Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

doi: 10.3791/53211 Published: November 23, 2015

Abstract

Plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) I enfeksiyona veya enflamatuar yanıtlar sırasmda yanıt olarak aktive olmuş (IFN-I) üreten hücreler interferon güçlü bir tipidir. Ne yazık ki, pDC fonksiyonunun çalışma lenfoid organlarda düşük frekansta tarafından engellenmektedir, in vitro DC nesil için mevcut yöntemler ağırlıklı pDC'lerde üzerinde CDCS üretimini tercih. İşte biz verimli in vitro ortak lenfoid atalarıdır (CLPs) den PDC oluşturmak için benzersiz bir yaklaşım sunuyoruz. Spesifik olarak, iletişim kuralı, kemik iliğinden CLPs arındırmak ve Flt3 ligand mevcudiyetinde γ-ışınlanmış AC-6 besleyici hücreler ile coculturing ile PDC oluşturmak için nasıl ayrıntıları açıklanan. Bu kültür sisteminin benzersiz özelliği CLPs AC-6 hücreleri altında göç ve Arnavut kaldırımlı alan oluşturan hücreler, PDC genişletilmesi için kritik bir adım haline olmasıdır. Morfolojik olarak farklı DCler, yani PDC ve CDCS 7, bir bileşim ile yaklaşık 2 hafta sonra elde edildiOptimal koşullarda% 0-90 PDC. Tipik olarak, bu yöntemle üretilen pDC'lerde sayısı kabaca tohumlu CLPs sayısı 100 mislidir. Bu nedenle, bu sağlam bu hücrelerin gelişimi ve fonksiyonu içine daha ileri çalışmalar kolaylaştırmak için gereklidir pDC'lerde sayıda üretmek için hangi yeni bir sistemdir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dendritik hücreler (DC) bağışıklık tepkilerini 1 kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır profesyonel antijen sunan hücrelerdir. DH'ler, heterojen olsa da, genel olarak iki popülasyon olarak sınıflandırılabilir, konvansiyonel DCler (CDCS) ve plazmasitoid DCler (PDC) 2,3. Lenfoid organlara ek olarak, CDCS ve PDC aynı zamanda, akciğer, bağırsak, deri 2 dahil olmak üzere dokuların bulunurlar. CDCS ve pDC'lerde morfolojisi dendrit gibi projeksiyonlar ve daha plazma hücre benzeri olma pDC'lerde şeklini gösteren CDCS ile farklıdır. Buna ek olarak, ortak bir fare DC markör, CD11c, daha çok pDC'lerde göre daha CDCS üzerinde ifade edilir. PDC 2 için, MHC sınıf II yüksek seviyeleri ve kostimülatör moleküller, her ikisi de CD24 + CDCS, - CDCS ve CD11b - Ayrıca, CDCS daha CD11b + CD24 ayrılabilir. Olgun PDC, diğer yandan, selektif Siglec-H ve BST2 4 ifade ettiği gösterilmiştir. Functionally, CDCS PDC olduğundan daha sunan hücrelerin iyi antijen; Ancak, PDC Ben virüs enfeksiyonu veya enflamatuar stimülasyon 5 üzerine interferon türü geniş bir miktarda üretebilir.

Her iki CDCS ve PDC kısa ömürlü olduğu ve bu nedenle, sürekli kemik iliği (BM) 6,7 içindeki progenitörlerinden doldurulan olmalıdır. Öldürücü ışınlanmış farelere sık miyeloid progenitör (cmps) ve ortak lenfoid progenitörleri (CLPs) adoptif nakli CDCS ve PDC her iki soy 8-10 elde edilebileceğini göstermektedir. Ancak, RAG1 / 2 ifade ve IgH lokus 11,12 olarak yeniden düzenlenmiş DJ kesimleri sahip pDC'lerde bir alt kümesi vardır. Bu hücreler, aynı zamanda B220 işaretleyicinin ifadesi, bir nükleik asit-algılama reseptörleri (TLR7 / TLR9) ve transkripsiyon faktörlerinin (SPIB ve Bcl11a) 13 de dahil olmak üzere B limfositleri üzerinde, moleküler benzerlikler, lenfoid imzaları olduğuna inanılmaktadır tüm sahiptir. Bu nedenle, CLPs nedeniyle soy benzerlik pDC'lerde in vitro nesil için iyi seçimler olabilir.

