Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

In Vitro Generering av murine Plasmacytoid dendrittiske celler fra Common Lymfoid stamfedre bruker AC-6 Feeder System

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

Plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs) er kraftig type I interferon (IFN-I) produserende celler som aktiveres som respons på infeksjon eller ved inflammatoriske responser. Dessverre studie av PDC-funksjonen er hindret av deres lave frekvensen i lymfoide organer, og eksisterende metoder for in vitro DC generasjon overveiende favorisere produksjon av CDCs løpet PDCs. Her presenterer vi en unik tilnærming til effektivt å generere PDCs fra vanlige lymfoide stamfedre (CLPs) in vitro. Nærmere bestemt protokollen beskrevet detaljer hvordan man skal rense CLPs fra benmarg og generere PDCs ved coculturing med y-bestrålte AC-6 feeder-celler i nærvær av Flt3-ligand. En unik egenskap ved denne kulturen systemet er at CLPs migrere under AC-6 celler og bli brosteins området dannende celler, et avgjørende skritt for å utvide PDCs. Morfologisk forskjellige DC, nemlig PDCs og CDCS, ble generert etter ca 2 uker med en sammensetning av 70-90% PDCs under optimale forhold. Vanligvis er antallet PDCs som genereres ved denne fremgangsmåten omtrent 100 ganger av antall CLPs seeded. Derfor er det et nytt system som brukes til å generere robuste store antall PDCs som kreves for å legge til rette for ytterligere studier, og i utvikling og funksjon av disse cellene.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dendrittiske celler (DCS) er profesjonell antigen-presenterende celler som spiller en viktig rolle i å kontrollere en immunresponser. Mens DC er heterogene, de kan grovt deles inn i to populasjoner, konvensjonell DC (CDCS) og plasmacytoid DC (PDCs) 2,3. I tillegg til lymfoide organer, er CDCS og PDCs også funnet i vev innbefattende lunge, tarm, hud og 2. Morfologi CDCS og PDCs forskjellig, med CDCS utviser dendrite-lignende anslag og formen på PDCs blir mer plasma celle-lignende. I tillegg er det vanlig mus DC markør, CD11c, mer sterkt uttrykt på CDCS enn på PDCs. Videre kan CDCS videre deles inn CD11b + CD24 - CDCs og CD11b - CD24 + CDCS, som begge uttrykker høyere nivåer av MHC klasse II og samtidig stimulerende molekyler enn gjøre PDCs 2. Modne PDCs, på den annen side, har vist seg selektivt å uttrykke Siglec-H og BST2 4. Functionally, CDCS er bedre antigenpresenterende celler enn er PDCs; men kan PDCs produsere en enorm mengde av type I interferon på virus infeksjon eller inflammatorisk stimulering 5.

Begge CDCS og PDCs er kortvarige, og derfor må stadig etterfylles fra stamfedre i benmargen (BM) 6,7. Adoptiv overføring av felles myeloide stamceller (CMPS) og vanlige lymfoide progenitors (CLPs) inn lethally-bestrålte mus viser at CDCS og PDCs kan genereres fra begge linjene 8-10. Imidlertid er det en undergruppe av PDCs som uttrykker RAG1 / 2 og besitter rearrangerte DJ segmenter ved avIgH locus 11,12. Disse cellene deler også molekylære likheter med B-lymfocytter, inkludert uttrykk for B220 markør, nukleinsyre-sensing reseptorer (TLR7 / TLR9), og transkripsjonsfaktorer (SPIB og Bcl11a) 13, har alle antas å være underskrifter fra lymfoidlinjen. Derfor CLPs kan være gode valg for in vitro generasjon PDCs grunn av avstamning likheten.

Mens frekvensen av både CDCS og PDCs i mennesker og mus er meget lav 6, DC, særlig CDCS, kan genereres in vitro fra BM eller progenitorceller i nærvær av cytokiner, slik som GM-CSF 11,14 eller Flt3-ligand (FL ) bruker mater frie systemer 11,15,16. Dessverre er det imidlertid ikke mulig å fremstille et stort antall PDCs in vitro ved hjelp av FL 11,15,16. Tidligere har vi vist at PDCs effektivt kan genereres in vitro fra CLPs bruker AC-6 mater system 17. Fordelen med å bruke en AC-6 stromal cellelinjen i kultursystemet er at det gir celle-celle-kontakt og sekresjon av cytokiner som støtter generering av et stort antall PDCs fra CLPs. Selv om produksjonen med dette systemet er ganske robust, er forsiktig replikering av prosedyrene som er beskrevet nedenfor kreves in For å sikre effektiv generasjon PDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C57BL / 6 villtype mus ble kjøpt fra National Laboratory Animal Senter (NLAC), Taiwan. Alle mus ble avlet og holdt under patogenfrie forhold. Protokoller og dyr bruk prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité National Taiwan University College of Medicine (Permit Number: 20120075). I tillegg forskere har gjort vårt ytterste for å redusere potensialet for smerte, lidelse, eller nød i dyrene mens du utfører eksperimenter. Alle prosedyrer beskrevet ble utført ved RT med hansker.

1. Utarbeidelse av AC-6 Feeder celler

Merk: AC-6,21 (AC-6 i kort) stromal-cellelinje 18 (leveres av I. Weissman, Stanford University) opprettholdes i RPMI supplert med 15% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS). Å tjene som mater celler, AC-6 celler er γ-bestrålt med 3000 rad (30Gy) én dag før co-kultur for å hindre deres spredning. Note thved AC-6 celler har en tendens til å miste sin differensiering bærende evne hvis venstre befolket under vedlikehold, eller hvis deres passasje tallet er over 20.

  1. Vask AC-6 celler gang med 1 ml Dulbeccos Fosfat saltvann (DPBS) og fjern DPBS ved aspirasjon. Behandle AC-6-celler med 0,8 ml trypsin-oppløsning (0,05% trypsin og 0,5 mM EDTA i DPBS) i 3-5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2, og deretter stanse reaksjonen ved å fortynne den med 10 volumdeler kulturmedium til foreta enkel cellesuspensjon.
  2. Seed AC-6 celler på 5.9x10 4 celler / brønn i 12-brønners plater og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
    Merk: Tettheten av AC-6 celler er svært viktig som en lavere tetthet vil favorisere CDC generasjon. Poding med en tetthet på 5.9x10 4 celler / brønn vil tillate AC-6 for å oppnå konfluens ved neste dag, noe som er optimalt for avledning av PDCs fra CLPs.
  3. Bestråle AC-6 celler på 3000 rad (30 Gy) ved hjelp av γ-stråle.
    Notat: Den dose som brukes til å bestråle AC-6 er optimalisert for å hindre at celler fra prolifererende og likevel holde dem levedyktige lenge nok til å gi cytokiner og celle-celle-kontakt som er nødvendig for differensiering av DC fra CLPs.
  4. Aspirer medium og erstatte med 1 ml komplett RPMI (RPMI med 10% varme-inaktivert FBS, 50 ug / ml gentamycin og 50 uM β-merkaptoetanol).

2. Isolate BM Celler fra Mus

  1. Ofre mus ved CO 2 kvelning og halshugging. Plasser mus på en disseksjon skuffen og sterilisere med 70% etanol. Gjøre et snitt på midten av buken og fjerne huden fra den distale del av musen inkludert huden som dekker de nedre ekstremiteter.
  2. Dissekere mus i en semi-steril hette. For å frigjøre femur og tibia, klippet femur over og skinneben under kneleddet. Løsne musklene fra knoklene som bruker saks og plassere beina i en 6 cm petriskål inneholder 5 ml full RPMI.
  3. Flytte til et sterilt kultur hette. Fyll en 3 ml sprøyte som er koblet til en 27G nål med komplett RPMI. Skjær av begge endene av bein med saks, og sett inn 27G nål å spyle margen ut av knoklene ved forsiktig å injisere komplett RPMI gang fra hver ende.
  4. Fremstille en enkel cellesuspensjon ved forsiktig pipettering cellene opp og ned 3-5 ganger i kulturskålen ved hjelp av sprøyte uten nål.
  5. Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 x g, og dekanter supernatanten.
  6. Lyse røde blodceller med en ACK ml buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA) inkubering i 1 min og reaksjonen ble stanset ved fortynning med 10 volumdeler komplett RPMI. Tillate celler å stå i 5 minutter for å pelletere ned døde celleklumper og vevsrester av tyngdekraften.
    Merk: Ikke stå mer enn 5 min, da dette vil resultere i celle tap på grunn av bosetting av levedyktige celler.
  7. Sakte dekantering celle-inneholdende supernatant til et nytt rør forlater ruskbak i det opprinnelige rør.
  8. Sentrifuger i 5 min ved 500 xg til pellet cellene, og ta ut og kast supernatanten.
  9. Suspender totale BM-celler (typisk 4-6 x 10 7 BM-celler oppnådd fra en mus) i 100 ul FACS-buffer (1 x PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA).

3. FACS Analyse og sortering av CLPs

  1. Legg anti-CD16 / 32 (hybridoma supernatanten klon 2.4G2, 50 ul / reaksjon eller 1-2 ug / reaksjon) inn i celler i FACS-buffer (trinn 2.9) i 1-2 min for å blokkere Fc-reseptorer.
    Merk: Anti-CD16 / 32 kalles også som tilsettes for å hindre ikke-spesifikk binding av antistoff til celler som uttrykker Fc-reseptorer, inkludert granulocytter, monocytter og B-lymfocytter Fc blokk,.
  2. Samtidig flekker celler med følgende fluorescerende fargestoff-merkede antistoffer (for 4x10 7 celler) for 15 min på is, unngå ambient lys. Antistoffer: PE-konjugerte avstamning markører (0,2 ug hver) med anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53 til 6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), og anti-MHC-II (Nimr-4), 0,2 ug anti-c-kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 ug anti-M-CSFR-APC (AFS98), og 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. Vask cellene med 3 ml FACS-buffer, og sentrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  4. Resuspender celler i 300 ul FACS-buffer og filter cellene gjennom et 40 um cellefilter.
  5. Vask røret med en ytterligere 100 ul FACS-buffer for å gjenvinne eventuelle gjenværende celler og filter inn i en steril FACS sortering av røret ved hjelp av den samme cellefilter.
  6. Flowcytometrisk analyse utføre umiddelbart etter fargingen ved hjelp av egnede filtre og spenninger for signaldeteksjon. Bruk 488 nm laser for å oppdage FITC-, PerCP-Cy5.5-merkede antistoffer, 561 nm laser til å oppdage PE og PE-Cy7-labelded antistoffer og 633 nm laser å detektere APC-merkede antistoff.
  7. Sortere ut CLPs i henhold til følgende markører lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (beiset som i trinn 3.2) ved hjelp av en celle-sorterer. Samle de sorterte cellene i et 15 ml rør inneholdende 8 ml RPMI komplett som en pute.
  8. Opp det absolutte antall sorterte cellene, som vist ved cellesorterer ved slutten av kjøringen. Vanligvis kan 5x10 4 CLPs fås fra BM av ett muse.

4. coculture CLPs og AC-6

  1. Sentrifuger sorterte cellene fra trinn 3,7 i 10 minutter ved 500 xg, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med nok komplett RPMI for å oppnå en celletetthet rundt 5x10 4 celler / ml. Seed 500 celler / brønn inn i 12-brønns plate som inneholder mater celler fremstilt i trinn 1.4.
  2. Tilsett 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig generert i huset ved hjelp av et uttrykk system levert av M. Manz, University Hospital Zürich, Sveits) og inkuberes ved 37 o C, 5% CO 2 med periodisk visuell overvåking av DC utvikling under et mikroskop.
    Note: Kommersielt tilgjengelig rekombinant human eller mus FL FL kan brukes som en erstatning for hu-Flt3L-Ig for å støtte DC utvikling.
  3. Samle cellene i supernatanten på dag 12 og vaske brønnene en gang med 0,5 ml RPMI-medium full å kombinere de resulterende supernatanter. Legg 0,5 ml friskt medium og skrap de adherente celler med en celle skrape.
  4. Kombiner det celleholdige medium fra begge deler, og sentrifuger i 5 minutter ved 500 x g.
  5. Dekanter supernatanten og resuspender cellene i 50 ul FACS-buffer. Tilsett 50 ul anti-CD16 / 32 hybridomsupernatant og inkuberes i 1-2 minutter for å blokkere Fc-reseptorer.
  6. Nummerere og beis alle cellene med følgende antistoffer (0,05 mikrogram hver) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC, og anti-B220-PE.
  7. Vask og sentrifuger cellene som beskriverd i trinn 3,3.
  8. Suspender cellene i 100 ul FACS buffer, gate på CD11c + og analysere for CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) og PDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Totalt 7 BM 4-6x10 celler blir vanligvis isolert fra lårben og skinneben over en 6-8 ukers gamle, villtype C57BL / 6 mus. Å sortere ut CLPs er samlede BM celler farget med PE-konjugerte antistoffer mot avstamning markører (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, og MHC-II), anti c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC og anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analyseres og sorteres med en celle-sorterer. Sorterings strategi for CLP er vist i figur 1. Vanligvis blir 5x10 4 CLPs oppnådd fra en C57BL / 6 mus. For å få mer CLPs, kan BM celler fra 3-4 mus kombineres og protokoll justeres tilsvarende før sortering.

