Abstract
Células dendríticas plasmacitoides (PDC) son potentes interferón de tipo I (células productoras de IFN-I) que se activan en respuesta a la infección o durante las respuestas inflamatorias. Por desgracia, el estudio de la función PDC se ve obstaculizada por su baja frecuencia en los órganos linfoides, y los métodos existentes para la generación in vitro DC favorecen predominantemente la producción de los CDC sobre PDC. Aquí presentamos un enfoque único para generar eficientemente PDC de progenitores linfoides comunes (CLPS) in vitro. Específicamente, el protocolo descrito detalles cómo purificar CLPs desde la médula ósea y generar PDC por cocultivo con AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado en presencia de ligando de Flt3. Una característica única de este sistema de cultivo es que los CLPs migran por debajo de las células AC-6 y se convierten en células de adoquines en la zona de formación de, un paso crítico para la expansión de PDC. Morfológicamente distintos países en desarrollo, a saber, PDC y CDC, se generaron después de aproximadamente 2 semanas con una composición de 70-90% PDC en condiciones óptimas. Típicamente, el número de PDC generados por este método es más o menos 100 veces del número de CLPs sembradas. Por lo tanto, este es un sistema novedoso con el que para generar robustamente el gran número de PDC necesarias para facilitar estudios adicionales en el desarrollo y la función de estas células.
Introduction
Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno profesionales que desempeñan un papel importante en el control de las respuestas inmunitarias 1. Mientras que los países en desarrollo son heterogéneos, que se pueden clasificar en dos poblaciones, convencional DC (CDC) y los DC plasmocitoides (PDC) 2,3. Además de los órganos linfoides, CDCs y PDC también se encuentran en tejidos incluyendo pulmón, intestino, piel y 2. La morfología de los CDC y PDC difiere, con CDC expositoras proyecciones dendríticas como y la forma de PDC son como células más plasma. Además, el marcador DC ratón común, CD11c, está más altamente expresado en CDC que en PDC. Por otra parte, CDC puede ser dividida en CD11b + CD24 - CDC y CD11b - CD24 + CDC, los cuales expresan mayores niveles de MHC de clase II y moléculas coestimuladoras que hacen PDC 2. PDC maduros, por otro lado, se ha demostrado para expresar selectivamente Siglec-H y BST2 4. Functionally, CDCs son mejores células presentadoras de antígenos que son PDC; sin embargo, PDC pueden producir una gran cantidad de interferón de tipo I sobre la infección por el virus o la estimulación inflamatoria 5.
Ambos CDC y PDC son de corta duración, y por lo tanto, deben ser constantemente repuestos de progenitores dentro de la médula ósea (MO) 6,7. La transferencia adoptiva de células progenitoras mieloides comunes (CMPS) y progenitores linfoides comunes (CLPS) en ratones letalmente irradiados demuestra que CDCs y PDC pueden ser generados a partir de ambos linajes 8-10. Sin embargo, no es un subconjunto de PDC que expresan RAG1 / 2 y poseen segmentos DJ reordenados el locus IgH en 11,12. Estas células también comparten similitudes moleculares con linfocitos B, incluyendo la expresión del marcador B220, los receptores de ácido nucleico de detección (TLR7 / TLR9), y factores de transcripción (SPIB y BCL11A) 13, todas las características que se cree firmas del linaje linfoide. Por lo tanto, CLPs pueden ser buenas opciones para la generación in vitro de PDC, debido a la similitud linaje.
Si bien la frecuencia de ambos CDCs y PDC en humanos y ratones es muy baja 6, países en desarrollo, en particular los CDC, se puede generar in vitro a partir BM o progenitores en presencia de citoquinas, tales como GM-CSF 11,14 o ligando Flt3 (FL ) utilizando sistemas de alimentación libre de 11,15,16. Desafortunadamente, sin embargo, no es posible producir un gran número de PDC in vitro utilizando FL 11,15,16. Anteriormente hemos demostrado que la PDC se pueden generar de manera eficiente in vitro a partir CLPs utilizando el sistema de alimentación AC-6 17. La ventaja de usar la línea celular estromal AC-6 en el sistema de cultivo es que proporciona contacto célula-célula y la secreción de citocinas que soportan la generación de un gran número de PDC de CLPs. Aunque la producción con este sistema es bastante robusto, i se requiere la replicación cuidadosa de los procedimientos descritos a continuaciónorden n para asegurar la generación eficiente de PDC.