İnsanlarda ve farelerde hem CDCS ve pDC'lerde sıklığı çok düşük olsa da 6 DH'ler, özellikle de CDCS (örneğin, GM-CSF ya da 11,14 Flt3 ligandı gibi sitokinlerin mevcudiyetinde BM ya da progenitörlerinden in vitro üretilebilir FL ) besleyici içermeyen sistemler kullanılarak 11,15,16. Ancak ne yazık ki, bu FL 11,15,16 kullanılarak in vitro pDC'lerde sayıda üretilmesi mümkün değildir. Daha önce PDC verimli AC-6 besleme sistemi 17 kullanarak CLPs in vitro olarak üretilebilir olduğunu gösterdi. Kültür sisteminde AC-6 stromal hücre çizgisi kullanılarak avantajı, hücre-hücre temas ve CLPs gelen pDC'lerde çok sayıda üretilmesini destekleyen sitokinlerin salgılanmasını sağlamasıdır. Bu sistem ile, üretim oldukça sağlamdır olmasına rağmen, aşağıda anlatılan prosedürlerin dikkat çoğaltma i gereklidirn emri pDC'lerde verimli nesil sağlamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C57BL / 6 vahşi tip fare, National Laboratory Animal Center (NLAC), Tayvan 'den satın alınmıştır. Tüm fareler yetiştirilir ve belirli bir patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Protokoller ve hayvan kullanımı prosedürleri gözden ve Tıp Ulusal Tayvan Üniversitesi Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (İzni No: 20120075) tarafından onaylanmıştır. Ayrıca, araştırmacılar deneyler yaparken hayvanlarda ağrı, acı veya sıkıntı potansiyelini azaltmak için her türlü çabayı. Eldiven yukarıda açıklandığı Tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir.

AC-6 Besleyici hücreler hazırlanması 1.

Not: AC-6.21 (AC-6 kısaca) (I. Weissman, Stanford Üniversitesi tarafından temin edilmiştir) stromal hücre hattı 18 RPMI içinde muhafaza edilmelidir 15% ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. Besleyici hücreler olarak hizmet etmek, AC-6 hücreleri-γ ışınlanmış 3000 rad (30Gy) onların çoğalmasını önlemek için ko-kültür bir gün önce ile vardır. Not inciOnların geçit sayısı 20 üzerinde ise ac-6 hücre bakım sırasında kalabalık bırakılırsa kendi farklılaşma destekleyen yeteneğini kaybetmek eğilimindedir ya.

  1. Yıkama AC-6 hücreleri, bir sefer 1 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile aspirasyon ile DPBS çıkarın. AC-6 37 o C'de 3-5 dakika boyunca 0.8 ml tripsin çözeltisi (% 0.05 tripsin ve DPBS içinde 0.5 mM EDTA), sonra% 5 CO2 ve hücreler kültür ortamı 10 hacim için ile seyreltilmesi, reaksiyonu durdurmak Treat tek bir hücre süspansiyonu yapmak.
  2. 5.9x10 tohum AC-6 hücre 4 hücre / kuyu içine 12-kuyu plakaları ve% 5, 37 o C'de inkübe CO 2 O / N.
    Not: AC-6 hücrelerinin yoğunluğu cdc nesil lehine olacak bir alt yoğunluğu gibi çok önemlidir. 5.9x10 yoğunluğunda Tohum de AC-6 CLPs gelen pDC'lerde türetilmesi için optimal olan bir sonraki gün, birleşik duruma ulaştılar sağlayacak / 4 hücreleri.
  3. Γ-ışınlama ile 3000 rad (30 Gy) AC-6 hücreleri ışın tedavisi.
    Not: Ac-6 ışın tedavisi için kullanılan doz, çoğalan hücreler önlemek ve henüz CLPs DC'lerin farklılaşması için gereken sitokinleri ve hücre-hücre teması sağlamak için yeterince uzun bir canlı tutmak için optimize edilmiştir.
  4. Kültür ortamı basınçla (% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS, 50 ug / ml gentamisin ve 50 uM β-mersaptoetanol ile RPMI) tam RPMI 1 ml ile değiştirin.