Etter coculture av 500 CLPs med 5.9x10 6 AC-6 mater celler, brosteins området dannende celler (CAFC) begynner å dukke opp etter dag 3-4. Etter dag 8, runde-formet PDCs vises og suspendere på toppen av CAFC (Figur 2A). Antallet PDCs topper rundt day 12-14 på hvilket punkt PDCs begynner å gjennomgå apoptose følge deres fulle utvikling, og tallene begynner å gradvis avta. CDC kolonier vises senere enn PDC kolonier på dag 6-8, og morfologien av CDCS er større, spindellignende, og tilhenger (figur 2B).

Vanligvis kan 5-6x10 fire celler genereres fra 500 CLPs etter 2 uker med coculture. Etter farging av cellene med anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC og anti-B220-PE, analyse ved flowcytometri viser at prosentandelen av PDCs (CD11c + CD11b - B220 +) og CDCS (CD11c + CD11b + B220 - ) er 91% og 6%, respektivt (figur 3). Derfor, med denne metoden PDCs kan utvides så mye som 100 ganger.

Figur 1
Figur 1. gating strategier for CLPs. BM celler isones fra ett muse ble farget med fluoresceinmerkede antistoffer og analysert for CLPs, som ble definert som lin - c-Kit int Sca-en int M-CSFR -. IL-7Rα + Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Figur 2
Figur 2. Morfologi av cdc og PDC kolonier i CLP-AC-6 cocultures. 500 CLPs ble cocultured med y-bestrålte AC-6 feeder-celler i nærvær av 100 ng / ml FL. (A) PDC kolonier på dag 8, 10 og 12, og (B) CDC kolonier på dag 8, 12 og 16 ble fotografert under lett mikroskopi på 200 x (skala bar 50 mikrometer). Klikk her for å se en largeh versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3. Strømningscytometrisk analyse av CLP-avledede PDCs og CDCS. Fem hundre CLPs og y-bestrålte AC-6 feeder-celler (5.9x10 4 / ml) ble cocultured in vitro i 12 dager i nærvær av FL (100 ng / ml ). Cellene ble farget med anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC, og anti-B220-PE og analysert ved flow-cytometri. Celler ble først inngjerdet på CD11c + og deretter analysert for CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) og PDCs (CD11c + CD11b - B220 +). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her beskriver vi et in vitro kultursystem for robust generering av DC, og PDCs spesielt fra et lite antall CLPs. Det unike med dette kultursystem er på grunn av bruk av AC-6-celler, en cellelinje stromal, som forer. Denne metoden har vist seg å tilveiebringe ikke bare cytokiner, slik som IL-7, SCF, M-CSF, og FL 20, men også den celle-celle-kontakt 21 er nødvendig for å understøtte utvikling DC. AC-6 celler har blitt brukt tidligere for å lette studiet av in vitro DC utvikling fra flere stamfedre 8,16,22. Vi har funnet at det er kritisk å pode en optimal tetthet av AC-6 feeder-celler for å understøtte effektiv differensiering av PDCs fra CLPs. Nærmere bestemt, såing 5.9x10 4 y-bestrålt AC-6-celler i 12-brønners plater resulterer i konfluens neste dag, som er egnet for PDC utvikling. En lavere AC-6 celletetthet (3.9x10 4 / brønn i 12-brønners plate) har en tendens til å støtte CDC development 24. Derfor anbefales det å først frø flere konsentrasjoner av AC-6-celler for å optimalisere forholdene når oppskalering av kultursystemet 23. Videre er det også viktig at AC-6 celler bli samvittighetsfullt vedlikeholdt, blant annet nøye med passering nummer, og aldri lov til å nå confluency. Hvis venstre fylt eller hvis deres passasje antallet er større enn 20, er disse celler har en tendens til å miste evnen til å understøtte in vitro hematopoiesis. I tillegg er konsentrasjonen av FL påvirker også DC-utvikling. Spesielt, ved lave doser (25-50 ng / ml) CDCS er fortrinnsvis utviklet, mens ved høye doser (100-200 ng / ml) PDCs kommer hovedsakelig 24. I tillegg til AC-6 celletetthet og FL dosering, er nøye utvalg av en gruppe med FBS som effektivt støtter DC utvikling i denne kulturen systemet sentralt for å lykkes i prosedyren.

Mens in vitro-avledede CDCS og PDCs kan være distinguished av sine overflatemarkører, nemlig CD11c + CD11b + B220 - og CD11c + CD11b - B220 + henholdsvis deres morfologi er også merkbar ved mikroskopi. CDCS er større, spindelformet og er vedheftende, mens PDCs er mindre, rund-formet og vokse i suspensjon (figur 2). Kinetikken DC differensiering skiller seg også, med PDCs vises tidligere og CDCS senere. I tillegg er prosessen av PDC utvikling signifikant påvirket av AC-6 celletetthet med høyere AC-6 tetthet påskynde utviklingsprosess. Det bør bemerkes at PDCs begynner å dø etter fullstendig utvikling og dermed forholdet mellom CDCS versus PDCs i dette kultursystem gradvis øker ved senere tidspunkter. Derfor blir periodisk monitorering av DC utvikling ved mikroskopi og flowcytometri sterkt anbefalt for å bestemme når PDCs begynner å gjennomgå apoptose.

Av notatet, den described metoden kan også anvendes på andre DC-forløpere, slik som CDPs; Men den viktigste DC befolkningen som genereres fra disse cellene er CDCS 17, selv ved høye AC-6 tettheter eller FL doser. Den lave PDC potensialet i CDPs er konsistent med rapporter fra ulike grupper som bruker enten CDP-feeder 11 eller mater-fri 16 systemer, to forskjellige in vitro kultur-systemer. Disse resultatene tyder på at AC-6 matesystem kan trofast reflektere differensiering potensialet av forskjellige forløpere.

De PDCs genereres fra denne kulturen systemet er CD11c + CD11b - B220 +. Videre må de uttrykke relativt høye nivåer av Tcf4 (koder E2-2) og Rag1, to PDC-spesifikke gener, men lavere nivåer av ID2, en CDC-spesifikt gen, enn de CDCS 17. Selv om disse PDCs mangler Siglec-H og BST2, markører anses karakteristisk for murine PDCs, de er fortsatt i stand til å produsere høyere nivåer av IFN-I enngjøre CDCS og oppregulere CD86 når infisert med vesikulær stomatitt virus (VSV) 24. Dette tyder på at disse PDCs, selv om ufullstendig differensiert, er fortsatt funksjonell. Videre har vi allerede har brukt denne metoden til å avgrense en synergistisk rolle for IFN-I og FL i PDC utvikling fra CLPs 17, noe som bekrefter at denne teknikken er verdifull for studiet av DC-utvikling.

Som konklusjon, her presenterer vi en enkel, men effektiv metode for å generere PDCs fra et lite antall CLPs ved hjelp av AC-6 mater coculture system, noe som kan lette utvikling eller funksjonelle studier av PDCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for legene. Markus Manz og Irving Weissman for å gi reagenser. Vi erkjenner også tjenesten leveres av Flowcytometriske Analyse og Cell Sorting Kjerne Facility av første og andre Kjernelaboratoriet ved National Taiwan University College of Medicine og NTU sykehus, henholdsvis. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (MEST 102-2320-B-002-030-My3) og National Health Research Institutes, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI og NHRI-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
<em>In Vitro</em> Generering av murine Plasmacytoid dendrittiske celler fra Common Lymfoid stamfedre bruker AC-6 Feeder System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter