड़ा, या संकट के लिए क्षमता को कम करने के लिए हर संभव प्रयास किए। दस्ताने पहने हुए वर्णित सभी प्रक्रियाओं आरटी पर किए गए।

एसी-6 फीडर कोशिकाओं के 1. तैयारी

नोट: एसी 6.21 (एसी 6 संक्षेप में) (आई Weissman, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की) stromal सेल लाइन 18 RPMI में बनाए रखा जाना चाहिए 15% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक। फीडर कोशिकाओं के रूप में काम करने के लिए, एसी 6 कोशिकाओं-γ किरणित 3,000 रेड (30Gy) उनके प्रसार को रोकने के लिए सह संस्कृति से पहले एक दिन के साथ हैं। नोट वेंउनके मार्ग संख्या 20 से अधिक है, तो कम से एसी-6 कोशिकाओं रखरखाव के दौरान भीड़ छोड़ दिया तो उनके भेदभाव का समर्थन क्षमता खो देते हैं, या।

  1. धो एसी 6 कोशिकाओं एक बार 1 मिलीलीटर है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के साथ और आकांक्षा द्वारा DPBS हटा दें। एसी-6 37 सी में 3-5 मिनट के लिए 0.8 मिलीलीटर trypsin समाधान (0.05% trypsin और DPBS में 0.5 मिमी EDTA), तो 5% सीओ 2 और साथ कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम के 10 संस्करणों के साथ यह गिराए द्वारा प्रतिक्रिया को रोकने का इलाज एकल कक्ष निलंबन बनाते हैं।
  2. 5.9x10 पर बीज एसी 6 कोशिकाओं 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से में 12 अच्छी तरह प्लेटें और 5%, 37 सी पर सेते सीओ 2 हे / एन।
    नोट: एसी-6 कोशिकाओं के घनत्व सीडीसी पीढ़ी के पक्ष में होगा एक कम घनत्व के रूप में बहुत महत्वपूर्ण है। 5.9x10 के घनत्व पर सीडिंग अच्छी तरह से एसी-6 CLPs से पीडीसी की व्युत्पत्ति के लिए इष्टतम है, जो अगले दिन से confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति देगा / 4 कोशिकाओं।
  3. Γ-irradiator का उपयोग कर 3,000 रेड (30 Gy) में एसी-6 कोशिकाओं चमकाना।
    ध्यान दें: एसी-6 चमकाना के लिए इस्तेमाल किया खुराक proliferating से कोशिकाओं को रोकने और अभी तक CLPs से डीसी के भेदभाव के लिए आवश्यक साइटोकिन्स और सेल सेल संपर्क उपलब्ध कराने के लिए काफी लंबे समय से व्यवहार्य उन्हें रखने के लिए अनुकूलित है।
  4. महाप्राण मध्यम और (10% गर्मी निष्क्रिय FBS, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin और 50 माइक्रोन β-mercaptoethanol साथ RPMI) पूरा RPMI 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।

चूहे से 2. अलग बी.एम. कोशिकाओं

  1. सीओ 2 asphyxiation और ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान। एक विच्छेदन ट्रे पर चूहों प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ बाँझ। मध्य पेट पर एक चीरा और कम extremities कवर त्वचा सहित माउस के बाहर का हिस्सा से त्वचा को हटा दें।
  2. एक अर्द्ध बाँझ हुड में चूहों काटना। फीमर और tibiae जारी करने के लिए, संयुक्त घुटने के नीचे से ऊपर फीमर और tibiae क्लिप। कैंची का उपयोग हड्डियों से मांसपेशियों को अलग करें और RPMI पूरा एमएल 5 युक्त एक 6 सेमी पेट्री डिश में हड्डियों जगह है।
  3. एक बाँझ संस्कृति हुड के लिए ले जाएँ। पूरा RPMI के साथ एक 27G सुई से जुड़ा एक 3 मिलीलीटर सिरिंज भरें। कैंची का उपयोग हड्डियों के दोनों सिरों कट, और धीरे से प्रत्येक के अंत से एक बार पूरा RPMI इंजेक्शन द्वारा हड्डियों के बाहर मज्जा फ्लश करने के लिए 27G सुई डालें।
  4. कोशिकाओं ऊपर और नीचे 3-5 बार सुई के बिना सिरिंज का उपयोग संस्कृति डिश में कोमल pipetting द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें।
  5. 500 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला छानना।
  6. 1 मिलीलीटर एसीके बफर (150 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3, 0.1 मिमी EDTA) 1 मिनट के लिए incubating और पूरा RPMI के 10 संस्करणों के साथ गिराए द्वारा प्रतिक्रिया को रोकने के साथ Lyse लाल रक्त कोशिकाओं। कोशिकाओं गंभीरता से मृत सेल clumps और ऊतक मलबे के नीचे गोली क्रम में 5 मिनट के लिए खड़े करने की अनुमति दें।
    नोट: इस वजह से व्यवहार्य कोशिकाओं के निपटाने के लिए सेल नुकसान होगा के रूप में अधिक से अधिक 5 मिनट खड़ा नहीं है।
  7. एक नया ट्यूब छोड़ने मलबे को धीरे धीरे छानना सेल युक्त सतह पर तैरनेवालामूल ट्यूब में पीछे।
  8. तो, गोली कोशिकाओं को हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए 500 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  9. कुल बी.एम. कोशिकाओं Resuspend FACS बफर (1x पीबीएस + 2% FBS + 1 मिमी EDTA) μl 100 में (आमतौर पर 4-6 10 x 7 बी.एम. कोशिकाओं एक माउस से प्राप्त कर रहे हैं)।

3. FACS विश्लेषण और CLPs की छंटनी

  1. एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के क्रम में 1-2 मिनट के लिए विरोधी CD16 / 32 (हाइब्रिडोमा supernant क्लोन 2.4G2, 50 μl / प्रतिक्रिया या 1-2 माइक्रोग्राम / प्रतिक्रिया) FACS बफर में कोशिकाओं में (2.9 कदम) जोड़ें।
    नोट: विरोधी CD16 / 32 भी granulocytes, monocytes, और बी लिम्फोसाइट्स सहित एफसी रिसेप्टर्स व्यक्त कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी की गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए जोड़ा गया है, जो एफसी ब्लॉक, कहा जाता है।
  2. इसके साथ ही परिवेश प्रकाश से परहेज, बर्फ पर 15 मिनट के लिए (4x10 7 कोशिकाओं के लिए) निम्नलिखित फ्लोरोसेंट रंजक लेबल एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग। एंटीबॉडी: पीई संयुग्मित वंश मार्कर विरोधी CD3 सहित (0.2 माइक्रोग्राम प्रत्येक) (17A2), विरोधी सीडी 8 (53-6.7), विरोधी B220 (RA3-6B2), विरोधी CD19 (eBio1D3), विरोधी CD11b (एम 1/70), विरोधी जीआर 1 (RB6-8C5), विरोधी Thy1.1 (HIS51), विरोधी NK1.1 (PK136), विरोधी TER119 (Ter-119), और विरोधी MHC-द्वितीय (NIMR-4), 0.2 माइक्रोग्राम विरोधी सी-किट-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ग्राम विरोधी Sca-1- FITC (D7), 0.4 माइक्रोग्राम विरोधी एम CSFR एपीसी (AFS98), और 0.2 माइक्रोग्राम विरोधी आईएल 7Rα पीई Cy7 (A7R34)।
  3. 500 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए 3 मिलीलीटर FACS बफर के साथ कोशिकाओं, और सेंट्रीफ्यूज धो लें।
  4. 300 μl FACS में कोशिकाओं को एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से बफर और फिल्टर कोशिकाओं Resuspend।
  5. किसी भी शेष कोशिकाओं को ठीक करने और एक ही सेल झरनी का उपयोग कर ट्यूब छँटाई एक बाँझ FACS में फिल्टर करने के लिए एक अतिरिक्त 100 μl FACS बफर के साथ ट्यूब धो लें।
  6. संकेत का पता लगाने के लिए उपयुक्त फिल्टर और voltages का उपयोग कर धुंधला के बाद तुरंत प्रवाह cytometric विश्लेषण करते हैं। पीई और पीई Cy7-labelded एंटीबॉडी और 633 एनएम लास पता लगाने के लिए 561 एनएम लेजर, FITC-, PerCP-Cy5.5 लेबल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए 488 एनएम लेजर का उपयोग करेंएर एपीसी लेबल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए।
  7. सी-किट पूर्णांक Sca -1 पूर्णांक एम CSFR - - आईएल 7Rα + (3.2 चरण में दाग के रूप में) एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर क्रमबद्ध बाहर CLPs निम्नलिखित मार्करों लिन के अनुसार। एक तकिया के रूप में पूरा RPMI के 8 मिलीग्राम से युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हल कोशिकाओं लीजिए।
  8. चलाने के अंत में सेल सॉर्टर के रूप में दिखाया हल कोशिकाओं की पूर्ण संख्या रिकॉर्ड है। आमतौर पर, 5x10 4 CLPs एक माउस के बीएम से प्राप्त किया जा सकता है।

4. coculture CLPs और एसी-6

  1. , 500 XG पर 10 मिनट के लिए कदम 3.7 से हल कोशिकाओं अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला हटाने और 5x10 4 कोशिकाओं / एमएल के चारों ओर एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए पर्याप्त पूरा RPMI के साथ सेल गोली resuspend। बीज 500 कोशिकाओं / कुएँ में 1.4 चरण में तैयार फीडर कोशिकाओं से युक्त 12 अच्छी तरह से थाली।
  2. जोड़ें 100 एनजी फ्लोरिडा 19 मिलीग्राम / (हू-Flt3L पुलिस महानिरीक्षक एम Manz, विश्वविद्यालयों द्वारा प्रदान की एक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करने के लिए घर में उत्पन्नTy अस्पताल ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड) और 37 सी, एक माइक्रोस्कोप के तहत डीसी विकास की आवधिक दृश्य की निगरानी के साथ 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
    नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक मानव फ्लोरिडा या माउस फ्लोरिडा डीसी विकास का समर्थन करने के लिए हू-Flt3L पुलिस महानिरीक्षक के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. 12 दिन में सतह पर तैरनेवाला में कोशिकाओं को ले लीजिए और जिसके परिणामस्वरूप supernatants संयोजन RPMI माध्यम पूरा मिलीलीटर 0.5 के साथ एक बार कुओं धो लें। एक सेल खुरचनी के साथ पक्षपाती कोशिकाओं 0.5 मिलीलीटर ताजा मध्यम जोड़ें और स्क्रैप।
  4. 500 x जी पर 5 मिनट के लिए सेल युक्त दोनों भागों से मध्यम और सेंट्रीफ्यूज का मिश्रण।
  5. 50 μl FACS बफर में छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं। 50 μl विरोधी CD16 / 32 हाइब्रिडोमा सतह पर तैरनेवाला जोड़ें और एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए 1-2 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. गणना करें और निम्न एंटीबॉडी (0.05 माइक्रोग्राम प्रत्येक) विरोधी CD11c एपीसी (N418), विरोधी CD11b-FITC, और विरोधी B220-पे के साथ सभी कोशिकाओं दाग।
  7. वर्णन के रूप में धो और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं3.3 कदम में घ।
  8. CD11c + पर 100 μl FACS बफर, गेट में कोशिकाओं Resuspend और सीडीसी (CD11c + CD11b + B220 -) के लिए विश्लेषण और पीडीसी (CD11c + CD11b - B220 +) 17।

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Representative Results

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4-6x10 7 बी.एम. कोशिकाओं के कुल आम तौर पर femurs और एक 6-8 विकेटकीपर-बूढ़े, जंगली प्रकार C57BL 6 / माउस की tibiae से अलग कर रहे हैं। CLPs को सुलझाने के लिए, कुल बी.एम. कोशिकाओं वंश मार्कर (CD3, सीडी 8, B220, CD19, CD11b, जीआर-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, और एमएचसी II), विरोधी के खिलाफ पीई संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं ग-किट-PerCP / Cy5.5, विरोधी Sca-1- FITC, विरोधी एम CSFR एपीसी और विरोधी आईएल 7Rα-पीई / Cy7, विश्लेषण और एक सेल सॉर्टर के साथ हल। कांग्रेस विधायक दल के लिए छँटाई रणनीति चित्र 1 में दिखाया गया है। आमतौर पर, 5x10 4 CLPs एक C57BL 6 / माउस से प्राप्त कर रहे हैं। अधिक CLPs प्राप्त करने के लिए, 3-4 चूहों से बी.एम. कोशिकाओं जोड़ा जा सकता है और प्रोटोकॉल छँटाई से पहले अनुसार समायोजित।

5.9x10 6 एसी 6 फीडर कोशिकाओं के साथ 500 CLPs की coculture के बाद, पत्थर क्षेत्र बनाने कोशिकाओं (CAFC) दिन 3-4 से प्रकट करने के लिए शुरू करते हैं। 8 दिन तक, दौर के आकार पीडीसी दिखाई देते हैं और CAFC (2A चित्रा) के शीर्ष पर रोक देते हैं। पीडीसी की संख्या डी के आसपास चोटियों12-14 प्र बात जिस पर पीडीसी उनके पूर्ण विकास के बाद apoptosis से गुजरना करने के लिए शुरू, और संख्या धीरे-धीरे कम करने के लिए शुरू करते हैं। सीडीसी कालोनियों दिन 6-8 से, पीडीसी कालोनियों से बाद में दिखाई देते हैं, और सीडीसी की आकृति विज्ञान में बड़े होते हैं, धुरी की तरह, और पक्षपाती (चित्रा 2 बी)।

आमतौर पर, 5-6x10 4 कोशिकाओं coculture के 2 हफ्तों के बाद 500 CLPs से उत्पन्न हो सकता है। विरोधी CD11c एपीसी के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद, विरोधी CD11b FITC और विरोधी B220-पे, प्रवाह द्वारा cytometry विश्लेषण से पता चलता है कि पीडीसी का प्रतिशत (CD11c + CD11b - B220 +) और सीडीसी (CD11c + CD11b + B220 - ) 91% और 6%, क्रमशः (चित्रा 3) है। इसलिए, इस विधि के साथ पीडीसी 100 गुना ज्यादा के रूप में विस्तारित किया जा सकता है।

चित्र 1
CLPs के लिए चित्रा 1. Gating रणनीतियों। बी.एम. कोशिकाओं आईएसओएक माउस से lated fluorescently लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग और लिन के रूप में परिभाषित किया गया है, जो CLPs, के लिए विश्लेषण किया गया - सी-किट पूर्णांक Sca -1 पूर्णांक एम CSFR -। आईएल 7Rα + यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2
आकृति विज्ञान CLP-एसी-6 cocultures में सीडीसी और पीडीसी कालोनियों के चित्रा 2। 500 CLPs / एमएल फ्लोरिडा 100 एनजी की उपस्थिति में γ-किरणित एसी 6 फीडर कोशिकाओं के साथ cocultured रहे थे। (ए) पीडीसी कालोनियों दिन 8 में, 10 , और 12, और (बी) के दिन 8, 12 में सीडीसी कालोनियों और 16 x 200 (पैमाने बार 50 माइक्रोन) पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत फोटो खींच रहे थे। एक larg देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के एर संस्करण।

चित्र तीन
सीएलपी व्युत्पन्न पीडीसी और सीडीसी की चित्रा 3. प्रवाह cytometric विश्लेषण। पांच सौ CLPs और γ-किरणित एसी 6 फीडर कोशिकाओं (5.9x10 4 / एमएल) / एमएल एनजी फ्लोरिडा (100 की उपस्थिति में 12 दिनों के लिए इन विट्रो में cocultured थे )। कोशिकाओं विरोधी CD11c एपीसी, विरोधी CD11b-FITC, और विरोधी B220-पे के साथ दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। कोशिकाओं को पहली CD11c + पर gated और फिर सीडीसी (CD11c + CD11b + B220 -) के लिए विश्लेषण किया गया और पीडीसी (CD11c + CD11b - B220 +)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ हम CLPs की एक छोटी संख्या से, विशेष रूप से एक में इन विट्रो संस्कृति डीसी के मजबूत पीढ़ी के लिए प्रणाली है, और पीडीसी का वर्णन है। इस संस्कृति प्रणाली की विशिष्टता फीडरों के रूप में एसी-6 कोशिकाओं, एक stromal सेल लाइन, के उपयोग की वजह से है। यह दृष्टिकोण इस तरह के आईएल -7, एससीएफ, एम-सीएसएफ और फ्लोरिडा के रूप में 20 न केवल साइटोकिन्स, प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी आवश्यक सेल सेल संपर्क 21 डीसी विकास का समर्थन करने के लिए। एसी-6 कोशिकाओं कई पूर्वज 8,16,22 से इन विट्रो डीसी विकास के अध्ययन की सुविधा के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है। हम यह CLPs से पीडीसी के कुशल भेदभाव का समर्थन करने के लिए एसी-6 फीडर कोशिकाओं के एक इष्टतम घनत्व बीज के लिए महत्वपूर्ण है कि पाया। विशेष रूप से, पीडीसी विकास के लिए उपयुक्त है, जो अगले दिन, confluency में 5.9x10 12 अच्छी तरह प्लेटें परिणामों में 4 γ-किरणित एसी 6 कोशिकाओं बोने। कम से कम एसी-6 सेल घनत्व (3.9x10 4 / अच्छी तरह से 12 अच्छी तरह से थाली में) सीडीसी शहरी का समर्थन करने के लिए जाता हैटी 24। इसलिए, यह संस्कृति प्रणाली 23 स्केलिंग जब शर्तों का अनुकूलन करने के लिए एसी 6 कोशिकाओं का पहला बीज कई सांद्रता के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, यह एसी 6 कोशिकाओं राजनीति बीतने संख्या के लिए सावधान ध्यान सहित, को बनाए रखा है, और confluency तक पहुँचने की अनुमति कभी नहीं किया है कि यह भी महत्वपूर्ण है। भीड़ या उनके मार्ग संख्या 20 से अधिक है, तो छोड़ दिया, तो इन कोशिकाओं इन विट्रो में hematopoiesis समर्थन करने की क्षमता खो देते हैं। इसके अतिरिक्त, फ्लोरिडा की एकाग्रता भी डीसी विकास को प्रभावित करता है। अधिक मात्रा में (100-200 एनजी / एमएल) पीडीसी मुख्य रूप से 24 उत्पन्न कर रहे हैं, जबकि विशेष रूप से, कम मात्रा में (25-50 एनजी / एमएल) सीडीसी अधिमान्यतया, विकसित कर रहे हैं। एसी-6 सेल घनत्व और फ्लोरिडा खुराक के अलावा, कुशलता से इस संस्कृति प्रणाली में डीसी विकास का समर्थन करता है कि एफबीएस के एक बैच का चयन सावधानी प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है।

इन विट्रो व्युत्पन्न सीडीसी और पीडीसी जिले किया जा सकता हैऔर CD11c + CD11b - - उनकी सतह मार्कर, अर्थात् CD11c + CD11b + B220 द्वारा tinguished B220 + से क्रमश: अपने morphologies भी माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष कर रहे हैं। पीडीसी (चित्रा 2), दौर के आकार में छोटे होते हैं और निलंबन में बढ़ने जबकि सीडीसी, धुरी के आकार, बड़े होते हैं और पक्षपाती हैं। डीसी भेदभाव के कैनेटीक्स भी पीडीसी पहले और सीडीसी बाद में प्रदर्शित होने के साथ, अलग है। इसके अतिरिक्त, पीडीसी विकास की प्रक्रिया में काफी अधिक एसी 6 घनत्व विकास की प्रक्रिया को तेज करने के साथ एसी-6 सेल घनत्व से प्रभावित है। यह पीडीसी पूर्ण विकास और इस प्रकार, इस संस्कृति प्रणाली में पीडीसी बनाम सीडीसी के अनुपात से धीरे-धीरे बाद में समय बिंदुओं पर बढ़ जाती है निम्नलिखित मरने के लिए शुरू किया जाना चाहिए। पीडीसी apoptosis से गुजरना करने के लिए शुरू करते हैं, इसलिए समय-समय पर माइक्रोस्कोपी द्वारा डीसी विकास की निगरानी और प्रवाह cytometry अत्यधिक निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है।

ध्यान से, describएड विधि को भी इस तरह के CDPs के रूप में अन्य डीसी पूर्वज, के लिए लागू किया जा सकता है; हालांकि, इन कोशिकाओं से उत्पन्न मुख्य डीसी आबादी भी उच्च एसी 6 घनत्व या फ्लोरिडा खुराक पर, सीडीसी 17 हैं। CDPs की कम पीडीसी संभावित सीडीपी फीडर 11 या फीडर मुक्त 16 प्रणाली, दो अलग-अलग इन विट्रो संस्कृति सिस्टम उपयोग कर या तो अलग-अलग समूहों से रिपोर्ट के अनुरूप है। इन परिणामों के एसी 6 फीडर सिस्टम ईमानदारी से अलग progenitors के भेदभाव की क्षमता प्रदर्शित कर सकते हैं कि सुझाव।

B220 + - इस संस्कृति प्रणाली से उत्पन्न पीडीसी CD11c + CD11b हैं। इसके अलावा, वे CDCs 17 की तुलना में, Tcf4 (E2-2 encodes) और Rag1, दो पीडीसी विशिष्ट जीन के अपेक्षाकृत उच्च स्तर है, लेकिन id2, एक सीडीसी विशिष्ट जीन के निचले स्तर व्यक्त करते हैं। इन पीडीसी Siglec-एच और BST2, murine पीडीसी की विशेषता माना मार्कर की कमी है, भले ही वे अभी भी उच्च स्तर का उत्पादन करने के लिए IFN-मैं से सक्षम हैंसीडीसी करते हैं और vesicular stomatitis वायरस (VSV) 24 से संक्रमित जब CD86 upregulate। यह इन पीडीसी, अधूरे विभेदित हालांकि, अभी भी कार्य कर रहे हैं कि पता चलता है। इसके अलावा, हम पहले से ही सफलतापूर्वक इस तकनीक डीसी विकास के अध्ययन के लिए मूल्यवान है, पुष्टि है कि CLPs 17 से पीडीसी विकास में IFN-मैं और फ्लोरिडा की एक synergistic भूमिका चित्रित करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है।

अंत में, यहाँ हम पीडीसी के विकास या कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं, जिसमें एसी-6 फीडर coculture प्रणाली का उपयोग कर CLPs की एक छोटी संख्या से पीडीसी उत्पन्न करने के लिए एक सरल है, लेकिन कुशल, विधि प्रस्तुत करते हैं।

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Acknowledgments

हम डॉक्टरों के आभारी हैं। अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए मार्कस Manz और इरविंग Weissman। हम यह भी क्रमश: चिकित्सा और एनटीयू अस्पताल के नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय कॉलेज में प्रवाह cytometric विश्लेषण और पहले की सेल छँटाई कोर सुविधा और दूसरी कोर प्रयोगशाला द्वारा प्रदान की सेवा स्वीकार करते हैं। इस काम के विज्ञान और प्रौद्योगिकी, ताइवान मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया (सबसे 102-2320-बी-002-030-MY3) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों, ताइवान (NHRI-EX102-10256SI और NHRI-EX103-10256SI)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

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References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
एसी-6 फीडर सिस्टम का उपयोग आम लिम्फायड progenitors से Murine Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं की <em>इन विट्रो</em> पीढ़ी <em>में</em>
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Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

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