Abstract
Células dendríticas plasmocit�des (PDCs) são poderoso tipo I interferon (IFN-a) que produzem células que são activados em resposta a infecção ou durante as respostas inflamatórias. Infelizmente, estudo da função PDC é prejudicada pela sua baixa freqüência em órgãos linfóides, e os métodos existentes para a geração in vitro DC predominantemente favorecer a produção de CDCs sobre pDCs. Aqui nós apresentamos uma abordagem única para gerar de forma eficiente pDCs de progenitores linfóides comuns (CLPs) in vitro. Especificamente, o protocolo descrito detalhes como purificar os CLPs de medula óssea e geram pDCs por coculturing com AC-6 células alimentadoras irradiadas com y na presença de ligando Flt3. Uma característica única do presente sistema de cultura é que as CLPs migrar sob o AC-6 e as células tornam-se as células formadoras de área de paralelepípedo, um passo crítico para a expansão pDCs. DCs morfologicamente distintas, a saber pDCs e CDCs, foram gerados após cerca de 2 semanas com uma composição de 70-90% pDCs em condições óptimas. Tipicamente, o número de pDCs geradas por este método é cerca de 100 vezes do número de CLPs semeadas. Portanto, este é um novo sistema com o qual gerar robustamente o grande número de pDCs necessárias para facilitar estudos adicionais sobre o desenvolvimento e a função destas células.
Introduction
As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais, que desempenham um papel importante no controlo da resposta imunitária 1. Enquanto as DCs são heterogéneos, eles podem ser classificados em duas populações, as DCs convencional (CDCs) e DCS plasmocitoides (PDCs) 2,3. Além de órgãos linfóides, CDCs pDCs e também são encontradas em tecidos incluindo o pulmão, intestino, pele e 2. A morfologia dos CDCs e pDCs difere, com CDCs expositoras projeções dendríticos-like e forma de pDCs ser como célula-mais de plasma. Além disso, o DC marcador rato comum, CD11c, é mais altamente expresso em CDCs que em pDCs. Além disso, os CDCs pode ainda ser dividido em CD11b + CD24 - CDCs e CD11b - CD24 + CDCs, sendo que ambos expressam níveis mais elevados de MHC classe II e de moléculas co-estimuladoras do que fazer pDCs 2. PDCs maduros, por outro lado, têm sido mostrados para expressar selectivamente Siglec-H e BST2 4. Functionally, CDCs são melhores células apresentadoras de antígeno que são pDCs; No entanto, pDCs pode produzir uma grande quantidade de interferão de tipo I sobre a infecção do vírus ou estimulação inflamatória 5.
Ambos os CDCs e pDCs são de curta duração e, portanto, deve ser constantemente reabastecidos de progenitores dentro da medula óssea (BM) 6,7. A transferência adoptiva de células progenitoras comuns mielóides (PGZC) e progenitores linfóides comuns (CLPs) em ratinhos letalmente irradiados demonstra que CDCs e pDCs pode ser gerada a partir de ambas as linhagens 8-10. No entanto, há um subconjunto de pDCs que expressam RAG1 / 2 e possuem segmentos rearranjados DJ no locus de IgH 11,12. Estas células também partilhar semelhanças moleculares com linfócitos B, incluindo a expressão do marcador B220, receptores de detecção de ácidos nucleicos (TLR7 / TLR9), e factores de transcrição (e SPIB BCL11A) 13, dispõe de todos Acredita-se que as assinaturas de linhagem linfóide. Portanto, CLPs podem ser boas escolhas para in vitro geração de pDCs por causa da semelhança linhagem.
Enquanto a frequência dos dois CDCs pDCs e em humanos e em ratos é muito baixo 6, DCs, particularmente CDC, podem ser geradas in vitro a partir de progenitores BM ou na presença de citocinas, tais como GM-CSF 11,14 ou ligando Flt3 (FL ) usando sistemas de livre-feeder 11,15,16. Infelizmente, no entanto, não é possível produzir um grande número de pDCs in vitro utilizando FL 11,15,16. Anteriormente tínhamos demonstrado que pDCs pode ser gerada de forma eficiente in vitro a partir CLPs que utilizam o sistema de alimentação de CA 6-17. A vantagem de utilizar a linha de células do estroma AC-6 no sistema de cultura é que ela proporciona um contacto célula-célula e a secreção de citoquinas que suportam a geração de grandes números de pDCs de CLPs. Embora a produção com este sistema é muito robusto, replicação cuidadosa dos procedimentos descritos a seguir é necessário iara garantir a geração eficiente de pDCs.