Fare 2. İzole BM Hücreleri

  1. CO 2 boğulma ve servikal dislokasyon ile fareler Kurban. Bir diseksiyon tepsiye yerleştirin fareler ve% 70 etanol ile sterilize edin. Orta karın bir kesi yapın ve alt ekstremite cilt kapsayan dahil farenin distalinde cilt kaldırın.
  2. Yarı steril kaput fareler parçalara ayır. Femur ve fibula bırakın, diz ekleminin altında yukarıda femur ve fibula klibi. Makas kullanarak kemiklerden kasları ayırın ve RPMI tamamlamak ml 5 içeren 6 cm'lik petri kemikleri yerleştirin.
  3. Bir steril kültür kaputu taşıyın. Tam RPMI ile 27G iğnesi bağlı bir 3 ml şırınga doldurun. Makas kullanarak kemiklerin iki ucunu kesti ve yavaşça her iki ucundan bir kez tam RPMI enjekte edilerek kemiklerin dışarı iliği temizlemesini 27G iğne takın.
  4. Hücreler yukarı ve aşağı 3-5 kez iğne olmadan şırınga kullanılarak kültür çanak nazik pipetleme tek bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
  5. 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri ve süpernatantı süzün.
  6. 1 ml tampon maddesi ACK (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA) 1 dakika için inkübe edilmesi ve tam RPMI 10 hacim ile inceltilerek reaksiyon durdurularak ile lizleyin kırmızı kan hücreleri. Hücreler yerçekimi tarafından ölü hücre kümeleri ve doku artıkları aşağı pelet için 5 dakika bekletin.
    Not: Bu nedeni canlı hücrelerin yerleşme hücre kaybına neden olacak gibi en fazla 5 dk durmayın.
  7. Yeni bir tüp bırakarak enkaz yavaş yavaş decant hücre içeren süpernatantOrijinal tüp arkasında.
  8. Daha sonra, pelet hücreleri çıkarmak ve süpernatant atmak için 500 xg'de 5 dakika santrifüj.
  9. Toplam dengeleme hücrelerin tekrar FACS tampon maddesi (1x PBS +% 2 FBS + 1 mM EDTA) ul 100 (tipik olarak 4-6 x 10 7 BM hücreleri bir fareden elde edilir).

3. FACS Analizi ve CLPs sıralanması

  1. Fc reseptörleri bloke etmek için 1-2 dakika için, anti-CD16 / 32 (hibridom üstte yüzen klonu 2.4G2, 50 ul / tepkime veya 1-2 ug / reaksiyonu) FACS tampon maddesi içinde hücrelere (adım 2.9) ekleyin.
    Not: Anti-CD16 / 32, aynı zamanda granülositler, monositler ve B lenfositleri içeren Fc reseptörlerini eksprese eden hücrelere antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek üzere ilave edilir Fc blok olarak adlandırılır.
  2. Aynı zamanda ortam ışığını kaçınarak, buz üzerinde 15 dakika süre ile (4x10 7 hücreleri için) Aşağıdaki fluoresan boya-etiketli antikorlar ile hücreleri boyayan. Antikorlar: PE-konjuge soy belirteçleri, anti-CD3 içeren (0.2 ug her biri) (17A2), anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD 19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119), ve anti-MHC-II (Nimr-4), 0,2 ug anti-c-Kit PerCP Cy5.5- (2B8), 1 ug anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 ug anti-M-CSFR-APC (AFS98) ve 0,2 ug anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
  3. 500 x g'de 5 dakika boyunca 3 ml FACS tamponla hücreleri ve santrifüj yıkayın.
  4. 300 ul FACS hücreler 40 mcM hücre süzgecinden tampon ve filtre hücreleri tekrar süspansiyon.
  5. Kalan hücrelerin kurtarmak ve aynı hücre süzgeci kullanılarak tüp ayırma steril FACS nüfuz etmeye ek bir 100 ul FACS tamponu ile tüp yıkayın.
  6. Sinyal tespiti için uygun filtre ve voltajlar kullanılarak boyanması hemen sonra akım sitometri analizi yapın. PE- ve PE-Cy7-labelded antikorları ve 633 nm las algılamak için 561 nm lazer, FITC-, PerCP-Cy5.5 etiketli antikorları tespit etmek için 488 nm lazer kullanıner APC-etiketli antikor tespit etmek için.
  7. C-kit int Sca-1 int M-CSFR - - IL-7Rα + (adım 3.2 lekeli gibi) hücre sıralayıcı kullanılarak sırala dışarı CLPs aşağıdaki belirteçler lin göre. Bir yastıkta tam RPMI 8 ml içeren 15 ml tüp sıralanır hücreleri toplayın.
  8. Çalışmasının sonunda hücre sıralayıcı ile gösterildiği gibi kriteri hücrelerinin mutlak sayısı kaydedilir. Tipik haliyle, 5x10 4 CLPs bir fare BM'lerine elde edilebilir.

4. Coculture CLPs ve AC-6

  1. , 500 x g'de 10 dakika boyunca aşama 3,7 kriteri hücreleri Santrifüj süpernatantı çıkarın ve 5x10 4 hücre / ml civarında bir hücre yoğunluğuna elde etmek için yeterli tam RPMI hücre pelletini. Tohum 500 hücre / çukur olarak aşama 1.4'te hazırlanan besleyici hücreleri ihtiva eden 12 oyuklu plaka.
  2. Her bir oyuğa 100 ng FL 19 ml / (hu-Flt3L-Ig M. Manz, Üniversite tarafından sağlanan bir ekspresyon sistemi kullanılarak in-house olarak üretilmiştirty Hastanesi Zürich, İsviçre) ve 37 o C, mikroskop altında DC gelişme periyodik görsel izleme ile% 5 CO 2 inkübe.
    Not: Piyasada mevcut rekombinant insan FL veya fare FL DC gelişimini desteklemek için hu-Flt3L-Ig için bir yedek olarak kullanılabilir.
  3. 12. günde süpernatan hücreleri toplamak ve elde edilen süpernatantlar birleştiren tam RPMI ortamına 0.5 ml ile bir kez kuyu yıkayın. Bir hücre kazıyıcı ile yapışık hücrelere 0.5 mL taze orta ekleyin ve hurda.
  4. 500 x g'de 5 dakika boyunca hücre içeren her iki parçadan orta ve santrifüj birleştirin.
  5. 50 ul FACS tampon Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. 50 ul anti-CD16 / 32 hibridom süpernatant ekleyin ve Fc reseptörleri bloke etmek için 1-2 dakika inkübe edilir.
  6. Numaralandırmak ve müteakip antikorlar (0,05 ug her biri), anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC, anti-B220 ve-PE tüm hücreleri leke.
  7. Tarif olarak yıkayın ve santrifüj hücreleriadım 3.3, d.
  8. CD11c + 100 ul FACS tamponu kapısı hücrelerinin yeniden süspanse ve CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) için analiz ve pDC'lerde (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

4-6x10 7 BM hücrelerinin toplam tipik haliyle femur ve bir 6-8 hafta yaşında, vahşi tipli C57BL / 6 fare tibya izole edilmiştir. CLPs sıralamak için, toplam BM hücrelerinin soy belirteçleri (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 ve MHC-II), anti karşı PE-konjuge antikor ile boyanır c-Kit PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC, anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analiz edilir ve bir hücre sınıflandıncısı ile kriteri. CLP için sıralama strateji Şekil 1 'de gösterilmiştir. Tipik haliyle, 5x10 4 CLPs bir C57BL / 6 fareden elde edilir. Daha fazla CLPs elde edilmesi için, 3-4 fareden BM hücrelerinin bir araya getirilebilir ve protokol sıralamadan önce buna göre ayarlanır.

5.9x10 6 AC-6 besleyici hücreler 500 CLPs bir kokültürü ardından, Arnavut kaldırımı alan oluşturan hücreler (CAFC) Gün 3-4 görünmeye başlar. Gün 8 olarak, yuvarlak şekilli PDC görünür ve CAFC (Şekil 2A) üstüne asın. PDC'lerde sayısı d etrafında zirveleri12-14 ay hangi nokta PDC onların tam gelişme aşağıdaki apoptozis tabi başlar ve sayıları giderek azalmaya başlar. CDC kolonileri günde 6-8 de, pDC kolonilerin daha sonra görünür ve CDCS morfolojisi daha büyük, mil gibi ve yapışkan (Şekil 2B).

Tipik haliyle, 5-6x10 4 hücreleri ko-kültürü, 2 hafta sonra 500 CLPs elde edilebilir. Anti-CD11c-APC ile hücrelerin boyanması sonra, anti-CD11b-FITC ve anti-B220-PE, akışı ile analiz sitometri gösteriyor ki pDC'lerde yüzdesi (CD11c + CD11b - B220 +) ve CDCS (CD11c + CD11b + B220 - )% 91 ve% 6, sırasıyla (Şekil 3). Bu nedenle, bu yöntemle PDC 100 kat kadar genişletilebilir.

figür 1
CLPs için Şekil 1. Yolluk stratejileri. BM hücreleri isotek fare yonunun floresan etiketli antikorlar ile boyandı ve lin olarak tanımlandı CLPs için analiz edildi - c-Kit int Sca-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .

Şekil 2,
Morfoloji CLP-AC-6 cocultures CDC ve pDC koloni Şekil 2.. 500 CLPs / ml FL 100 ng mevcudiyetinde γ-ışınlanmış AC-6 besleyici hücreler ile kültive edildi. (A) pDC kolonileri 8. günde, 10 ve 12 ve (B) günde 8, 12, CDC kolonileri ve 16 200 x (ölçek çubuğu 50 mikron) ışık mikroskobu altında fotoğraflandı. Bir larg görmek için buraya tıklayınızBu rakamın er sürümü.

Şekil 3,
CLP türetilmiş pDC'lerde ve CDCS Şekil 3. Akış sitometrik analizi. Beşyüz CLPs ve γ-ışımaya AC-6 besleyici hücreler (5.9x10 4 / ml) ng / ml FL (100 varlığında 12 gün boyunca in vitro kültive edildi ). Hücreler, anti-CD11c-APC, anti-CD11b-FITC, anti-B220 ve-PE ile lekelenmiş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Hücreler ilk olarak CD11c + üzerinde Geçitli ve ardından CDCS (CD11c + CD11b + B220 -) için analiz edildi ve pDC'lerde (CD11c + CD11b - B220 +). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada CLPs küçük bir sayı, özellikle bir in vitro kültür DClerin sağlam oluşturulması için bir sistem ve PDC tarif eder. Bu kültür sisteminin benzersiz besleyici olarak AC-6 hücreleri, stromal hücre çizgisi, kullanımına bağlıdır. Bu yaklaşım, IL-7, SCF, M-CSF ve FL 20 gibi yalnızca sitokinleri sağladığı gösterilmiştir, ancak, aynı zamanda, gerekli hücre-hücre teması 21 DC gelişimini desteklemek. AC-6 hücreler, birkaç progenitörlerin 8,16,22 in vitro DC gelişme çalışılabilmesi için daha önce kullanılmıştır. Bunun CLPs gelen pDC'lerde etkin farklılaşmasını desteklemek için AC-6 besleyici hücrelerin optimal yoğunluğu, tohum için önemli olduğu bulunmuştur. Spesifik olarak, pDC gelişimi için uygun olan Sonraki gün, konfluent olarak 5.9x10 12 oyuklu plakalar sonuçları 4 γ-ışımaya AC-6 tohum hücreleri. Daha düşük bir AC-6 hücre yoğunluğu (3.9x10 4 / de 12-çukurlu plaka içinde), CDC developmen destekleme eğilimindedirt 24. Bu nedenle, kültür sistemi 23 ölçeklendirme yaparken koşullarını optimize etmek için AC-6 hücrelerinin ilk tohum birkaç konsantrasyonları tavsiye edilir. Ayrıca, AC-6 hücre titizlikle kanal adedi ile özenle de dahil olmak üzere, muhafaza ve Ortak akışkanlığa eriştikten asla izin olması da önemlidir. Kalabalık veya geçiş numarası 20'den daha fazla ise bırakılırsa, bu hücrelerin in vitro olarak hematopoez destek yeteneklerini kaybederler eğilimindedir. Buna ek olarak, FL konsantrasyonu da DC gelişimini etkiler. Yüksek dozlarda (100-200 ng / ml) PDC ağırlıklı 24 oluşturulacak ise özellikle düşük dozlarda (25-50 ng / ml) CDCS tercihan, geliştirilmiştir. AC-6 hücre yoğunluğu ve FL dozajı yanı sıra, etkin bir şekilde bu kültür sisteminde DC gelişimini destekler FBS bir partinin dikkatli seçimi prosedürün başarısı için esastır.