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Protocol
C57BL / 6 ratones de tipo salvaje se compraron desde el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (NLAC), Taiwán. Todos los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos. Protocolos y procedimientos de uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Nacional de Taiwán Colegio de Medicina (Número de Permiso: 20120075). Además, los investigadores hicieron todo lo posible para reducir el potencial de dolor, sufrimiento o angustia en los animales, mientras que la realización de experimentos. Todos los procedimientos descritos se llevaron a cabo a temperatura ambiente, mientras que el uso de guantes.
1. Preparación de 6-CA células Feeder
Nota: El AC-6,21 (AC-6 en corto) línea celular estromal 18 (proporcionado por Weissman I., Universidad de Stanford) debe mantenerse en RPMI suplementado con suero inactivado por calor 15% bovino fetal (FBS). Para servir como células alimentadoras, AC-6-γ células son irradiadas con 3000 rad (30 Gy) un día antes de que el co-cultivo para evitar su proliferación. Nota ªAC-6 células tienden a perder su capacidad de diferenciación de apoyo si se deja de hacinamiento durante el mantenimiento, o si su número pasaje es más de 20.
- Wash AC-6 células una vez con 1 ml de fosfato solución salina tamponada de Dulbecco (DPBS) y quitar DPBS por aspiración. Tratar AC-6 células con 0,8 ml de solución de tripsina (0,05% de tripsina y EDTA 0,5 mM en DPBS) durante 3-5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego se detiene la reacción mediante la dilución con 10 volúmenes de medio de cultivo a hacer suspensión de células individuales.
- Semilla AC-6 células en 5.9x10 4 células / pocillo en placas de 12 pocillos y se incuban a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N.
Nota: La densidad del AC-6 células es muy importante ya que una menor densidad favorecerá la generación de los CDC. La siembra a una densidad de 5.9x10 4 células / pocillo permitirán AC-6 para llegar a la confluencia al día siguiente, que es óptima para la derivación de PDC de CLPs. - Irradiar AC-6 células a 3000 rad (30 Gy) utilizando γ-irradiador.
Nota: La dosis utilizada para irradiar AC-6 está optimizado para evitar que las células proliferen y, sin embargo mantenerlos viables tiempo suficiente para proporcionar las citoquinas y contacto célula-célula necesarios para la diferenciación de los países en desarrollo de CLPs. - Aspirar medio y reemplazar con 1 ml de RPMI completo (RPMI con inactivado por calor 10% de FBS, 50 mg / ml de gentamicina y 50 mM β-mercaptoetanol).
2. Las células Isolate BM a partir de ratones
- Sacrificar los ratones por asfixia con CO2 y dislocación cervical. Coloque los ratones en una bandeja de disección y esterilizar con etanol al 70%. Hacer una incisión en la mitad del abdomen y retirar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades inferiores.
- Diseccionar los ratones en una campana semi-estéril. Para liberar el fémur y la tibia, cortar el fémur arriba y tibias por debajo de la articulación de la rodilla. Separar los músculos de los huesos utilizando tijeras y colocar los huesos en una placa de Petri de 6 cm que contiene 5 ml de RPMI completo.
- Mover a una campana de cultivo estéril. Llene una jeringa de 3 ml conectada a una aguja 27G con RPMI completo. Cortar los dos extremos de los huesos con unas tijeras, e inserte la aguja 27G para limpiar la médula de los huesos inyectando suavemente RPMI completo una vez desde cada extremo.
- Preparar una suspensión de células por pipeteo suave de las células arriba y abajo de 3-5 veces en la placa de cultivo utilizando la jeringa sin la aguja.
- Centrifugar las células durante 5 min a 500 xg y decantar el sobrenadante.
- Lisar células rojas de la sangre con 1 ml de tampón ACK (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM) incubando durante 1 min y detener la reacción diluyendo con 10 volúmenes de RPMI completo. Permitir que las células en reposo durante 5 minutos con el fin de precipitar por grupos de células muertas y restos de tejido por la gravedad.
Nota: No se pare más de 5 minutos ya que esto dará lugar a la pérdida de células debido a la sedimentación de células viables. - Lentamente decantar el sobrenadante que contiene células a un nuevo tubo de escombros dejandoatrás en tubo original.
- Centrifugar durante 5 minutos a 500 xg para sedimentar las células, a continuación, retirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células totales BM (típicamente 4-6 x 10 7 BM células se obtienen de un ratón) en 100 l de tampón FACS (PBS 1x + 2% de FBS + 1 mM EDTA).
3. FACS análisis y clasificación de CLPs
- Añadir anti-CD16 / 32 (clon de hibridoma sobrenadante 2.4G2, 50 l / reacción ó 1-2 g / reacción) en las células en tampón FACS (paso 2.9) durante 1-2 min con el fin de bloquear los receptores de Fc.
Nota: Anti-CD16 / 32 también se denomina bloque de Fc, que se añade para evitar la unión no específica de anticuerpos a células que expresan receptores de Fc, incluyendo los granulocitos, monocitos y linfocitos B. - Simultáneamente teñir las células con los siguientes anticuerpos marcados con colorante fluorescentes (por 4x10 7 células) durante 15 min en hielo, evitando la luz ambiente. Anticuerpos: marcadores de linaje PE-conjugados (0,2 g cada uno) incluyendo anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), y anti-MHC-II (RMIN-4), 0,2 g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 g anti-M-CSFR-APC (AFS98), y 0,2 g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Lavar las células con 3 ml de tampón FACS, y centrifugar durante 5 min a 500 x g.
- Resuspender las células en 300 L de tampón FACS y celdas de filtración a través de un filtro de células 40 M.
- Lave el tubo con un tampón adicional 100 l FACS para recuperar las células restantes y filtrar en un tubo estéril FACS de clasificación utilizando el mismo filtro de células.
- Realizar análisis de citometría de flujo inmediatamente después de la tinción utilizando filtros y tensiones adecuadas para la detección de señales. Utilice 488 nm láser para detectar los anticuerpos marcados con PerCP-Cy5.5 FITC,, 561 nm láser para detectar el PE y los anticuerpos PE-Cy7 labelded y 633 nm laser para detectar el anticuerpo marcado con APC.
- Clasificar CLPs de acuerdo con los siguientes marcadores lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (como manchado en el paso 3.2) utilizando un clasificador de células. Recoger las células clasificadas en un tubo de 15 ml que contiene 8 ml de RPMI completo como un colchón.
- Registre el número absoluto de células clasificadas como se muestra por el clasificador de células al final de la carrera. Típicamente, 5x10 4 CLPs se pueden obtener de la BM de un ratón.
4. cocultivo CLPs y AC-6
- Centrifugar las células clasificadas desde el paso 3.7 durante 10 minutos a 500 x g, separar el sobrenadante y resuspender el botón celular suficiente RPMI completo para obtener una densidad celular alrededor de 5x10 4 células / ml. Seed 500 células / pocillo en la placa de 12 pocillos que contiene células alimentadoras preparados en el paso 1.4.
- Añadir 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig generado en la casa usando un sistema de expresión proporcionado por M. Manz, UniversiHospital de Ty Zürich, Suiza) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 con el monitoreo visual periódica del desarrollo DC bajo un microscopio.
Nota: disponible comercialmente FL humana recombinante o el ratón FL se pueden utilizar como un sustituto para hu-Flt3L-Ig para apoyar el desarrollo DC. - Recoger las células en el sobrenadante a 12 días y lavar los pocillos una vez con 0,5 ml de medio RPMI completar la combinación de los sobrenadantes resultantes. Añadir 0,5 ml de medio fresco y desechar las células adherentes con un raspador de células.
- Combinar el medio que contiene células de ambas partes y centrifugar durante 5 min a 500 x g.
- Sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS Decantar 50 l. Añadir 50 l anti-CD16 / 32 hibridoma sobrenadante y se incuba durante 1-2 minutos para bloquear los receptores Fc.
- Enumerar y manchar todas las células con los siguientes anticuerpos (0,05 g cada uno) anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC y anti-B220-PE.
- Lavar y centrifugar las células como describird en el paso 3.3.
- Resuspender las células en 100 l de tampón FACS, puerta de CD11c + y analizar para el CDC (CD11c + CD11b + B220 -) y PDC (CD11c + CD11b - B220 +) 17.
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Representative Results
Un total de 4-6x10 7 células BM normalmente están aislados de los fémures y tibias de un solo 6/8 semanas de edad, de tipo salvaje C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totales BM se tiñeron con anticuerpos conjugados con PE contra marcadores de linaje (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, y MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC y anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizados y ordenados con un clasificador de células. La estrategia de clasificación de CLP se muestra en la Figura 1. Típicamente, 5x10 4 CLPs se obtienen a partir de un ratón C57BL / 6. Para obtener más CLPs, las células BM a partir de 3-4 ratones se pueden combinar y ajustar en consecuencia el protocolo antes de la clasificación.
Tras el cocultivo de 500 CLPs con 5.9x10 6 AC-6 células alimentadoras, las células de la zona de formación de adoquines (CAFC) comienzan a aparecer por día 3-4. Por día 8, PDC de forma redonda aparecen y suspenden en la parte superior de la CAFC (Figura 2). El número de PDC picos alrededor day 12 a 14 en el cual PDC punto comienzan a sufrir apoptosis después de su pleno desarrollo, y los números comienzan a disminuir gradualmente. colonias CDC aparecen más tarde de colonias PDC, en el día 6-8, y la morfología de los CDC son más grandes, huso-como, y adherente (Figura 2B).
Típicamente, 5-6x10 4 células pueden ser generados a partir de 500 CLPs después de 2 semanas de cocultivo. Después de la tinción de las células con anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC y anti-B220-PE, el análisis por flujo muestra citometría de que el porcentaje de PDC (CD11c + CD11b - B220 +) y CDC (CD11c + CD11b + B220 - ) es 91% y 6%, respectivamente (Figura 3). Por lo tanto, con este método PDC se pueden expandir tanto como 100 veces.
Figura 1. Estrategias de compuerta para CLPs. Células BM isoRELAClONADAS de un ratón se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia y se analizaron para CLPs, que fueron definidos como lin - c-Kit int Sca-1 int M-RFCE -. IL-7Rα + Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 2. Morfología de colonias CDC y PDC en CLP-AC-6 cocultivos. 500 CLPs se cocultivaron con AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado en presencia de 100 ng / ml FL (A) colonias PDC en el día 8, 10. y 12, y (B) colonias CDC en días 8, 12 y 16 fueron fotografiados con microscopía de luz a 200 x (barra de escala 50 micras). Haga clic aquí para ver una larger versión de esta figura.
Figura 3. Flujo análisis de citometría de PDC derivados-CLP y CDC. Quinientos CLPs y AC-6 células alimentadoras gamma-irradiado (5.9x10 4 / ml) se cocultivaron in vitro durante 12 días en presencia de FL (100 ng / ml ). Las células se tiñeron con anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC y anti-B220-PE y se analizaron por citometría de flujo. Las células fueron cerrada por primera vez en CD11c + y luego analizados por los CDC (CD11c + CD11b + B220 -) y PDC (CD11c + CD11b - B220 +). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí se describe un sistema de cultivo in vitro para la generación de DCs robusta, y PDC, en particular, a partir de un pequeño número de CLPs. La singularidad de este sistema de cultivo se debe a la utilización de AC-6 células, una línea celular estromal, como alimentadores. Este enfoque ha sido demostrado para proporcionar no sólo las citoquinas, tales como IL-7, SCF, M-CSF y FL 20, sino también el contacto célula-célula 21 necesario para apoyar el desarrollo DC. AC-6 células se han utilizado previamente para facilitar el estudio de desarrollo in vitro de DC de varios progenitores 8,16,22. Hemos encontrado que es crítico para sembrar una densidad óptima de células AC-6 alimentadoras para apoyar la diferenciación eficiente de PDC de CLPs. Específicamente, la siembra de 5.9x10 4 AC-6-gamma células irradiadas en 12 placas de pocillos resultados en la confluencia al día siguiente, que es adecuado para el desarrollo de PDC. Un AC-6 densidad celular baja (3.9x10 4 / pocillo en placas de 12 pocillos) tiende a apoyar CDC development 24. Por lo tanto, se recomienda primera semilla varias concentraciones de AC-6 células con el fin de optimizar las condiciones cuando la ampliación del sistema de cultivo 23. Por otra parte, también es importante que las células AC-6 mantenerse escrupulosamente, incluyendo una cuidadosa atención a número de pases, y nunca les permite alcanzar la confluencia. Si se deja de hacinamiento o si su número de paso es mayor que 20, estas células tienden a perder la capacidad de soportar la hematopoyesis in vitro. Además, la concentración de FL también afecta el desarrollo DC. Específicamente, a dosis bajas (25-50 ng / ml) CDCs se desarrollan preferentemente, mientras que a dosis altas (100-200 ng / ml) PDC se generan predominantemente 24. Además de AC-6 densidad celular y FL dosificación, la selección cuidadosa de un lote de FBS que soporta de manera eficiente el desarrollo de DC en este sistema de cultivo es fundamental para el éxito del procedimiento.
Mientras in vitro CDC -derivado y PDC pueden ser disdistinguen por sus marcadores de superficie, es decir, CD11c + CD11b + B220 - y CD11c + CD11b - B220 +, respectivamente, sus morfologías también son discernibles por microscopía. CDCs son más grandes, en forma de huso y son adherentes, mientras PDC son más pequeñas, redondas y en forma de crecer en suspensión (Figura 2). La cinética de la diferenciación DC también difiere, con PDC aparece más temprano y CDC después. Además, el proceso de desarrollo PDC es influenciada significativamente por AC-6 densidad celular con una mayor densidad de AC-6 acelerar el proceso de desarrollo. Cabe señalar que PDC empiezan a morir después de desarrollo completo y, por tanto, la relación de CDC frente a PDC en este sistema de cultivo aumenta gradualmente en puntos de tiempo posteriores. Por lo tanto, el control periódico del desarrollo DC por microscopía y citometría de flujo es altamente recomendado con el fin de determinar cuándo PDC comienzan a sufrir apoptosis.
Es de destacar que la described método también se puede aplicar a otros progenitores de DC, tales como CDP; sin embargo, la población principal de CC generada a partir de estas células son CDC 17, incluso a altas AC-6 densidades o dosis FL. El bajo potencial pDC del CDP es consistente con los informes de los diferentes grupos que utilizan ya sea CDP-alimentador de 11 o 16 sistemas, dos sistemas de cultivo diferentes in vitro-alimentador gratuita. Estos resultados sugieren que el sistema de alimentación AC-6 puede reflejar fielmente el potencial de diferenciación de progenitores diferentes.
Los PDC generados a partir de este sistema de cultivo son CD11c + CD11b - B220 +. Por otra parte, expresan niveles relativamente altos de TCF4 (codifica E2-2) y Rag1, genes específicos de dos pDC, pero los niveles más bajos de Id2, un gen CDC-específica, que lo hacen CDCs 17. A pesar de que estos carecen de PDC Siglec-H y BST2, marcadores considerados característicos de PDC murinos, todavía son capaces de producir niveles más altos de IFN-I dehacer CDCs y upregulate CD86 cuando se infectan con el virus de la estomatitis vesicular (VSV) 24. Esto sugiere que estos PDC, aunque diferenciado de forma incompleta, siguen siendo funcionales. Por otra parte, ya hemos utilizado con éxito este método para delinear un papel sinérgico de IFN-I y FL en el desarrollo de pDC CLPs 17, confirmando que esta técnica es valiosa para el estudio del desarrollo DC.
En conclusión, aquí presentamos un sencillo, pero eficiente, el método para generar PDC de un pequeño número de CLPs utilizando el sistema de co-cultivo de alimentación AC-6, lo que puede facilitar los estudios de desarrollo o funcionales del PDC.
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Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a los Dres. Markus Manz y Irving Weissman para proporcionar reactivos. También reconocemos el servicio prestado por el análisis de citometría de flujo y Cell Sorting Core Instalación de la Primera y Segunda Laboratorio Core en la Universidad Nacional de Taiwán Facultad de Medicina y Hospital NTU, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) y los Institutos Nacionales de Investigación de la Salud, Taiwán (INDH-EX102-10256SI y INDH-EX103-10256SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | linage marker |
| Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | linage marker |
| Anti-mouse CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | linage marker |
| Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | linage marker |
| Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | linage marker/FACS |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | linage marker |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | linage marker |
| Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | linage marker |
| Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | linage marker |
| Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | linage marker |
| Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| FACS sorting tube | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Flow analysis sofrware |
References
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