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Protocol
Murganhos C57BL / 6 de tipo selvagem foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Animais de Laboratório (NLAC), Taiwan. Todos os ratinhos foram criados e mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos específicos. Protocolos e procedimentos de uso dos animais foram revisadas e aprovadas pelo cuidado e uso de animais Comitê Institucional da National Taiwan University College of Medicine (Permit Number: 20120075). Além disso, os pesquisadores fizeram todos os esforços para reduzir o potencial de dor, sofrimento, angústia ou nos animais durante a realização de experimentos. Todos os procedimentos descritos foram realizados à temperatura ambiente usando luvas.
1. Preparação de 6-ac células alimentadoras
Nota: O AC-6,21 (AC-6 em curto) linha celular de estroma 18 (fornecida por I. Weissman, Universidade de Stanford) devem ser mantidas em RPMI suplementado com 15% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS). Para servir como células de alimentação, AC-6-γ células são irradiadas com 3000 rad (30Gy) um dia antes da co-cultura para evitar a sua proliferação. Th notano AC-6 células tendem a perder a sua capacidade de suporte de diferenciação se deixou estar lotados durante a manutenção, ou se o seu número passagem é superior a 20.
- Lavar AC-6 células uma vez com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e remover por aspiração DPBS. Tratar AC-6 células com 0,8 ml de solução de tripsina (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,5 mM em DPBS) durante 3-5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 e, em seguida, parar a reacção por diluição com 10 volumes de meio de cultura aos fazer a suspensão de célula única.
- Semente AC-6 5.9x10 células em 4 células / poço em placas de 12 poços e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
Nota: A densidade da AC-6 células é muito importante, uma menor densidade favorecerá a geração CDC. Semear a uma densidade de 4 5.9x10 células / poço permitirão AC-6 para atingir confluência no dia seguinte, o que é óptimo para a derivação das PDC de CLPs. - Irradiar AC-6 células a 3000 rad (30 Gy), utilizando-γ irradiador.
Nota: A dose utilizada para irradiar AC-6 é otimizado para evitar que as células se proliferem e ainda mantê-los viável a longo o suficiente para fornecer as citocinas e contato célula-célula necessárias para a diferenciação de DCs de CLPs. - Aspirar o meio e substituir com 1 ml de meio RPMI completo (RPMI com 10% de FBS inactivado pelo calor, 50 ug / ml de gentamicina e 50 pM β-mercaptoetanol).
2. Isolar BM As células de ratinhos
- Sacrifique ratos por asfixia com CO2 e deslocamento cervical. Colocar os ratinhos num tabuleiro de dissecação e esterilizar com etanol a 70%. Realizar uma incisão no abdómen e meados de remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores.
- Dissecar ratinhos em uma capa semi-estéril. Para liberar o fêmur ea tíbia, o fêmur clipe acima e tíbias abaixo da articulação do joelho. Separar os músculos dos ossos usando uma tesoura e colocar os ossos numa placa de Petri 6 cm contendo 5 ml de RPMI completo.
- Mover-se para uma capa de cultura estéril. Encha uma seringa de 3 ml ligada a uma agulha 27G com meio RPMI completo. Cortar ambas as extremidades dos ossos usando uma tesoura, e inserir a agulha 27G para liberar a medula de ossos, injetando suavemente RPMI completo uma vez a partir de cada extremidade.
- Prepara-se uma suspensão de células individuais por pipetagem suave das células cima e para baixo 3-5 vezes na placa de cultura usando a seringa sem agulha.
- Centrifugar as células durante 5 min a 500 xg e decanta-se o sobrenadante.
- Lisar células vermelhas do sangue com 1 ml de tampão ACK (150 mM de NH4Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM de EDTA) a incubação durante 1 min e parar a reacção por diluição com 10 volumes de meio RPMI completo. Permitir que as células em repouso durante 5 min, de modo a sedimentar-se aglomerados de células mortas e detritos por gravidade tecido.
Nota: Não fique mais de 5 min como isso irá resultar em perda de células devido à sedimentação de células viáveis. - Contendo células sobrenadante lentamente decante para um novo tubo deixando detritostrás no tubo inicial.
- Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg para sedimentar as células, em seguida, remover e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células totais BM (tipicamente 4-6 x 10 7 BM células são obtidas a partir de um murganho) em 100 ul de tampão FACS (1x PBS + 2% FBS + EDTA 1 mM).
3. FACS análise e classificação de CLPs
- Adicionar anti-CD16 / 32 (sobrenadante de hibridoma do clone 2.4G2, 50 ul / reacção ou 1-2 ug / reacção) em células em tampão de SCAF (passo 2.9), durante 1-2 minutos, a fim de bloquear os receptores de Fc.
Nota: Anti-CD16 / 32 também é chamado bloco de Fc, que é adicionado para evitar ligação não específica dos anticorpos às células que expressam receptores de Fc, incluindo granulócitos, monócitos e linfócitos B. - Simultaneamente, as células são coradas com os seguintes anticorpos marcados com corantes fluorescentes (para 4x10 7 células) durante 15 min em gelo, evitando a luz ambiente. Antibodies: marcadores de linhagem PE-conjugados (0,2 ug de cada) incluindo o anti-CD3 (17-2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-Ter119 (TER-119), e anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 ug de anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ug de anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug de anti-M-CSFR-APC (AFS98), e 0,2 ug de anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Lavar as células com 3 ml de tampão de FACS, e centrifuga-se durante 5 min a 500 x g.
- Volte a suspender as células em 300 ul de tampão de FACS e células filtrar através de um filtro de células 40 mM.
- Lavar o tubo com um buffer adicional FACS 100 ul para recuperar quaisquer células restantes e filtrar para um FACS estéreis triagem tubo utilizando o mesmo filtro de células.
- Realizar a análise de citometria de fluxo imediatamente após a coloração, usando filtros e voltagens adequadas para a detecção de sinal. Use laser de 488 nm para a detecção dos anticorpos com FITC, PerCP-Cy5.5-rotulados, do laser 561 nm, para detectar o PE- e anticorpos PE-Cy7-labelded e 633 nm laser de detectar o anticorpo marcado com APC.
- Resolver CLPs de acordo com os seguintes marcadores de Lin - c-kit int int Sca-1 M-CSFR - IL-7Rα + (como coradas no passo 3.2), utilizando um classificador de células. Recolher as células separadas em um tubo de 15 ml contendo 8 ml de meio RPMI completo como uma almofada.
- Grave o número absoluto de células classificadas como mostrado pelo classificador de células no final da corrida. Tipicamente, 5x10 4 CLPs podem ser obtidos a partir de MO de um rato.
4. co-cultura CLPs e AC-6
- Centrifugar as células escolhidas a partir da etapa 3.7, durante 10 min a 500 xg, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células com meio RPMI completo suficientemente para se obter uma densidade celular de 5x10 4 em torno de células / ml. Semente 500 células / cavidade da placa de 12 poços contendo células alimentadoras, preparado no passo 1.4.
- Adicionam-se 100 ng / ml FL 19 (Hu-Flt3L-Ig gerado internamente utilizando um sistema de expressão é fornecida por M. Manz, UniversiTy Hospital Zurique, Suíça) e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 com a monitorização visual periódica de desenvolvimento DC sob um microscópio.
Nota: Comercialmente disponível FL recombinante humano ou rato FL pode ser utilizado como um substituto para a hu-Flt3L-Ig para suportar o desenvolvimento DC. - Recolher as células do sobrenadante ao dia 12 e lavar os poços uma vez com 0,5 ml de meio completo RPMI, combinando-se os sobrenadantes resultantes. Adicionar 0,5 ml de meio fresco e destruam as células aderentes com um raspador de células.
- Combinar o meio contendo as células de ambas as partes e centrifugar durante 5 minutos a 500 x g.
- Células sobrenadante e ressuspender em tampão FACS Decantar 50 ul. Adicionar 50 uL de anti-CD16 / 32 sobrenadante de hibridoma e incuba-se durante 1-2 minutos para bloquear os receptores Fc.
- Enumerar e manchar todas as células com os seguintes anticorpos (0,05 ug) de cada anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC, e anti-B220-PE.
- Lavagem e de centrifugação as células como descreverd no passo 3.3.
- Volte a suspender as células em 100 ul de tampão FACS, portão CD11c + e analisar para CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) e pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.
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Representative Results
Um total de 7 4-6x10 células de MO são tipicamente isoladas a partir de fémures e tíbias de um 6-8 semanas de idade, de tipo selvagem C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totais BM estão manchadas com anticorpos PE-conjugada contra marcadores de linhagem (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, e MHC-II), anti -C-PerCP-Kit / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analisadas e classificadas com um classificador de células. A estratégia de triagem para CRE é mostrado na Figura 1. Tipicamente, 5x10 4 CLPs são obtidos a partir de um C57BL / 6 mouse. Para obter mais CLPs, células BM de 3-4 ratos podem ser combinadas e protocolo ajustado em conformidade antes da separação.
Após a co-cultura de 500 CLPs com 5.9x10 6 AC-6 células alimentadoras, células formadoras de área de paralelepípedos (CAFC) começam a aparecer por dia 04/03. Ao dia 8, pDCs de forma redonda e suspender aparecer no topo da CAFC (Figura 2A). O número de picos em torno d pDCsay 12-14 em que pDCs ponto de partida a apoptose após o seu pleno desenvolvimento, e os números começam a diminuir gradualmente. colónias CDC aparecem mais tarde do que colônias pDC, no dia 08/06, e a morfologia de CDCs são maiores, fusiforme, e aderente (Figura 2B).
Tipicamente, 5-6x10 células 4 pode ser gerado a partir de 500 CLPs após 2 semanas de co-cultura. Após a coloração as células com anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC e anti-B220-PE, a análise por fluxo mostra citometria de que a percentagem de pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) e CDCs (CD11c + CD11b + B220 - ) é de 91% e 6%, respectivamente (Figura 3). Portanto, com este método pode ser expandido pDCs tanto como 100 vezes.
Figura 1. estratégias Gating para CLPs. Células BM isolada de um rato foram coradas com anticorpos fluorescentes marcado e analisado para CLPs, que foram definidos como lin - c-Kit int Sca-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 2. Morfologia do CDC e pDC colônias na CLP-AC-6 co-culturas 500. CLPs foram co-cultivadas com AC-6 células de alimentação irradiadas-y, na presença de 100 ng / ml FL. (A) colônias PDC dia 8, 10 e 12, e (B) colônias CDC no dia 8, 12, e 16 foram fotografados sob microscopia de luz em 200 x (barra de escala de 50 mm). Por favor clique aqui para ver uma larger versão desta figura.
Figura 3. A análise de citometria de fluxo de pDCs CRE derivadas e CDCs. Quinhentos CLPs e AC-6 células alimentadoras irradiadas-y (5.9x10 4 / mL) foram co-cultivadas in vitro durante 12 dias na presença de FL (100 ng / mL ). As células foram coradas com anticorpo anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC, e anti-B220-PE e analisadas por citometria de fluxo. As células foram fechado no primeiro CD11c + e depois analisados para CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) e pDCs (CD11c + CD11b - B220 +). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para a geração robusta de DCs, e pDCs em particular, a partir de um pequeno número de CLPs. A singularidade deste sistema de cultura é devido ao uso de AC-6, células de uma linha celular de estroma, como alimentadores. Esta abordagem tem sido mostrado para fornecer não só as citocinas, tais como IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, mas também o contacto célula-célula 21, necessário para suportar o desenvolvimento DC. AC-6 células têm sido usados anteriormente para facilitar o estudo de desenvolvimento in vitro de várias células progenitoras DC 8,16,22. Descobrimos que é fundamental para semear uma densidade ideal de células AC-6 alimentadoras para suportar a diferenciação eficiente de pDCs de CLPs. Especificamente, semeando 5.9x10 4 irradiadas y-AC-6 em células de 12 poços em placas resultados confluência no dia seguinte, o qual é adequado para o desenvolvimento de PDC. A menor AC-6 densidade celular (3.9x10 4 / poço em 12 poços) tende a apoiar CDC development 24. Portanto, recomenda-se a primeira semente várias concentrações de AC-6 células, a fim de optimizar as condições quando escalar o sistema de cultura de 23. Além disso, é também importante que o AC-6 células ser escrupulosamente mantido, incluindo cuidadosa atenção ao número de passagens, e nunca permitiu atingir a confluência. Se for deixado lotados ou se o seu número de passagem é maior do que 20, estas células tendem a perder a capacidade para suportar hematopoiese in vitro. Além disso, a concentração de FL também afecta o desenvolvimento DC. Especificamente, em baixas doses (25-50 ng / ml) CDCs são preferencialmente desenvolvidos, enquanto a doses elevadas (100-200 ng / ml) pDCs são predominantemente 24 gerado. Além AC-6, a densidade celular e FL dosagem, selecção cuidadosa de um lote de FBS que suporta de forma eficiente desenvolvimento DC, neste sistema de cultura é essencial para o sucesso do processo.