In vitro türevi CDCS ve PDC dis olabilirkenve CD11c + CD11b - - yüzey belirteçleri, yani CD11c + CD11b + B220 tarafından tinguished B220 +, sırasıyla onların morfolojileri de mikroskobu ile ayırt vardır. PDC (Şekil 2), yuvarlak şekilli daha küçük ve süspansiyon içinde büyür ise CDCS, iğ şeklinde, daha büyük olan ve yapışık. DC farklılaşma kinetiği de PDC erken ve CDCS sonra görünen ile farklıdır. Ayrıca, pDC gelişme süreci anlamlı olarak daha yüksek AC-6 yoğunluk gelişim sürecinin hızlandırılması AC-6 hücre yoğunluğu etkilenir. Bu PDC tam gelişimine ve böylece bu kültür sisteminde pDC'lerde karşı CDCS oranı giderek daha sonraki zaman noktalarında, yani, aşağıdaki ölüme doğru olduğunu belirtmek gerekir. PDC apoptosise maruz başlar, bu nedenle periyodik mikroskobu ile DC gelişme izleme ve akış sitometrisi yüksek belirlemek için tavsiye edilir.

Not, described yöntem ayrıca, CDP gibi diğer DC progenitörlerle uygulanabilir; Bununla birlikte, bu hücrelerden oluşan, ana DC nüfus daha yüksek bir AC-6 yoğunlukları veya FL dozlarda CDCS 17 bulunmaktadır. CDP düşük pDC potansiyeli CDP-besleyici 11 ya da besleyici içermeyen 16 sistemler, iki farklı in vitro kültür sistemleri kullanılarak farklı gruplardan raporlarla tutarlıdır. Bu sonuçlar AC-6 besleyici sistemi sadakatle farklı atalarıdır farklılaşma potansiyelinin yansıtmak düşündürmektedir.

B220 + - Bu kültür sisteminde üretilen PDC CD11c + CD11b vardır. Ayrıca, CDCS 17 oranla çok daha Tcf4 (E2-2 kodlayan) ve Rag1 iki pDC spesifik genlerin, oldukça yüksek oranda, fakat ID2, CDC-spesifik bir genin daha düşük seviyeleri ifade etmedi. Bu PDC Siglec-H ve BST2 murin pDC'lerde karakteristik olarak kabul belirteçleri yoksun olsa da, yine de daha yüksek düzeylerde üretilmesi için IFN-I daha mümkünCDCS yapmak ve veziküler stomatit virüsü (VSV) 24 ile enfekte olduğunda CD86 upregulate. Bu durum, bu PDC, tam olarak farklılaşmış rağmen hala fonksiyonel olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz zaten başarıyla bu teknik DC gelişme çalışmaları için değerli olduğunu teyit CLPs 17'den pDC gelişiminde IFN-I ve FL sinerjik bir rol tanımlamak için bu yöntemi kullanmışlardır.

Sonuç olarak, biz burada pDC'lerde gelişimsel ya da fonksiyonel çalışmalar kolaylaştırabilir AC-6 besleyici Coculture sistemi kullanılarak CLPs az sayıda gelen PDC oluşturmak için basit, ama etkili, yöntem mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz Dr teşekkür ederiz. Belirteçlerin temin Markus Manz ve Irving Weissman. Biz de sırasıyla Tıp ve NTU hastanenin Ulusal Tayvan Üniversitesi Koleji'nde Akış Sitometrik Analizi ve Birinci Hücre Sıralama Çekirdek Tesisi ve İkinci Çekirdek Laboratuvarı tarafından sağlanan hizmeti kabul. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji, Tayvan Bakanlığı tarafından desteklenen (EN 102-2320-B-002-030-My3) ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri, Tayvan (IHUK-EX102-10256SI ve IHUK-EX103-10256SI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 Biolegend 108408 linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136 Biolegend 108708 linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70 Biolegend 101208 linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3 Biolegend 115508 linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2 Biolegend 103208 linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 Biolegend 100308 linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 Biolegend 100707 linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4 Biolegend 107608 linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119 Biolegend 116208 linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51 eBioscience 12-0900-83 linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98 Biolegend 135510 FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 Biolegend 105824 FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 Biolegend 108106 FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 Biolegend 135014 FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 Biolegend 117328 FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 Biolegend 101206 FACS
FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
FACS sorting tube  BD Biosciences 352054
FlowJo FlowJo LLC Flow analysis sofrware

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10, (8), e0135217 (2015).
AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler <em>İn</em> Vitro <em>Nesil</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).More

Chang, S., Pai, L. M., Lee, C. K. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. Vis. Exp. (105), e53211, doi:10.3791/53211 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter