Abstract
形質細胞様樹状細胞（pDC）感染に応答して、または炎症応答の間に活性化された細胞を産生Iインターフェロン強力型（IFN-I）です。残念ながら、pDCの機能の研究は、リンパ器官で、その低周波によって妨げられ、in vitroでのDC生成のための既存の方法は、主にpDCを超えるのCDCの生産を好みます。ここでは、効率的にin vitroでのリンパ球系共通前駆細胞（のCLP）からのpDCを生成するためのユニークなアプローチを提示します。具体的には、プロトコルは、骨髄からのCLPを浄化し、Flt3リガンドの存在下でγ線を照射し、AC-6フィーダー細胞との共培養により、pDCにを生成する方法の詳細を説明しました。この培養系のユニークな特徴は、のCLPは、AC-6細胞の下に移動して、石畳の領域形成細胞になることのpDCを拡大するための重要なステップです。形態学的に異なるDCは、すなわちたpDCとのCDCは、7の組成物で約2週間後に生成されました最適な条件の下で0から90パーセントのpDCに。通常、この方法によって生成されたpDCの数はおおよそのCLPの数の100倍がシードされます。したがって、これは、確実に、これらの細胞の発達と機能にさらなる研究を容易にするために必要なのpDCを大量に生成すると、新規システムです。
Introduction
樹状細胞（DC）は、1免疫応答の制御に重要な役割を果たしているプロフェッショナル抗原提示細胞です。 DCは不均一であるが、それらは、大きく2つの集団に分類することができ、従来のDC（のCDC）および形質のDC（pDCに）2,3。リンパ器官に加えて、のCDCとのpDCは、肺、腸および皮膚2を含む組織中に見出されます。 CDCとのpDCの形態はのCDCは、デンドライト状の突起と以上のプラズマ細胞様であることのpDCの形状を呈すると、異なります。また、一般的なマウスDCマーカーCD11cのは、より高度のpDC上でのCDCより上で発現されます。 pDCに2が行うよりも、MHCクラスIIの高いレベルと共刺激分子を発現どちらのCD24 +のCDC、 -のCDCとのCD11b -また、のCDCは、さらにのCD11b + CD24に分けることができます。成熟のpDCは、一方で、選択シグレックHおよびBST2 4を発現することが示されています。 Functionally、のCDCは、pDCにはよりも優れた抗原提示細胞です。しかし、pDCには、私は、ウイルス感染または炎症性刺激5時に型インターフェロンの膨大な量を生成することができます。
両方のCDCとのpDCは短命であるため、常に骨髄（BM）6,7内の前駆細胞から補給する必要があります。致死的に照射したマウスに共通の骨髄前駆細胞（のCMP）とリンパ球系共通前駆細胞（のCLP）の養子移入はのCDCとのpDCは、両方の系統8-10から生成することができることを実証しています。しかし、RAG1 / 2を発現し、IgH遺伝子座11,12に再配置DJセグメントを所有するpDCのサブセットがあります。これらの細胞はまた、B220マーカーの発現は、核酸感知受容体（TLR7 / TLR9）、および転写因子（SPIBとBcl11a）13を含む Bリンパ球との分子の類似性を共有すると、すべてがリンパ系列の署名であると考えられています。したがって、CLPsがあるため、系統の類似のpDCのインビトロ生成のための良い選択かもしれません。
ヒトおよびマウスの両方でのCDCとのpDCの頻度が非常に低いが6、DCは、特にたCDCは、（例えば、GM-CSF 11,14またはFlt3リガンドなどのサイトカインの存在下で、BMまたは前駆細胞からインビトロで生成することができるFL ）フィーダーフリーシステム11,15,16を使用 。しかし、残念ながら、それは、FL 11,15,16 を用いてインビトロでのpDCの多くを生成することは不可能です。以前に我々は、pDCには、効率的にAC-6フィーダシステム17を使用してのCLP からインビトロで生成することができることを実証しました。培養系においてAC-6間質細胞株を使用することの利点は、それが細胞 - 細胞接触とのCLPからのpDCの多数の生成をサポートするサイトカインの分泌を提供することです。このシステムの生産は非常に堅牢ですが、下記の手順を慎重にレプリケーションが私を必要とされますn個の順序のpDCの効率的な生成を確実にします。
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Protocol
C57BL / 6野生型マウスは、国立実験動物センター（NLAC）、台湾から購入しました。すべてのマウスは、特定病原体を含まない条件下で飼育し、維持しました。プロトコルおよび動物使用手順を見直し、医学の国立台湾大学（許可番号：20120075）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。実験を行っている間に加えて、研究者は、動物のすべての痛みの可能性を減らすため、苦痛、または苦痛を行いました。手袋を着用して説明されているすべての手順は室温で行いました。
AC-6フィーダー細胞の調製
注：（I.ワイズマン、スタンフォード大学によって提供された）AC-6.21（AC-6要するに）間質細胞ライン18は、RPMI中で維持されるべきである15％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。フィーダー細胞として機能するには、AC-6細胞は、γ線を照射している3000ラド（30Gy）1日との共培養の前に、その増殖を防ぐために。注目メンテナンス中に過密放置すれば、AC-6の細胞は、その分化支持能を失う傾向がある、またはその通過数は20を超えている場合。
- 1ミリリットルダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）と吸引によってDPBSを削除すると1回洗浄AC-6細胞。 37 O℃で3~5分間、0.8 mlのトリプシン溶液（0.05％トリプシンおよびDPBSで0.5mMのEDTA）とAC-6細胞を、5％CO 2を処理した後、培養液の10容量にして、それを希釈することによって反応を停止させます単一細胞懸濁液を作ります。
- 5.9x10のAC-6細胞/ウェルを12ウェルプレートに4細胞をシードし、37°C の 、5％CO 2、O / Nでインキュベートします。
注意：AC-6細胞の密度はのCDC生成を有利に働く低密度として非常に重要です。 4細胞/ウェル5.9x10の密度で播種は、AC-6のCLPからのpDCの導出に最適である次の日、によって密集度に到達することができます。 - γ-照射を使用して3000ラド（30グレイ）のAC-6細胞を照射します。
注意：AC-6を照射するために使用される用量は、増殖から細胞を防ぎ、しかものCLPからのDCの分化に必要なサイトカインおよび細胞 - 細胞接触を提供するのに十分に長い生存を保つために最適化されます。 - 培地を吸引し、1mlの完全RPMI（10％熱不活性化FBS、50μg/ mlのゲンタマイシン、βメルカプトエタノール、50μMを含むRPMI）と交換してください。
マウスから2アイソBM細胞
- CO 2窒息と頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。解剖トレイにマウスを置き、70％エタノールで滅菌します。半ば腹部に切開を行い、下肢をカバーする皮膚を含むマウスの先端部から皮膚を除去。
- 半無菌フード内でマウスを解剖。大腿骨と脛骨を解除するには、膝関節以下上記の大腿骨と脛骨をクリップ。はさみを使用して、骨から筋肉を外し、完全RPMI 5ミリリットルを含む6センチペトリ皿に骨を置きます。
- 無菌培養フードに移動します。完全RPMIで27G針に接続された3ミリリットル注射器を埋めます。はさみを使用して、骨の両端を切断し、静かにそれぞれの端から一度完全RPMIを注入することによって、骨の外に骨髄をフラッシュするために27Gの針を挿入します。
- 細胞を上下に3-5回、針なし注射器を用いて培養皿で穏やかにピペッティングにより単一細胞懸濁液を準備します。
- 500×gで5分間、細胞を遠心分離し、上清をデカント。
- 1ミリリットルACKバッファー（150mMのNH 4 Clを 、10 mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA）で1分間インキュベートし、完全RPMIの10容量で希釈して反応を停止で溶解赤血球。細胞が重力によって死んだ細胞塊および組織破片をダウンペレット化するために、5分間放置します。
注意：これは原因で生細胞の沈降に細胞の損失になりますように5分以上を立たないでください。 - ゆっくりと破片を残して新しいチューブに細胞含有上清をデカント元のチューブ内の背後にあります。
- その後、上清を除去し、廃棄し、細胞をペレットに500×gで5分間遠心します。
- 100μlのFACS緩衝液（1×PBS + 2％FBS + 1mMのEDTA）中（通常は4-6×10 7のBM細胞は、1つのマウスから得られる）総BM細胞を再懸濁します。
3のCLPのFACS分析およびソート
- Fc受容体をブロックするために、1〜2分間抗CD16 / 32（ハイブリドーマ上清クローン2.4G2、50μL/反応または1-2μgの/反応）、FACS緩衝液中の細胞への（ステップ2.9）を追加します。
注：抗CD16 / 32はまた、顆粒球、単球およびBリンパ球などのFc受容体を発現する細胞に対する抗体の非特異的結合を防止するために添加されたFcブロックと呼ばれます。 - 同時に周囲光を回避し、氷上で15分間（4×10 7細胞）以下の蛍光色素標識抗体で細胞を染色します。抗体：抗CD3を含むPE結合系統マーカー（0.2μgの各）（17A2）、抗CD8（53-6.7）、抗B220（RA3-6B2）、抗CD19（eBio1D3）、抗CD11b（M1 / 70）、抗GR-1（RB6-8C5）、抗Thy1.1（HIS51）、抗NK1.1（PK136）、抗TER119（TER-119）、および抗MHC-II（NIMR-4）、0.2μgの抗c-Kitの-PerCPを-のCy5.5 （2B8）、1μgの抗SCA-1-FITC（D7）、0.4μgの抗M-CSFR-APC（AFS98）、および0.2μgの抗IL-7Rα-PE-Cy7の（A7R34）。
- 3ミリリットルFACS緩衝液で細胞を洗浄し、500×gで5分間遠心します。
- 40μMのセルストレーナーを通して300μlのFACS緩衝液およびフィルタ細胞で細胞を再懸濁します。
- 残りの細胞を回収し、同じセルストレーナーを使用してチューブをソートする無菌FACSにフィルタリングするために、追加の100μlのFACS緩衝液でチューブを洗浄します。
- 信号検出のための適切なフィルタおよび電圧を使用して染色した後すぐにフローサイトメトリー分析を行います。 PE-およびPE-Cy7の-labelded抗体および633nmのラスを検出するために561 nmレーザー、FITC-、PerCPを-のCy5.5標識抗体を検出するために488nmのレーザーを使用してERは、APC標識抗体を検出します。
- セルソーターを用いて、IL-7Rα+（ステップ3.2で染色されたように） -のc-kit は int SCA-1 INT M-CSFR -以下のマーカーLINに従ってソートアウトのCLP。クッションとして完全RPMI 8 mlを含む15mlチューブで選別された細胞を収集します。
- 実行終了時にセルソーターによって示されるように選別された細胞の絶対数を記録します。一般的に、5×10 4のCLPは1マウスのBMから取得することができます。
4.共培養のCLPとAC-6
- 、500×gで10分間、ステップ3.7からの選別された細胞を遠心分離し、上清を除去し、5×10 4細胞/ mlの周りに細胞密度を得るために十分な完全RPMIで細胞ペレットを再懸濁します。シード500細胞/ウェルのステップ1.4で調製したフィーダー細胞を含む12ウェルプレートに。
- 100 ngの追加/ mlのFL 19（HU-のFlt3L-IgはM.マンツ、Universiによって提供される発現系を使用して、社内で発生しましたTY病院チューリッヒ、スイス）と37°Cの 、顕微鏡下でのDC開発の定期的な視覚的な監視と5％CO 2でインキュベートします。
注：市販の組換えヒトまたはマウスFL FLは、DCの発達をサポートするHU-のFlt3L-Igのための代替物として使用することができます。 - 12日目に上清中の細胞を収集し、得られた上清を組み合わせた0.5ミリリットル完全RPMI培地で1回、ウェルを洗浄します。 0.5ミリリットルに新鮮な培地を追加し、セルスクレーパーで接着細胞をスクラップ。
- 500×gで5分間の部品や遠心機の両方からの細胞含有培地を組み合わせます。
- 50μlのFACS緩衝液中で上清をデカントし再懸濁した細胞。 50μlの抗CD16 / 32ハイブリドーマ上清を加え、Fc受容体をブロックするために1~2分間インキュベートします。
- 列挙し、次抗体（0.05μgの各）抗CD11cの-APC（N418）、抗CD11b-FITCおよび抗B220-PEで、すべての細胞を染色。
- 洗って説明するように、細胞を遠心分離ステップ3.3でD。
- 、100μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁したCD11c +の上のゲートとのCDC（のCD11c +のCD11b + B220 - ）のために分析したpDC（CD11cの+のCD11b - B220 +）の17。
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Representative Results
4-6x10 7 BM細胞の総数は、典型的には、大腿骨一6~8週齢の野生型C57BL / 6マウスの脛骨から単離されます。 CLPを整理するには、総BM細胞は、系統マーカー（CD3、CD8、B220、CD19、CD11bの、GR-1、Thy1.1、NK1.1、TER119、およびMHC-II）に対するPE結合抗体で染色され、抗-c-Kitの-PerCPを/ Cy5.5を、抗SCA-1-FITC、抗M-CSFR-APCおよび抗IL-7Rα-PE / Cy7の、分析し、セルソーターでソート。 CLPのための選別戦略は、図1に示されている。典型的には、5×10 4のCLP一つC57BL / 6マウスから得られます。より多くのCLPを取得するには、並べ替えの前に3-4マウスからの骨髄細胞を組み合わせてもよいし、プロトコルは、それに応じて調整。
5.9x10 6 AC-6フィーダー細胞と500のCLPの共培養後、石畳の領域形成細胞（CAFC）は一日3-4によって現れ始めます。 8日目では、円形のpDCが現れ、CAFC（ 図2A）の上に中断します。 pDCの数がdの周りピーク12-14 AYその時点でのpDCは、彼らの完全な発展、次のアポトーシスを受けるように開始し、数が徐々に減少し始めます。 CDCコロニーが6-8日で、pDCのコロニーより後に表示され、のCDCの形態が大きく、紡錘状の、付着（ 図2B）。
典型的には、5-6x10 4細胞は共培養の2週間後に500のCLPから生成することができます。抗CD11cの-APCで細胞を染色した後、抗CD11b-FITCおよび抗B220-PEは、フローによる分析は、フローサイトメトリーを示しているのpDCの割合（のCD11c +のCD11b - B220 +）とのCDC（のCD11c +のCD11b + B220 - ）は、それぞれ91％と6％（ 図3）です。したがって、この方法でのpDCは100倍ほどに拡張することができます。
CLP図1.ゲーティング戦略。BM細胞イソ1匹のマウスからされた関連の蛍光標識抗体で染色し、LINとしたのCLP、について分析した-のc-kit は int SCA-1 INT M-CSFR - 。IL-7Rα+ この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
CLP-AC-6の共培養中のcDCやpDCにコロニーの図2形態。500のCLPは、100ng / mlのFLの存在下でγ線を照射し、AC-6フィーダー細胞と共培養した。（A）のpDCコロニー8日目、10 、および12、および（B）8日目、12時のCDCコロニー、および16は、200×（スケールバーは50μm）の光顕微鏡下で写真撮影した。 ラーグを見るにはこちらをクリックしてくださいこの図のERバージョン。
CLP由来のpDCとのCDCの図3のフローサイトメトリー分析。五百のCLPとγ線を照射し、AC-6フィーダー細胞（5.9x10 4 / ml）を、FL（100ng / mlの存在下で12日間in vitroで共培養しました。 ）。細胞を、抗CD11cの-APC、抗CD11b-FITCおよび抗B220-PEで染色し、フローサイトメトリーによって分析しました。細胞は、最初のCD11c +にゲートし、その後のCDC（のCD11c +のCD11b + B220 - ）を分析したとのpDC（CD11cの+のCD11b - B220 +）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、のCLPの少数から、特にDCの堅牢な世代のためのin vitro培養系を説明し、pDCに。この培養系の独自性は、フィーダーとしてのAC-6細胞、ストローマ細胞株の使用によるものです。このアプローチは、IL-7、SCF、M-CSFおよびFL 20などのサイトカインが、また、DCの発達をサポートするのに必要な細胞-細胞接触21だけでなく、提供することが示されています。 AC-6細胞は、いくつかの前駆体8,16,22からインビトロ DCの発達の研究を容易にするために以前に使用されてきました。我々は、のCLPからのpDCの効率的な分化をサポートするためにAC-6フィーダー細胞の最適な密度に播種することが重要であることを見出しました。具体的には、pDCの開発に適しており、次の日、密集度で5.9x10 12ウェルプレートの結果で4γ線を照射し、AC-6細胞を播種します。下部AC-6細胞密度（3.9x10 4 /ウェルで12ウェルプレート中）のCDC developmenを支持する傾向がありますトン24。したがって、培養系23をスケールアップする際の条件を最適化するために、AC-6細胞の第一シードいくつかの濃度に推奨されます。また、AC-6細胞を綿密に継代数に細心の注意を含め、維持、およびコンフルエントに到達させたことがないことも重要です。過密またはそれらの継代数が20より大きい場合ままにした場合、これらの細胞は、インビトロで造血をサポートする能力を失う傾向があります。また、フロリダ州の濃度も、DCの開発に影響を与えます。高用量で（100〜200 ngの/ ml）でのpDCは、主に24を生成している間に具体的には、低用量で（25〜50 ngの/ ml）でのCDCは、優先的に、開発されています。 AC-6細胞密度およびFLの投与量に加えて、効率的にこの培養系でのDC開発をサポートし、FBSのバッチを慎重に選択するには、手順の成功の中心です。
インビトロ由来のCDCとのpDCは、DISになることができますがおよびCD11c + CD11bの- -それらの表面マーカー、すなわちのCD11c +のCD11b + B220によってtinguished B220 +、それぞれ、その形態はまた、顕微鏡観察によって認識されています。 pDCには（ 図2）、丸型小さく、懸濁液中で成長している間のCDCは、紡錘状、大きく、接着性です。 DC分化の動態も、pDCには以前とのCDC後に登場すると、異なります。また、pDCの発達のプロセスは、有意に高いAC-6濃度は、発生過程を高速化してAC-6細胞の密度に影響されます。これはpDCには、完全な開発下記死に始めるため、この培養系でのpDC対のCDCの割合が徐々に後の時点で増加することに留意すべきです。そのため、定期的な顕微鏡による直流開発のモニタリングおよびフローサイトメトリーは、高度のpDCは、アポトーシスを開始するときに決定するために推奨されます。
注目すべきは、describEDの方法はまた、他のCDPのようなDC前駆細胞に適用することができます。しかし、これらの細胞から生成された主なDC集団は、高AC-6濃度またはFLの用量で、CDCは17です。 CDPの低pDCの電位は、CDP-フィーダ11または無フィーダー16システム、 体外培養系の異なる2つのいずれかを使用して、異なるグループからの報告と一致しています。これらの結果は、AC-6フィーダシステムを忠実に異なる前駆細胞の分化能を反映し得ることを示唆しています。
B220の+ -この培養系から生成されたpDCにはのCD11c + CD11bのです。また、彼らは17のCDC行うよりも、TCF4（E2-2をコードする）とRAG1、2 pDCの特異的遺伝子の比較的高いレベルが、Id2は、CDC-特定の遺伝子の低いレベルを発現します。これらのpDCは、マウスのpDCの特性と考えマーカーシグレックHおよびBST2を欠いていても、それらは依然としてIFN-Iよりも高いレベルを生成することができますCDCを行い、水疱性口内炎ウイルス（VSV）24に感染したときにCD86を上方制御します。これは、これらのpDCは、不完全に分化しているが、まだ機能していることを示唆しています。また、我々はすでに成功し、この技術は、DC発達の研究のための価値があることを確認し、17のCLPからのpDC開発におけるIFN-IとFLの相乗的役割を描写するために、このメソッドを使用しています。
結論として、ここではのpDCの発達や機能研究を容易にすることができるAC-6フィーダー共培養システムを用いてのCLPの少数からのpDCを生成するための単純な、しかし効率的な、方法を提示します。
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Acknowledgments
私たちは、博士に感謝しています。試薬を提供するためのマルクス・マンツとアービングワイズマン。我々はまた、それぞれ、フローサイトメトリー分析によって提供されるサービスとファーストと医学の国立台湾大学で第二のコア研究所とNTU病院の細胞選別基盤施設を認めます。この作品は、科学技術省、台湾（MOST 102から2320-B-002から030-MY3）と国民健康研究所、台湾（NHRI-EX102-10256SIとNHRI-EX103-10256SI）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
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