Introduction
골격근 미토콘드리아의 주요한 생리적 역할은 산화 적 인산화 (1)로부터 ATP를 생산하는 것이다. 중요한 것은, 골격근 미토콘드리아 3, 4 및 퇴행성 질환 타입 II 당뇨병 5 노화, 운동 능력 2에서 특정 역할을 담당한다. 고령화 사회, 타입 II 당뇨병 미국 6 죽음의 7 번째 주요 원인 인 것으로, 미토콘드리아의 기능을 평가하는 방법에 대한 필요성은 생물 의학 연구 7,8에서 점점 더 유행이되고있다. 이 산화 적 인산화 (9)의 기능적 구성 요소를 표현하는 미토콘드리아 게놈과 핵 사이의 조정 기능을 나타내므로 특히, 산소 소비량의 측정은 미토콘드리아 기능의 평가에 특별한 유틸리티를 갖는다.
몇 가지 기술은 그대로 셀의 산소 소비량의 측정을 가능하게하고 분리 존재D 미토콘드리아 7-10. 또한, 분석은 여러 유형의 세포와 조직을 위해 개발하고 미토콘드리아 호흡 경로 및 제어 9,11,12의 측정을 허용하는 다양한 종에왔다. 그러나, 마이크로 기반의 산소 소비 기술에 사용하기 위해 마우스 골격 근육에서 고립 된 미토콘드리아를 사용하여 이러한 분석의 모든 편집에 관해서 문헌 보이드는 현재이있다. 중요한 것은, 마이크로 기반 호흡계 분석의 사용은 미토콘드리아 생물 학자 가운데 성장과 격리 된 미토콘드리아 9 최소한의 양을 사용하여 높은 처리량 측정을 가능하게한다. 따라서, 마이크로 호흡계 기반 분석법 컬렉션 이상 및 / 또는 적응은 전자 전달계 (ETC)에서 발생 될 수있는 위치의 수 정확히 파악이 개발되었다. 또한, 두 개의 추가 마이크로 기반 호흡계 분석은 조정의 평가 betwee을 사용하는 것이 개발되었다트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클 등과 β-산화 및 ETC. 사이의 N 중요하게는, 제시된 방법은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 기능에 기계적 변화를 측정 명확하고 간결한 방법을 제공한다.
Protocol
참고 : 하나의 빨간색 골격 근육에서 미토콘드리아를 격리 한 후이 프로토콜은 시작된다. 빨간색 골격 근육 (13) 100 mg의 - 이전 ~ 75에서 설명한 바와 같이 미토콘드리아가 분리되었다. 미토콘드리아 단백질 10 μg의 / μL 미토콘드리아에 대한 격리 버퍼의 ≤50 μL의 최종 미토콘드리아 펠릿 (IBM) (2) (Frisard 등 13 참조) 재 부유에 의해 조직이 금액을 달성 할 것 - 5 년 사이에.
1. 설치
- 후속 분석을위한 스톡 솔루션 (표 1)과 미토콘드리아 분석 용액 (MAS) 혼합물 (표 2)를 작동 준비한다.
주 : 대부분 주식 솔루션 및 MAS가 저장 될 수있는 분석 용 제제의 대부분은 미리 수행 될 수있다. - 37 ℃에서 비 - CO 2 인큐베이터에서 실험 전날 밤 1ml의 교정 용액 호흡계 검정 카트리지 수화물.
- 실험, T의 날37 ° C의 목욕이나 인큐베이터에서 냉동 주식 (기판과 미토콘드리아 조절, MAS 믹스, MAS BSA O / W, 표 1)과 해동을 아케.
- 모든 기판 솔루션 (표 3)과 주사 (표 4-5)를 준비하고 (PH 7.4) 원하는대로의 pH를 조정합니다. pH를 조정 한 후, 얼음에 저장한다.
- 프로그램 적절한 혼합 기다린 측정 파라미터 멀티 웰 산소 소모량 측정 시스템은 먼저 "표준"모드 다음 분석 소프트웨어, 입력 및 라벨 배경 및 그룹 / 조건 웰 (표 6 참조).
- "게스트"포럼에 입력하고 "분석 마법사"를 클릭합니다. 일단 "분석 마법사"에, 믹스를 변경 기다린 매개 변수를 측정하기 위해 "프로토콜"을 클릭합니다. "위로 아래 배경 우물을 레이블. 수정 "탭을 강조해야" "배경 보정 작업을 수행합니다.
- 라벨 COND"그룹 정보"탭 다음에 "그룹 및 레이블"탭에서 첫 번째 클릭에 의해 itions. 이러한 매개 변수를 입력 한 후, "템플릿 저장"다음을 클릭합니다 "끝".
2. 분석 실행
- 분석 실행 카트리지에 주입 솔루션을로드하고 먼저 "표준"모드를 입력하여 다음에 분석 소프트웨어를 입력하여 교정을 시작합니다. "게스트"포럼에 입력합니다. "템플릿"탭에서 "XF"드라이브 아래 단계 1.5에 저장된 템플릿을 엽니 다. 개방되면, 교정을 시작하기 위해 "시작"을 클릭합니다.
참고 : 분석 실행 카트리지는 왼쪽 하단에 금이 간 모서리와 기계에 입력해야합니다. 이 약 30 분 소요됩니다. 적절한 포트에 솔루션을 주입주의하십시오. 표 4-5에서 주사는로드의 순서로 나열되어 있습니다. - 조심스럽게, 그러나 철저하게 mitochond를 혼합부드럽게 위 팁의 단부 오프 ~ 3mm를 절단하여 확대의 오리피스를 갖고 200 μL 피펫 팁으로 콘텐츠를 분쇄하여 다음에 200 μL 피펫 팁을 가진 용액을 교반 RIA 스톡.
- 미토콘드리아 콘텐츠의 단백질 농도를 결정 bicinchoninic 산 (BCA) 분석을 수행한다.
- 단계 2.3로부터 취득한 콘텐츠 농도를 사용 / 숙신산 / 로테 기판 믹스 200 μL (표 3) 미토콘드리아 10 μg의 단백질을 재현 탁. 미토콘드리아 단백질 14 μg의는 / 나머지 기판 믹스 200 μL (표 3) (이것은 각 기판 믹스에 대해이 작업을 수행해야합니다)를 Resuspend. 모든 미토콘드리아 단백질 / 기판이 얼음에 혼합 배치합니다.
주 : 앞서 설명 된 바와 같이 (9)에 대한 각각의 분석 웰 당 미토콘드리아 단백질의 최적 량을 결정 하였다. 판정되었다는 피루브산 / 말산, 카르니틴 팔미 토일 / 말산, 글루타메이트 / 말산의숙시 네이트 / 로테 분석이 미토콘드리아 단백질의 2.5 μg의 당을 잘 활용하면서 D 전자 흐름의 분석은, 미토콘드리아 단백질의 3.5 μg의를 사용합니다. 따라서, 연구자가 4 년부터이 단계에서 복제에 대한 충분한 미토콘드리아 단백질을 재현 탁해야 하나 2.5 μg의 50 μL 당 3.5 μg의 잘 당로드 (단계 2.6 참조). - 부드럽게, 그러나 철저하게 부드럽게 말 ~ 3mm 있었다 200 μL 피펫 팁과 주식을 분쇄하여 다음에 200 μL 피펫 팁과 솔루션을 교반하여 미토콘드리아 / 기판 솔루션을 혼합 차단.
- 부하 50 μL / 웰의 미토콘드리아 / 기판 믹스의 각 얼음과 세중에서 세포 배양 접시를 놓습니다. 마이크로 호흡계 기반 분석의 개발은 바람직하게는 세포 배양 접시에 양측에, 두 개의 빈 (미토콘드리아 없음) 웰의 최소 이탈 권장.
- 4 ℃에서 20 분간 2,000 g에서 세포 배양 접시 스핀. 플레이트들이지만피닝, 37 ℃의 수욕 기판 솔루션을 따뜻하게.
- 스핀이 완료된 후, 조심스럽게 각 웰의 상부에 각 기질 용액 450 μL를로드 (즉, 처음에는이 기질 용액에 재현 탁 미토콘드리아가 웰 피루브산 / 말산 기판로드). 실온에서 판을로드해야합니다. 참고 : 빈 우물이 기판의 500 μL와 함께로드해야합니다. 결합 분석 블랭크 웰 모든 결합 분석 기판으로 로딩 될 수있는 반면, 전자 유동 검정을 위해 지정된 빈 웰, 전자 흐름 기판 (피루브산 / 말산 + FCCP)로로드한다.
참고 : 같은 접시에 결합 및 전자 흐름 분석을 수행하는 경우 분석 실행이 "악기"탭을 통해 "XF 리더"플랫폼을 사용하여 완료 한 후, 연구자가 각각의 분석에 배경 우물을 다시 할당해야합니다. 일단 "악기"설정 내에서, "관리"를 클릭"배경 보정"다음에 탭. 완료되면 히트 "장비 설정 모드를 종료합니다". 아스 코르 베이트 / TMPD의 조합 따라서 별도의 배경 보정이 각각의 분석 유형에 필요한 O 2를 소비 할 수 있기 때문이다. - 기판의 450 μL를 각 웰에 첨가 한 후, 미토콘드리아는 단일 단층에 균일하게 분산되도록하기 위해 잘 미토콘드리아 층도 (20X 배율 [로저스 9 참조,도 4). 균일하게 분산 된 단층을 가질 것으로 보이지 않는다 웰 포스트 혹을 제거 할 수있다.
- 미토콘드리아 준수를 확인 후, 호흡계 분석 기기에 마이크로를 삽입하고 "확인"을 클릭하여 실행 분석을 시작합니다.
참고 : 실행이 시작하기 전에 2.1 단계에서 보정을 완료해야합니다. 연구원은 "확인"을 클릭하면, 기계가 교정에 사용 된 유틸리티 판을 배출합니다.- <리> 유틸리티 플레이트를 제거하고 트레이의 미토콘드리아를 포함하는 세포 배양 접시를 놓습니다. 세포 배양 접시에 블루 노치는 트레이의 왼쪽 하단 모서리에 배치해야합니다. 분석 실행을 시작합니다 "계속"를 클릭합니다.
- 플레이트가 배출되면 제거하고 세포 배양 판과 카트리지를 폐기하고 화면에 "계속"을 클릭합니다. 실행이 자동으로 "데이터"파일에 .xls 파일로 저장됩니다.
- 옵션 : 아래의 다음 변화에 "지점 간 요금", "중간 점" "속도 데이터는 다음과 같이 표시됩니다." 이러한 변경 사항을 적용하려면 "확인"을 클릭합니다.
- 함께 유사한 조건의 그룹 우물에 화면의 왼쪽 하단에있는 "글쎄 그룹 모드"탭을 클릭합니다. 마지막으로, 왼쪽으로, 화면의 중앙을 향해 "샘플 평균 / 표준 오류"탭을 클릭합니다. 분석은 "분석 마법사"설정에서 시작하기 전에 다른 방법으로,이 명령은 설정할 수 있습니다.
참고 : 각 조건이 각각의 속도와 각 조건에 대해 표시 ± 표준 편차 평균이있을 것이다. 조건 (주 2 커플 링] / State3u [전자 흐름] 호흡은 네 개의 주사 다음) 당 촬영 속도 측정이있다. 주사를 oligomycin 후 극소 점에서 주 4O을 결정 초 측정 상태 2 비율의 평균을 사용하여 각각 ADP 및 FCCP 주입 후에 상태 3 및 상태 3U의 최대 지점을 사용하고 Antimycin의 최소 점을 이용 커플 링 분석 실험에 대한 유도 호흡. 최소 사용, 피루브산 / 말 산염 유도 주 3U 호흡의 최대 포인트를 사용하여로테에 의한 호흡에 대한 점은, 숙시 네이트 유도 국가 3U 호흡의 최대 포인트를 사용하고 전자 흐름 분석에 대한 Antimycin에 의한 호흡의 최소 포인트를 사용합니다. 모든 실험은 3 회 수행되었고, 도시 된 데이터는 대표 추적의 결과이다.
Representative Results
도 1은 피루브산 / 말산, 숙신산 / 로테 논, 카르니틴 팔미 토일 / 말산, 글루타민산 및 / 말산 검정 (결합 분석법) 산소 소모 속도 (OCR)을 나타낸다. 이러한 분석 트레이싱은 산소 소비 속도, 또는 OCR, 대 시간으로 표시됩니다 배경 correceted하고, 포인트 - 투 - 포인트 비율로 표시됩니다. 각 패널은 기회와 윌리엄스 (14)에 의해 설명 된대로 다른 미토콘드리아 지역에서의 산소 소비를 나타냅니다. 제 패널은, ADP의 주입 후 기저 산소 소비량, 또는 상태 2. 제 2 패널을 나타내는 oligomycin 주입 (복합 V의 억제제) 후, 최대 결합 호흡, 또는 상태 3. 세번째 패널을 나타내는 인해 호흡을 나타낸다 양성자 누출, 또는 주 섭씨 40도에. 네 번째 패널은 FCCP의 주사 후, 최대 비 결합 호흡, 또는 상태 3U를 나타냅니다. 마지막으로 다섯 번째 패널은 Antimycin의 주사 후, 산화 호흡의 억제를 나타냅니다. 특히, 알L 미토콘드리아 상태는 최소한의 표준 편차가 있습니다. 이 미토콘드리아 주식과 미토콘드리아 / 기판 믹스 및 준수 스핀 (단계 2.6) 후 미토콘드리아의 단일 단층의 달성의 철저한 혼합 때문이다. 한편, 각 웰 아닌 마이크로의 우물에서 미토콘드리아의 단일 단층 달성에 불평등 한 미토콘드리아를로드하는 것은 그림 2에 표시된 각각의 상태에 표준 편차를 증가하는 리드.
각 미토콘드리아 상태에 대한 각각의 기판에 대한 그림 1 표시 고원에서의 추적. 두 측정 사이클 이후 달성 고원 좋은 미토콘드리아 품질을 제안하고, 미토콘드리아는 분석 기간 전체에 잘 부착 남아있다. 이 때문에 발생할 수있는 편견을 줄이고, 연구원이 미토콘드리아 상태에서 평균 OCR을 할 수 있기 때문에 또한, plateaued 최대 비율의 달성이 더 바람직 할 수있다임의의 점을 선택하여.
웰 당 미토콘드리아의 양이 최적화 실험에 의해 결정되었다. 웰 당 미토콘드리아의 최적 량은 주 초래한다 100-200 pmol의 / 분 / 웰 상태 3 등급 <사이에 2 등급 1,500 pmol의 / 분 / 웰, 이러한 값은 멀티 웰 산소 동적 산소 검출 범위 내에 있기 때문에 소비 측정 시스템. 물론 당 너무 많은 미토콘드리아 단백질을 넣기. 악기 (그림 3A)의 동적 범위를 넘어 OCRs 결과 (3 잘 당 미토콘드리아 단백질의 로딩 2.5 μg의 비교도 당 미토콘드리아 단백질 (블루 추적)의 3.5 μg의로드 묘사 빨간색도있다 숙시 네이트 / 로테 역가) 추적. 물론 당 너무 많은 미토콘드리아 단백질을로드하면 따라서 각각의 연속 측정 (9) (그림 3B <대한 OCR의 정확한 측정을 방지 잘 microchamber 내에서 산소의 고갈로 이어질 수/ STRONG>). 포인트 - 투 - 포인트는 OCR OCR의 변화의 속도는 순간적이다. 평면 경우, OCR은 / 안정 안정하지만, 감소한다면, 생물학적 또는 기술적 인 문제가있을 수 있습니다. 주 3 주 3U 호흡 (그림 3A)에서 OCR의 가파른 하락은 측정 (그림 3B)이 끝나기 전에 산소 공급을 배출하는 미토콘드리아에 의해 발생합니다.
도 4는 전자 유동 검정 용 OCR 대 시간을 나타낸다. 그림 1에 기재 한 바와 같이 추적이 수정되어 표시됩니다.이 분석의 첫 번째 패널은 두 번째 패널, 로테의 주사 후, 단지 내가 매개 호흡의 억제를 나타내는 복잡한 I. 통해 피루브산 / 말 산염에 주 3U 호흡을 나타냅니다. 세 번째 패널은 숙시 네이트의 주사 후, 전자가 복합 II (단지 II 매개 호흡)에 등 입력과 기판 자극 주 3U를 나타냅니다. Antim의 주사 후 네 번째 패널,ycin는 복잡한 III 따라서 전체 호흡의 억제를 나타냅니다. 마지막으로 다섯 번째 패널은 아스코르브 산염 / TMPD의 주사 후, 단지 IV 매개 호흡을 나타냅니다. 도 1에서의 추적과 유사하게, 모든 상태가 미토콘드리아 최소 표준 편차를 가지며, 각각의 속도는 고원을 획득 한 또는 거의 갖는다.
도 1 결합 분석법. (A) 10 mM의 피루브산 / 5mM의 말산, (B) 10 mM의 숙시 네이트 / 2 μM 로테 논, (C) 40 μM 팔미 토일 카르니틴 / 1mM의 말산, 및 (D) 10 mM의 글루타메이트 / 10 mM의 산소 소비의 멀티 웰 측정에 의해 결정되는 바와 같이 말산은 미토콘드리아 호흡 분석 트레이싱 결합. 값은 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 잘 당로드 미토콘드리아 단백질은 숙시 네이트 / 부패를 제외한 모든 분석 3.5 μg의이었다미토콘드리아 단백질의 2.5 μg의 당을 잘 활용 에논. 데이터는 N = 3 쌍 생물 복제를 나타냅니다. OCR = 산소 소비 속도; ADP = 아데노신 디 포스페이트; 올리고 = Oligomycin; FCCP = 카르보닐기 시안화물 (4) - (트리 플루오 로메 톡시) 페닐; 안티 = Antimycin; 피라 = 피루브산; SUCC = 숙시 네이트; ROT = 로테; PAL-C는 카르니틴 팔미 토일 =; GLUT = 글루탐산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 높은 변수 피루브산 / 말라 테 분석. 불완전 따라서 변수 미토콘드리아 프로로 이어지는, 기판 / MAS 믹스에 미토콘드리아 재고에서 미토콘드리아의 혼합에 의한 고도의 변수 10 mM의 피루브산 / 5 mM의 말 산염 분석각 웰에 TEIN로드. 잘 당로드 미토콘드리아 단백질은 3.5 μg의했다. 데이터는 N = 3 쌍 생물 복제를 나타냅니다. OCR = 산소 소비 속도; ADP = 아데노신 디 포스페이트; 올리고 = Oligomycin; FCCP = 카르보닐기 시안화물 (4) - (트리 플루오 로메 톡시) 페닐; 안티 = Antimycin; 피라 = 피루브산은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
숙시 네이트 / 로테 분석 그림 3. 과부하 미토콘드리아 단백질. (A) 웰 당 미토콘드리아 단백질 (블루 추적) 3.5 μg의 로딩에 의해 야기되는 멀티 웰 산소 소모량 측정 시스템의 동적 범위를 벗어나는 산소 소비 속도는 잘 (적색 트레이스) 당 미토콘드리아 단백질 로딩 2.5 μg의로 비교 하였다. (B ) 황소접근 긴장을 ygen 제로 ADP 잘 당 미토콘드리아 단백질의 최적 량 (2.5 μg의) (빨간색 추적을)로드에 비해 잘 (블루 추적) 당 과도한 미토콘드리아 단백질 (3.5 μg의를)로드에 의한 FCCP 주사 다음과 같습니다. 데이터는 미토콘드리아 단백질 양 당 N = 3 쌍 생물 복제를 나타냅니다. OCR = 산소 소비 속도; ADP = 아데노신 디 포스페이트; 올리고 = Oligomycin; FCCP = 카르보닐기 시안화물 (4) - (트리 플루오 로메 톡시) 페닐; 안티 = Antimycin; SUCC = 숙시 네이트; ROT = 로테; O 2 = 산소; 수은의 MM 수은 = 밀리미터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 전자 흐름 분석. 5 mM의 피루브산 / 1 mM의 말 레이트 + 4 μM의 FCCP, 전자 F산소 소비의 멀티 웰 측정에 의해 결정되는 바와 같이 낮은 미토콘드리아 호흡 분석 추적. 값은 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 잘 당로드 미토콘드리아 단백질은 3.5 μg의했다. 데이터는 N = 3 쌍 생물 복제를 나타냅니다. OCR = 산소 소비 속도; 안티 = Antimycin; 오름차순 = 아스코르브; TMPD = N, N, N ', N'테트라 메틸 P의 -phenylenediamine는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 주식 농도 | MW | 최종 권 | 대량 추가 | 댓글 / 설명 | ||||||
| (M) | (G / 몰) | (㎖) | (g 또는 ㎖) | ||||||||
| EGTA, pH가 7.2 | 0.1 | 380.35 | 1M 트리스 자료 100 ㎖ | 3.801 g의 | 저장 4 ° C에서 | ||||||
| HEPES | 1 | 238.3 | DiH 2 O 250 ml의 | 59 57g | 저장 4 ° C에서 | ||||||
| 의 MgCl 2, 수화물 | 1 | 203.31 | DiH 2 O 250 ml의 | 50.82 G | 저장 4 ° C에서 | ||||||
| 피루브산의 pH가 7.4 | 0.1 | 88.06 (14.11 M 용액으로 온다) | DiH 2 O 40ml의 | 피루브산 0.283 ml의 | , -20 ℃에서 1 ml를 분취하고 저장합니다 모든 이주 신선한 확인 | ||||||
| 숙시 네이트 pH가 7.4 | 0.5 | 118.09 | DiH 2 O의 100 ㎖ | 스와의 9.4 Gccinic 산 | -20 ° C에서 1 mL를 분취하고 저장합니다 | ||||||
| 말라 테, pH가 7.4 | 0.5 | 134.09 | 95 % 에탄올 100 ml를 | 말산 6.7 g | -20 ° C에서 200 μL 분취하고 저장합니다 | ||||||
| TMPD | 0.01 | 164.25 | 10 ml의 | 0.0164 g의 | -20 ° C에서 300 μL 씩 저장합니다; TMPD 감소를 유지하는 아스코르브 몰량 혼합 | ||||||
| 팔미 토일 L- 카르니틴 클로라이드 | 0.01 | 436.07 | 95 % 에탄올 1.14 ml를 | 0.005 g의 | -20 ° C에서 40 μL 씩 저장합니다 | ||||||
| Oligomycin | 0.006 | 791.06 | 95 % 에탄올 0.987 ml의 | 0.005 g의 | -20 ° C에서 20 μL 씩 저장합니다 | FCCP | 0.01 | 254.17 | 95 % 에탄올 3.9 ml의 | 0.01 G | -20 ° C에서 40 μL 씩 저장합니다 |
| 로테 | 0.001 | 394.4 | 95 % 에탄올 10ml에 | 0.0039 g의 | 스토어 -20 ° C에서 | ||||||
| Antimycin | 0.005 | 548.63 | 95 % 에탄올 9.12 ml를 | 0.025 g의 | 스토어 -20 ° C에서 | ||||||
| K + ADP | 0.5 | 501.32 | DiH 2 O의 3.9 ml의 | 1.0 G | 스토어 -20 ° C에서 | ||||||
| 말산, pH 7.4의 | 0.5 | 134.09 | 40 ml의 | 2.68 G | -20 ° C에서 200 μL 분취하고 저장합니다 |
| 시약 | 주식 농도 | 대량 추가 | 최종 몰 농도 / 비율 |
| (M) | (g 또는 ㎖) | ||
| 자당 | - | 11.98 G | 70 mM의 |
| 만니톨 | - | 20.04 G | 220 밀리미터 |
| 1 인산 칼륨 | - | 0.34 G | 5 밀리미터 |
| 의 MgCl 2, 수화물 | 1 | 2.5 ml의 | 5 밀리미터 |
| HEPES | 1 | 1.0 ml의 | 2 밀리미터 |
| EGTA | 0.1 | 5.0 ml의 | 1 밀리미터 |
| 기본적으로 지방산 무료 - BSA | - | 1.0 G | 0.20 % |
. 표 2. MAS 믹스의 pH 7.4, 500 ml의 : 나누어지는 25 ml에 저장 -20 ºC * 주의 : 분석 주사에 사용되는 MAS 믹스에 대한 BSA를 제외합니다.
| 기판 중간 | 최종 농도 | 주식의 양 (μL) | MAS *의 양 (㎖) |
| 피루브산 / 말라 테 | 10 월 / 5 밀리미터 | 피루브산 : 1,000 | 9 |
| 말라 테 : 100 | |||
| Succicinate / 로테 | 10 월 / 2 μm의 | 숙시 네이트 : 200 | (10) |
| 로테 논 (20) | |||
| * 피루브산 / 말라 테 + FCCP | 5 월 / 1 월 / 4 μm의 | 피루브산 : 500 | (10) |
| FCCP : 4 | |||
| 말라 테 : 20 | |||
| 팔미 토일 L- 카르니틴 / 말라 테 | 40 μm의 / 1 밀리미터 | Palmitoylcarnitine : 40 말라 테 : 20 | (10) |
| 글루타민산 / 말라 테 | 10 월 / 10 mM의 | 글루타민산 : 400 | (10) |
| 말라 테 : 200 |
표 3. 기판 솔루션의 pH 7.4 : 실험의 날 신선한합니다. * 전자 흐름 분석 솔루션입니다.
| 사출 중간 | 집중 | 주식의 양 (μL) | <TD> MAS의 양 (㎖)금액 카트리지에 주입 | 최종 농도 | |
| (후 판에 주입) | |||||
| ADP | 50 mM의 | 300 μL | 3 | 50 μL | 5.0 밀리미터 |
| Oligomycin | 20 μm의 | 10 μL | 3 | 55 μL | 2.0 μM |
| FCCP | 40 μm의 | 12 μL | 3 | 60 μL | 4.0 μM |
| Antimycin | 40 μm의 | 24 μL | 3 | 65 μL | 4.0 μM |
티결합 분석 실험에 대한 수 4. 주사의 pH 7.4 :. 실험의 날 신선한합니다. * 결합 분석법을 포함 (이에 제한되지 않음) 피루브산 / 말산, 숙신산 / 로테 논, 카르니틴 팔미 토일 / 말산, 글루타민산 및 / 말산을.
| 사출 중간 | 집중 | 주식의 금액 (G 또는 UL) | MAS의 양 (㎖) | 금액 카트리지에 주입 | (후 판에 주입) 최종 농도 |
| 로테 | 20 μm의 | 60 μL | 3 | 50 μL | 2.0 μM |
| 호박산 | 50 mM의 | 300 μL | 3 | 55 μL | 5.0 밀리미터 |
| Antimycin | 40 μm의 | 24 μ; L | 3 | 60 μL | 4.0 μM |
| TMPD / Ascorabte | 1 밀리미터, 100 밀리미터 | TMPD : 300 μL | 3 | 65 μL | 100 μM, 10 mM이 |
| 아스코르브 : 0.059 g의 |
전자 흐름 분석 표 5. 주사의 pH 7.4 :. 실험의 날 신선한 확인
| 명령 | 시간 (분) | 사이클 # |
| 보정 | ||
| 잠깐만 요 | 10 분 (플레이트가 부착 단계에서 따뜻하게 할 수 있도록) | |
| 혼합 | 1 분 | (2) |
| 나를슈어 | 2 분 | |
| 를 주입 | ||
| 혼합 | 1 분 | (2) |
| 측정 | 2 분 | |
| B를 주사 | ||
| 혼합 | 1 분 | (2) |
| 측정 | 2 분 | |
| C를 주입 | ||
| 혼합 | 1 분 | (2) |
| 측정 | 2 분 | |
| D를 주입 | ||
| 혼합 | 1 분 | (2) |
| 측정 | 2 분 |
표 6. 악기 실행 프로토콜.
Discussion
마우스 골격근 100 mg의 -이 문서에 제시된 방법은 (75)에서 분리 된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로 기반 호흡계 분석의 컬렉션의 성능에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 삼중 웰 간의 긴밀한 표준 편차에 의해 증명 이러한 분석은 높은 정밀도로 수행 될 수있다. 중요하게는, 이러한 분석은 호흡계 이상 및 / 또는 적응은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 ETC, TCA 사이클, β 산화 경로, 기판 컨베이어 등에서 발생 될 수 있고, 여기서 정확히 파악 허용한다.
그것은이 프로토콜에 사용되는 각종 연료 및 억제제를 사용하기위한 이론적 근거를 강조하는 것이 중요하다. 피루브산 / 말산 및 글루타메이트 / 말산 호흡계 분석은 단지 I 매개 호흡의 평가뿐만 아니라, 각 컨베이어의 평가를 허용하고, 글루타메이트의 경우, 아미나 15. 다르게는, 조합로테 복잡한 I을 억제하고 숙시 네이트는 아데닌 디 뉴클레오티드 플라 빈의 감소를 통해 복잡한 II에 전자를 제공하기 때문에 숙시 네이트 / 로테 논은 (FADH 2) (15) ETC의 복잡한 II를 통해 미토콘드리아 호흡 플럭스의 평가를 할 수 있습니다. 이러한 분석은 커플 링 효율 및 최대 호흡으로 기판에 특정 정보를 제공한다. 전자 유동 검정은 기질 및 억제제의 조합은 미토콘드리아 호흡 플럭스 9 중 여러 착체의 평가를 허용한다는에서 독특하다. 숙시 네이트 다음 로테의 주입은 단지 II에 의해 구동 평가 최대 호흡을 허용하면서 피루브산 / 말산 + FCCP의 초기 기판 믹스, 단지 내가 의해 구동 최대 호흡의 평가를 할 수 있습니다. 아스 코르 베이트의 주입 하였다 Antimycin의 주사, 복합 III 억제제가 / TMPD는 아스코르브 때문에 복잡한 IV에 의해 구동 호흡의 평가를 허용 / TMPD는이다시토크롬 C / 단지 IV에 전자 공여체. 커플 링 효율에 관한 정보가 얻어지지 않는 동안, 상기 방법은 독립적으로 실행되는 다수의 기판들을 배제 매우 작은 샘플 크기에 적합하다. 마지막으로, 팔미 토일 카르니틴 / 말 레이트의 사용이 β 산화 및 팔 미트 산 (β 산화)의 산화로부터 생성되는 환원 당량 보낸 ETC 사이 코디 평가 허용는 flavoprotein 15 전사 전자 통하여 ETC로 공급. 이는 커플 링 및 전자 흐름 분석은 인해 일부 개입 (약물 치료, 유전자 조작)으로 미토콘드리아 기능의 변화를 식별하기 위해 직렬로 사용될 수 있음을 주목해야한다.
이러한 분석을 위해 얻어 고정밀는 단백질 결정에, 또는 기판 솔루션 이전인지, 미토콘드리아의 완전한 혼합에 주로 기인한다. 이와 더불어, 미토콘드리아 일단 기판 solutio에 resuspendend됩니다NS, 그것은 넓어진 오리피스 피펫 팁으로 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세포 배양 플레이트를 로딩하기 전에 철저이 용액을 혼합하는 것이 중요하다. 미토콘드리아를 혼합하지 않으면 철저하게 분석 내에서 큰 변화로 이어질 것입니다. 또한, 미토콘드리아를 혼합하는 동안 전단력을 만들 좁은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 부착 단계 (2.7)이이 프로토콜의 중요한 단계 인 미토콘드리아 막 사이토 크롬 C의 방출을 손상시킬 가능성을 증가시킨다. 긴 / 충분히 빨리로드 된 세포 배양 판을 회전하지 않으면, 따라서 우물과 측정 사이 증가 변동성을 선도, 잘에 미토콘드리아의 완전 준수가 발생합니다.
주식과 기판 솔루션을 만들기 위해 올바른 농도 / 준비 방법을 사용하여, 당 잘 미토콘드리아 단백질의 최적 량을로드, 분석 실행을 변경 미토콘드리아 상태 괞 찮아을 보장하기 위해 : 설명 프로토콜을 포함하는 최적화 된teaus하고, 미토콘드리아 주식과 미토콘드리아 / 기판 믹스의 적절한 혼합. 이러한 최적화 노력에 앞서, 저자는 분석 실행에 함정을 발견했습니다. 다음은 문제 해결 방법 /이 프로토콜을 최적화하는데 도움이되었다 수정에 대해 설명합니다. microchamber 내에서 산소를 배출하고 부정확 한 측정으로 이어질 것입니다 너무 많은 미토콘드리아를로드하는 동안 최적의 로딩과 관련하여, 로딩이 너무 작은 미토콘드리아는 강력한 반응을 유도하지 않습니다. 로저스 등 9 마이크로 기반 호흡계 분석 잘 당 미토콘드리아의 최적의 급지 량을 결정하는 예제를 제공합니다. 더 자주, 너무 많은 미토콘드리아는 당로드뿐만 아니라 국가에 의해 입증이 비율을 100 ~ 200 pmol의 / 분 이상 / 웰과 주 3 비율> 1500 pmol의 / 분 / 잘된다. (. - 10 μg의 예 (1) 사이) 내에서 동적 R OCRs을 이끌어내는 위에로드가 발생하는 경우, 미토콘드리아 단백질을 다양한 농도로 실험을 수행산소 소모량 측정 기계의 앤지. 준비 및 기판과 주식의 정확한 농도를 사용하는 것이 가장 중요합니다. 항상 기판 / 주사의 산 형태를 사용하고, 수산화 칼륨 또는 HCl로 pH를 조정; 나트륨 버퍼 / 솔루션은 사용하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 재 부유 기판 / DMSO 또는 100 % 에탄올의 주식은 측정 오류 또는 오류가 발생합니다. 명시된 경우 95 % 에탄올을 사용하십시오. 이는 카르니틴 팔미 토일 따라서 큰 변동을 초래 동결 스톡을 해동 후 95 % 에탄올 침전에 대해 일반적이다. 사용하는 것이 아니라 이전 팔미 토일 카르니틴 재고 및 소용돌이를 따뜻하게해야합니다. 또한, 매우 다양 피루 베이트 / 말 산염 분석 결과로 인해 이주 된 피루브산 스톡 존재>로 할 수있다. 피루브산의 냉동 분량 씩 2 주마다 리메이크해야합니다. 분석 실행은 미토콘드리아 상태 고원을 보장하기 위해 2 분 측정에 수정되었습니다. ADP의 고갈의 관찰이 필요한 경우, 연구자는 할 수있다"분석 마법사 '포럼에서"프로토콜 "탭에서 측정 시간을 연장. 마지막으로, 큰 변화는 미토콘드리아 주식과 미토콘드리아 플러스 기판 솔루션은 로딩 전에 완전히 균질화되지 않을 때 발생합니다. 우물 사이의 변동성 분석 실행 한 후 높은 경우, 완전히 전에 다음 실험에 기질 용액을 혼합해야합니다. 절대로 미토콘드리아 / 기판 솔루션을 와동하지 않고, 매쉬를 저어 부드럽게 넓어진 구멍 피펫 팁으로 씹다.
주목할 가치가있는이 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 먼저, 분석 방법에 사용되는 세포 배양 플레이트에 웰의 개수가 상대적으로 낮다 (예., 24 웰과 블랭크 웰을 위해 지정된 적어도 2). 그것은 하나의 플레이트에 상기 분석의 모든 5를 수행하고자하는 경우, 연구자는 한 번에 하나의 마우스에서의 응답을 검사 할 수있다. 그러나, 96 웰 악기 highe에 사용할 수 있음을 주목해야한다R 처리량. 둘째, 손상 세포 1에 비해 절연 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 고유의 강점과 약점이있다. 일부 약점은 그대로 세포 분리 과정에서 유도 유물에 비해 적은 생리 학적 관련성을 가지고 있습니다. 마지막으로,이 방법의 성공은 미토콘드리아 분리 프로세스의 품질에 조건부이다.
이러한 분석의 일부는 두 가지 시스템에 개발되어왔다 또는 다른 동물 모델에서 입증되었지만, 본원에 제시된 방법은 멀티 웰 산소 소비량 측정 기계를 사용 마우스에 최적의 상태로 상기 분석 모두를 합성 최초로 골격근. 따라서, 최소한의 재료로 높은 처리량을 제공하는 마우스 골격근 100 mg의 - 중요한 것은, 이러한 모든 분석은 5 ~ 75으로부터 격리 미토콘드리아의 양으로 수행 될 수있다. 큰 의미, 멀티 웰의 능력산소 소비 기술은 최적화 된 분리 방식을 조합 미토콘드리아의 최소 수량과 분석을 수행하는 연구자는 골격근 조직의 나머지와 다른 실험 (예., 웨스턴 블롯의 다수를 수행 할 수 있도록, RT-PCR, 효소 적 분석법, 종종이 동물 모델과 투쟁 등).
결론적으로, 여기에 제시된 방법은 마우스 골격 근육의 최소한의 양을 사용하여 마이크로 기반 호흡계 분석의 컬렉션의 성능에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 중요한 것은, 제시된 방법은 조직과 미토콘드리아의 최소한의 양을 필요로한다. 마스터 일단 본 명세서에 기재된 기술은 연구자들이 흔히 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아의 산소 소비량의 화합물 또는 유전자 생성물의 전위기구를 결정하는 것을 허용 할 것이다.
Disclosures
조지 W. 로저스는 이러한 분석은 개발 된 악기를 제조 해 마 생명의 직원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at RT |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at RT |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at RT |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at RT |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at RT |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4 °C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at RT |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at RT |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at RT |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at RT |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2 - 8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at RT |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
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