Embora in vitro CDCs -derived e pDCs pode ser distinguished pelos seus marcadores de superfície, a saber, CD11c + CD11b + B220 - e CD11c + CD11b - B220 +, respectivamente, as suas morfologias também são discerníveis por microscopia. CDCs são maiores, em forma de fuso e são aderentes, enquanto pDCs são mais pequenos, em forma redonda e crescer em suspensão (Figura 2). A cinética de diferenciação DC também difere, com pDCs aparecer mais cedo e mais tarde CDCs. Além disso, o processo de desenvolvimento PDC é significativamente influenciado pela AC-6 com a densidade celular mais elevada densidade de AC-6 acelerando o processo de desenvolvimento. Deve notar-se que pDCs começam a morrer seguinte desenvolvimento completo e, portanto, a relação de CDCs contra pDCs neste sistema de cultura aumenta, gradualmente, em pontos de tempo posteriores. Assim, a monitorização periódica de desenvolvimento DC por citometria de fluxo e microscopia é altamente recomendada a fim de determinar quando pDCs começar a sofrer apoptose.
De nota, o describEd método também pode ser aplicado a outros progenitores de DC, tais como CDP; No entanto, a população principal DC gerado a partir destas células são CDCs 17, mesmo em altas densidades AC-6 ou doses FL. O baixo potencial pDC de CDPs é consistente com relatórios de diferentes grupos usando qualquer CDP-alimentador 11 ou 16 sistemas, dois sistemas de cultura in vitro diferentes livre-alimentador. Estes resultados sugerem que o sistema de alimentação de CA-6 pode reflectem exactamente o potencial de diferenciação de progenitores diferentes.
Os pDCs gerados a partir deste sistema de cultura são CD11c + CD11b - B220 +. Além disso, eles expressam níveis relativamente elevados de TCF4 (codifica E2-2) e RAG1, dois genes específicos do PDC, mas níveis mais baixos de Id2, um gene específico da CDC, do que 17 CDCs. Mesmo que estes pDCs falta Siglec-H e BST2, marcadores considerados característicos de pDCs murino, eles ainda são capazes de produzir níveis mais elevados de IFN-I do quefazer CDCs e upregulate CD86 quando infectados com o vírus da estomatite vesicular (VSV) 24. Isto sugere que estes pDCs, embora incompletamente diferenciado, são ainda funcionais. Além disso, já utilizada com sucesso este método para delinear um papel sinérgica de IFN-a e FL em desenvolvimento PDC CLPs 17, confirmando que esta técnica é útil para o estudo do desenvolvimento de DC.
Em conclusão, aqui apresentamos, um método simples, mas eficiente para gerar pDCs de um pequeno número de CLPs utilizando o AC-6 sistema de co-cultura alimentador, o que pode facilitar estudos de desenvolvimento ou funcionais de pDCs.
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Acknowledgments
Somos gratos a Drs. Markus Manz e Irving Weissman para a prestação de reagentes. Reconhecemos também o serviço prestado pela Citometria de Fluxo de Análise e Seleção celular Núcleo Facilidade da Primeira e Segunda laboratório central no National Taiwan University College of Medicine e NTU hospital, respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e os Institutos Nacionais de Investigação de Saúde, Taiwan (INDH-EX102-10256SI e INDH-EX103-10256SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
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