Introduction
Den viktigste fysiologiske rollen til skjelettmuskulatur mitokondrier er å frembringe ATP fra en oksidativ fosforylering. Viktigere, muskelavslappende mitokondriene spiller en spesiell rolle i treningskapasitet 2, aldring 3, degenerative sykdommer 4 og type II diabetes 5. Som et aldrende samfunn, og Type II Diabetes er den 7. største dødsårsaken i USA seks, har behovet for metoder som vurderer mitokondrienes funksjon blitt stadig mer utbredt i biomedisinsk forskning 7,8. Nærmere bestemt har måling av oksygenforbruket eksepsjonell nytte i vurderingen av mitokondriell funksjon siden den representerer koordinerte funksjonen mellom mitokondrielle og nukleære genom til å uttrykke funksjonelle komponenter av oksidativ fosforylering 9.
Flere teknologier eksisterer som muliggjør måling av oksygenforbruket i intakte celler og isolered mitokondrier 7-10. I tillegg har tester blitt utviklet for flere celletyper og vev, og i en rekke arter som gir mulighet for måling av mitokondrielle trasé og luftkontroll 9,11,12. Men det er i dag et tomrom i litteraturen i forhold til utarbeidelse av alle disse analysene bruker isolerte mitokondrier fra mus skjelettmuskulatur for bruk i mikro basert oksygenforbruk teknologier. Viktigere er bruk av mikro basert respirometrisk analyser vokser blant mitokondrielle biologer og gir mulighet for høy gjennomstrømning målinger ved hjelp av minimale mengder av isolerte mitokondrier 9. Derfor ble en samling av mikro basert respirometrisk analyser utviklet som gjør det mulig å påpeke hvor abnormaliteter og / eller modifiseringer som kan ha oppstått i elektrontransportkjeden (ETC). I tillegg ble to ekstra mikro basert respirometrisk analyser utviklet som gjør det mulig å vurdere samordning between trikaboksylsyre (TCA) syklus og ETC, og mellom ß-oksidasjon og ETC. Viktigere, de presenterte metodene gir en klar og konsis måte å måle mekanistiske endringer i mitokondrienes funksjon i en vanlig dyremodell.
Protocol
MERK: Denne protokollen begynner etter at man har isolert mitokondriene fra rød skjelettmuskulatur. Mitokondrier ble isolert som tidligere beskrevet fra ~ 75 - 100 mg av rød skjelettmuskulatur 13. Mellom 5 - 10 ug / ul av mitokondrie protein vil bli oppnådd fra denne mengden av vev ved resuspendering den endelige pellet i mitokondrie ≤50 ul av isolasjonsbuffer for mitokondrier (IBM) 2 (se Frisard et al 13).
1. Setup
- Forbered arbeider stamløsninger (tabell 1) og mitokondrielle analyseløsning (MAS) blandinger (tabell 2) for senere analyser.
Merk: Det meste av forberedelsene til analyser kan gjøres på forhånd som de fleste aksjer løsninger og MAS kan lagres. - Hydrat en respirometrisk analysen patron i 1 ml kalibreringsløsning kvelden før eksperimentet i et ikke-CO 2 inkubator ved 37 ° C.
- Dagen for forsøket, tÅke ut frossen fisk (underlag og mitokondrielle modulatorer, MAS mix, MAS w / o BSA, Tabell 1) og tine i 37 ° C badekar eller inkubator.
- Forbered alle substrat løsninger (Tabell 3) og injeksjoner (Tabell 4-5) og justere pH som ønsket (pH 7,4). Etter at pH er justert, oppbevares på is.
- Program multi godt oksygenforbruk måling maskin til riktig mix, vent, og måle parametere (se tabell 6) og etiketten bakgrunn og gruppe / tilstand brønner ved å først oppgi analyse programvare, etterfulgt av "Standard" modus.
- Gå inn i "Gjest" forum og klikk på "analysen Wizard". En gang i "analysen Wizard", klikk på "Protocol" for å endre miksen, vent, og måle parametere. Merke bakgrunnen brønnene under "Back. Korreksjon "fanen og sørg for å markere" Gjør bakgrunnen korreksjon ".
- Etiketten dirigentitions ved først å klikke på "Grupper & Etiketter" -kategorien, etterfulgt av "konsernet Info" -fanen. Etter disse parametrene er lagt inn, klikk på "End", etterfulgt av "Lagre mal".
2. Analyse Run
- Laste injeksjonsløsninger inn i en analysekjøring kassett og starte kalibreringen ved å først oppgi analyse programvare, etterfulgt av å skrive inn "Standard" modus. Gå inn i "Guest" forum. Åpne malen lagret i trinn 1.5 under "XF" kjøring, under "Maler" -kategorien. Når åpen, klikker du på "Start" for å starte kalibreringen.
Merk: analysekjøring Kassetten må legges inn i maskinen med det skrå hjørnet til venstre. Dette tar ca 30 min. Vær nøye med å injisere løsninger i de riktige portene. Injeksjoner i Tabell 4-5 er oppført etter lasting. - Forsiktig, men grundig blande mitochondria lager ved omrøring av løsningen med en 200 ul pipette, etterfulgt av forsiktig triturering av papir med en 200 ul pipettespiss som har hatt sin munning utvidet ved å kutte ~ 3 mm fra enden av spissen med en saks.
- Utføre en bicinchoninic syre (BCA) analyse for å bestemme proteinkonsentrasjonen i det mitokondrielle lager.
- Ved hjelp av lager-konsentrasjon ervervet fra trinn 2.3, resuspender 10 ug mitokondrie protein / 200 pl succinat / rotenon substrat blanding (tabell 3). Resuspender 14 ug mitokondrie protein / 200 pl av de gjenværende substratblandinger (Dette må gjøres for hver enkelt substrat mix) (tabell 3). Plassere alle mitokondrie protein / underlaget blander på is.
Merk: Den optimale mengden av mitokondrie protein per brønn for hver analyse ble bestemt som tidligere beskrevet ni. Det ble fastslått at pyruvat / malat, palmitoyl karnitin / malat, glutamat / malat end elektronstrøm-analyser benytter 3,5 ug av mitokondriell protein, mens suksinat / rotenon assay anvender 2,5 ug mitokondrie protein per brønn. Derfor må forskeren å suspendere nok mitokondrie protein for fire replikerer i dette trinnet siden enten 2,5 mikrogram eller 3,5 mikrogram per 50 fil er lastet per brønn (Se trinn 2.6). - Bland mitokondriene / substrat-løsninger forsiktig, men grundig ved omrøring av løsningen med en 200 ul pipette, etterfulgt av forsiktig triturering av papir med en 200 ul pipettespiss som har hatt ~ 3 mm fra enden kuttes.
- Plasser en cellekulturplate på is og i tre eksemplarer, belastning 50 ul / brønn av hver av mitokondrier / substratblandinger. Utviklerne av mikroplatebasert respirometrisk analysen anbefaler å la minst to tomme (ingen mitokondrier) brønner, fortrinnsvis på hver side på cellekultur plate.
- Spinn cellekulturplate i 2000 g i 20 min ved 4 ° C. Mens platen er slåsing, varme opp substratet løsninger i et 37 ° C vannbad.
- Etter spinningen er ferdig, nøye laste 450 mL av hver substratoppløsning på toppen av sine respektive brønner (dvs. laste pyruvat / malate substrat til brønnene som har mitokondrier i utgangspunktet resuspendert i denne substratoppløsning). Husk å legge platen på RT. Merk: Blanke brønner skal være lastet med 500 mL av underlaget. Tomme brønner utpekt for elektronstrømmen analysen bør være lastet med elektronstrømmen substrat (Pyruvate / Malate + FCCP), mens kombinert analyse tomme brønner kan lastes med noen kopling analysen underlaget.
Merk: Hvis du utfører de koplede og elektronstrømningsanalyser på samme plate, må forskeren overføre bakgrunnen brønnene til de respektive analysene etter at analysekjøring er ferdig med "XF Reader" plattform via "Instrument" -kategorien. Når innenfor "Instrument" innstilling, klikk på "Administrasjon"tab, etterfulgt av "Bakgrunn Correction". Hit "End Instrument Setup Mode" når du er ferdig. Dette skyldes at kombinasjonen av askorbat / TMPD kan forbruke O 2, og dermed en separat bakgrunnskorreksjon som er nødvendig for hver analyse type. - Etter at 450 pl av substrat tilsettes hver brønn, vise lag av mitokondriene i brønnen for å sikre at mitokondriene er dispergert jevnt i en enkelt monolag (20X forstørrelse [Se Rogers 9, figur 4]). Brønner som ikke synes å ha en jevnt fordelt enkeltlag kan fjernes post hoc.
- Etter å ha sjekket for mitokondrie tilslutning, setter mikro inn i respirometrisk analyse instrument og starte analysen kjøres ved å klikke på "OK".
Merk: Kalibrerings fra trinn 2.1 må være komplett før løp vil begynne. Når forskeren klikker "OK", vil maskinen ta ut verktøyet plate som ble brukt for kalibrering.- <li> Fjern verktøyet plate og plasser cellekultur plate som inneholder mitokondrier på skuffen. Den blå hakket på cellekultur plate bør plasseres i nedre venstre hjørne av skuffen. Klikk på "fortsett" for å starte analysekjøring.
- Når platen er matet ut, fjern og kast cellekultur plate og kassett og klikk "Fortsett" på skjermen. Løp vil automatisk bli lagret som en .xls fil i "Data" fil.
- Neste endring til "Point-to-Point priser" "Middle Point" under "Rate data vises som:" alternativet. Klikk "OK" for å lagre disse endringene.
- Klikk på "Well Group Mode" fanen nederst til venstre på skjermen til å gruppere brønner på lignende forhold sammen. Til slutt klikker du på "Sample Mean / Standard Error" fanen mot midten av skjermen, til venstre. Alternativt kan disse kommandoene settes opp før analysen begynner i "analysen Wizard" setting.
Merk: Hver tilstand vil ha et gjennomsnittlig ± standardavvik vises for hver sats, og hver betingelse. Det er rente målinger per tilstand (State 2 [Coupling] / State3u [Electron Flow] åndedrett etterfulgt av fire injeksjoner). Bruk gjennomsnittet av staten to rate på den andre målingen, bestemme State 4o på minimum punkt etter oligomycin injeksjon, bruker maksimumspunktet for State 3 og State 3U etter ADP og FCCP injeksjon, henholdsvis, og bruke minst mulig poeng for antimycin indusert åndedrett for koblingen analyser. Bruk maksimumspunktet for pyruvat / malat indusert State 3U åndedrett, bruke minst muligpunkt for rotenon indusert åndedrett, bruker maksimumspunktet for suksinat indusert State 3U åndedrett, og bruke minimumspunkt for antimycin indusert åndedrett for Electron Flow analysen. Alle forsøkene ble utført 3 ganger og dataene som er vist er resultatene av en representativ tracing.
Representative Results
Figur 1 representerer oksygenforbruk (OCR) til pyruvat / malat, suksinat / rotenon, palmitoyl karnitin / malat, og glutamat / malat analyser (Coupling Analyser). Disse analyse tracings vises som oksygenforbruk Rate, eller OCR, kontra tid, er bakgrunnen correceted, og vises som punkt-til-punkt-priser. Hvert panel representerer oksygenforbruk i ulike mitokondrie tilstander som beskrevet av Chance og Williams 14. Det første panel representerer basaloksygenforbruk, eller State 2. Det andre panelet, etter injeksjon av ADP, representerer maksimal koplet åndedrett eller State 3. Den tredje panel, etter injeksjon av oligomycin A (en inhibitor av Complex V), representerer respirasjon grunn til proton lekkasje, eller stat 4o. Den fjerde panel, etter injeksjon av FCCP, representerer maksimal frakoplet åndedrett eller State 3U. Til slutt, det femte panel, etter injeksjon av antimycin A, representerer inhibering av oksydativ åndedrett. Spesielt, all mitokondrie stater har minimal standardavvik. Dette skyldes grundig blanding av det mitokondrielle lager og mitokondriene / substratblandinger, og oppnåelsen av et enkelt monolag av mitokondriene etter tilslutning spin (trinn 2.6). På den annen side, lasting ulike mitokondrier i hver brønn og ikke oppnå et enkelt monolag av mitokondrier i brønnene på mikro fører til økt standardavvik på hver tilstand som vist i figur 2.
De tracings i figur 1 skjerm platåer for hver mitokondrie staten og for hvert substrat. Platået oppnådd etter to målesykluser antyder god mitokondrie kvalitet, og at mitokondriene forblir klebet til brønnen gjennom hele analysen. I tillegg, kan oppnåelsen av plateaued maksimale priser kan være mer ønskelig, da dette gjør det mulig for forskeren til å ta gjennomsnittet OCR på følgende mitokondrielle tilstander, og dermed redusere forspenningen som kan oppståav vilkårlig velge et punkt.
Mengden av mitochondria per brønn, ble bestemt ved optimaliseringsforsøk. Den optimale mengden av mitokondrier per brønn bør resultere i tilstand 2 priser mellom 100-200 pmol / min / brønn og statlige 3 priser <1 500 pmol / min / brønn, siden disse verdiene er innenfor det dynamiske oksygenføleområdet til multi-brønn oksygen forbruksmåling maskin. Lasting av for mye mitokondrie protein per brønn kan medføre OCRs utenfor det dynamiske området til instrumentet (figur 3A). Figur 3 viser lasting av 3,5 ug av mitokondrie protein per brønn (blå tracing) i forhold til laste 2,5 ug mitokondrie protein per brønn (red tracing) for suksinat / rotenon assay. Lasting av for mye mitokondrie protein per brønn kan også føre til konsumpsjon av oksygen i mikrokammeret for brønnen, og dermed hindre nøyaktig måling av OCR for hvert påfølgende måling 9 (figur 3B </ strong>). Punkt-til-punkt-OCR er den momentane endringstakten av OCR. Hvis flat, er den OCR jevn / stabil, men hvis reduseres, så kan det være et biologisk eller teknisk problem. Den bratte nedgangen i OCR i State 3 og State 3U respirasjon (figur 3A) er forårsaket av mitokondriene utmattende oksygentilførselen før slutten av målingen (Figur 3B).
Figur 4 representerer OCR i forhold til tiden for elektronstrømmen analysen. Sporing er korrigert og vist som beskrevet i figur 1. Den første panelet i denne undersøkelse representerer State 3u åndedrett på pyruvat / malat via Complex I. Det andre panelet, etter injeksjon av rotenon, representerer inhibering av Complex I mediert åndedrett. Den tredje panel, etter injeksjon av suksinat, representerer underlaget stimulert State 3U med elektroner inn i ETC ved Complex II (Complex II mediert åndedrett). Den fjerde panel, etter injeksjon av Antimycin A, representerer hemming av Complex III og dermed total åndedrett. Til slutt, det femte panel, etter injeksjon av askorbat / TMPD, representerer Kompleks IV medierte åndedrett. I likhet med de tracings i figur 1, alle mitokondrielle stater har minimal standardavvik, og hver sats har eller nesten har nådd et platå.
Figur 1. Koblings Assays. (A) 10 mM pyruvat / 5 mM malat, (B) 10 mM succinat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoyl karnitin / 1 mM malat, og (D) 10 mM glutamat / 10 mM malat koplet mitokondrie åndedrett analyse tracings som bestemt ved multi-brønn måling av oksygenforbruk. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Mitokondrie protein lastet per brønn var 3,5 mikrogram for alle analyser unntatt suksinat / råteenon, som benytter 2,5 ug mitokondrie protein per brønn. Data representerer n = 3 sammenkoblede biologiske replikater. OCR = oksygenforbruk Rate; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Anti-A = antimycin; PYR = Pyruvat; SUCC = Succinat; ROT = Rotenon; PAL-C = palmitoyl karnitin; GLUT = glutamat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. svært variabel Pyruvate / Malate analysen. Meget variable 10 mM pyruvat / 5 mm malat analysen forårsaket av ufullstendig blande mitokondrier fra mitokondrie lager i underlaget / MAS mix, og dermed fører til variabel mitokondrie protein lasting i hver brønn. Mitokondrie protein lastet per brønn var 3,5 mikrogram. Data representerer n = 3 sammenkoblede biologiske replikater. OCR = oksygenforbruk Rate; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Anti-A = antimycin; PYR = Pyruvate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Overbelastning mitokondrie Protein for Succinat / Rotenon analysen. (A) oksygenforbruk utenfor det dynamiske området for multi-brønn oksygenforbruksmåling maskinen som følge av lasting 3,5 ug mitokondrie protein per brønn (blå tracing) i forhold til laste 2,5 ug mitokondrie protein per brønn (red tracing). (B ) Oxygen spenning nærmer seg null følgende ADP og FCCP injeksjoner forårsaket ved å laste dreven mitokondrie protein (3,5 mikrogram) per brønn (blå tracing) i forhold til å legge på en optimal mengde (2,5 mikrogram) av mitokondriell protein per brønn (rød tracing). Data representerer n = 3 sammenkoblede biologiske replikater per mitokondrie protein beløp. OCR = oksygenforbruk Rate; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Anti-A = antimycin; SUCC = Succinat; ROT = Rotenon; O 2 = oksygen; mm Hg = millimeter kvikksølv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Electron Flow-analysen. 5mM pyruvat / 1 mM malat + 4 mikrometer FCCP, elektron flav mitokondriell respirasjon assay tracing som bestemt ved multi-brønn måling av oksygenforbruk. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Mitokondrie protein lastet per brønn var 3,5 mikrogram. Data representerer n = 3 sammenkoblede biologiske replikater. OCR = oksygenforbruk Rate; Anti-A = antimycin; Asc = Askorbat; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- p fenvlendiamin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Stock Konsentrasjon | MW | Endelig Volume | Mass Lagd | Kommentarer / beskrivelse | ||||||
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g eller ml) | ||||||||
| EGTA, pH 7.2 | 0.1 | 380,35 | 100 ml 1M Tris Base | 3,801 g | Oppbevar ved 4 ° C | ||||||
| HEPES | 1 | 238,3 | 250 ml DIH 2 O | 59. 57 g | Oppbevar ved 4 ° C | ||||||
| MgCl2, heksahydrat | 1 | 203,31 | 250 ml DIH 2 O | 50.82 g | Oppbevar ved 4 ° C | ||||||
| Pyruvat pH 7,4 | 0.1 | 88.06 (Kommer som 14.11 M løsning) | 40 ml DIH 2 O | 0,283 ml pyruvinsyre | Gjør 1 ml prøver og oppbevar ved -20 ° C, lage fersk hver uke | ||||||
| Suksinat pH 7,4 | 0.5 | 118,09 | 100 ml DIH 2 O | 9,4 g succinic syre | Gjør 1 ml prøver og oppbevar ved -20 ° C | ||||||
| Malat, pH 7,4 | 0.5 | 134,09 | 100 ml 95% etanol | 6,7 g eplesyre | Gjør 200 ul porsjoner og oppbevar ved -20 ° C | ||||||
| TMPD | 0,01 | 164,25 | 10 ml | 0,0164 g | Gjør 300 ul porsjoner og oppbevares ved -20 ° C; Bland med en ekvimolar mengde av askorbat for å holde TMPD redusert | ||||||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | 0,01 | 436,07 | 1,14 ml av 95% etanol | 0,005 g | Lag 40 ul porsjoner og oppbevar ved -20 ° C | ||||||
| Oligomycin A | 0,006 | 791,06 | 0,987 ml av 95% etanol | 0,005 g | Gjør 20 ul porsjoner og oppbevar ved -20 ° C | FCCP | 0,01 | 254,17 | 3,9 ml av 95% etanol | 0,01 g | Lag 40 ul porsjoner og oppbevar ved -20 ° C |
| Rotenon | 0,001 | 394,4 | 10 ml 95% etanol | 0,0039 g | Oppbevares ved -20 ° C | ||||||
| Antimycin | 0.005 | 548,63 | 9.12 ml av 95% etanol | 0,025 g | Oppbevares ved -20 ° C | ||||||
| K + ADP | 0.5 | 501,32 | 3,9 ml av DIH 2 O | 1,0 g | Oppbevares ved -20 ° C | ||||||
| Eplesyre, pH 7,4 | 0.5 | 134,09 | 40 ml | 2,68 g | Gjør 200 ul porsjoner og oppbevar ved -20 ° C |
| Reagens | Stock Konsentrasjon | Mass Lagd | Sluttmolariteten / Percent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| Sukrose | - | 11.98 g | 70 mm |
| Mannitol | - | 20.04 g | 220 mm |
| Monobasisk kaliumfosfat | - | 0,34 g | 5 mm |
| MgCl2, heksahydrat | 1 | 2,5 ml | 5 mm |
| HEPES | 1 | 1,0 ml | 2 mm |
| EGTA | 0.1 | 5,0 ml | 1 mm |
| Hovedsak Fatty Acid Fritt- BSA | - | 1,0 g | 0,20% |
. Tabell 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: Delmengde 25 ml og oppbevares ved -20 ºC * Merk: Ekskluder BSA for MAS mix brukes for analyse injeksjoner.
| Underlaget Medium | Endelig Konsentrasjon | Mengde lager (pl) | Mengde MAS (ml) |
| Pyruvat / Malate | 10 mM / 5 mM | Pyruvat: 1000 | 9 |
| Malat: 100 | |||
| Succicinate / Rotenon | 10 mM / 2 pM | Suksinat: 200 | 10 |
| Rotenon 20 | |||
| * Pyruvat / Malate + FCCP | 5 mm / 1 mm / 4 mikrometer | Pyruvat: 500 | 10 |
| FCCP: 4 | |||
| Malat: 20 | |||
| Palmitoyl L-karnitin / Malate | 40 mikrometer / 1 mM | Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20 | 10 |
| Glutamat / Malate | 10 mM / 10 mM | Glutamat: 400 | 10 |
| Malat: 200 |
Tabell 3. Substrat Solutions pH 7.4: Gjør frisk dagen av eksperimentet. * Electron flyt analysen løsning.
| Injeksjon Medium | Konsentrasjon | Mengde lager (pl) | <td> Mengde MAS (ml)Mengden injisert i Cartridge | Endelig Konsentrasjon | |
| (Etter injisert i plate) | |||||
| ADP | 50 mm | 300 mL | 3 | 50 pl | 5,0 mm |
| Oligomycin A | 20 pM | 10 mL | 3 | 55 mL | 2,0 mikrometer |
| FCCP | 40 mikrometer | 12 pl | 3 | 60 mL | 4,0 mikrometer |
| Antimycin | 40 mikrometer | 24 mL | 3 | 65 mL | 4,0 mikrometer |
Tstand 4. Injeksjoner for Coupled Analyser pH 7,4. Gjør frisk dagen av eksperimentet. * Koblings analyser inkluderer (men er ikke begrenset til) pyruvat / malat, suksinat / rotenon, palmitoyl karnitin / malat, og glutamat / malat.
| Injeksjon Medium | Konsentrasjon | Mengde aksjer (g eller ul) | Mengde MAS (ml) | Mengden injisert i Cartridge | Endelig konsentrasjon (Etter injisert i plate) |
| Rotenon | 20 pM | 60 mL | 3 | 50 pl | 2,0 mikrometer |
| Suksinat | 50 mm | 300 mL | 3 | 55 mL | 5,0 mm |
| Antimycin | 40 mikrometer | 24 μ; l | 3 | 60 mL | 4,0 mikrometer |
| TMPD / Ascorabte | 1 mM, 100 mM | TMPD: 300 mL | 3 | 65 mL | 100 mikrometer, 10mm |
| Askorbat: 0,059 g |
Tabell 5. Injeksjoner for Electron Flow analyse pH 7,4. Gjør frisk dagen av eksperimentet
| Command | (Min) | # Sykluser |
| Kalibrere | ||
| Vente | 10 min (for å tillate platen å varme fra adherenstrinn) | |
| Bland | 1 min | 2 |
| MegASURE | 2 min | |
| Injisere A | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Måle | 2 min | |
| Injisere B | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Måle | 2 min | |
| Injisere C | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Måle | 2 min | |
| Injisere D | ||
| Bland | 1 min | 2 |
| Måle | 2 min |
Tabell 6. Instrument Run Protocol.
Discussion
Metodene som presenteres i denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner for ytelsen til en samling av mikro basert respirometrisk analyser ved hjelp av mitokondrier isolert 75-100 mg mus skjelettmuskulatur. Disse analysene kan utføres med høy presisjon som gjenspeiles av den stramme standardavvik mellom triplikatbrønner. Viktigere, disse respirometrisk analyser tillater pinpointing av hvor abnormaliteter og / eller tilpasninger som kan ha oppstått i ETC, TCA syklus, β-oksidasjon vei, underlaget transportører, etc. i en vanlig dyremodell.
Det er viktig å synliggjøre begrunnelsen for bruk av ulike typer brensel og hemmere brukes i denne protokollen. Den pyruvat / malat og glutamat / malat respirometrisk analyse tillater vurdering av komplekset I mediert åndedrett, så vel som vurdering av de respektive transportører, og i tilfelle av glutamat, den 15 deaminase. Alternativt kan en kombinasjon avsuccinate / rotenon gjør vurderingen av mitokondrieåndedretts fluks gjennom Complex II av ETC siden rotenon hemmer kompleks jeg og succinate gir elektroner til Complex II via reduksjon av flavin adenindinukleotid (FADH 2) 15. Disse analyser tilveie substrat spesifikk informasjon med hensyn til koblingsgrad og maksimal respirasjon. Elektronet flyt analysen er unik i at kombinasjonen av substrater og hemmere gir mulighet for vurdering av flere komplekser under mitokondrieluft flux 9. Den initiale substratet blanding av pyruvat / malat + FCCP muliggjør evaluering av maksimal respirasjon drevet av Complex I, mens injeksjon av rotenon, etterfulgt av succinat muliggjør vurdering maksimal respirasjon drevet av komplekset II. Injeksjon av antimycin A, en inhibitor av Complex III, etterfulgt av injeksjon av askorbat / TMPD tillate for evaluering av respirasjon drevet av Complex IV ettersom Askorbat / TMPD er enelektron donor til Cytokrom C / Kompleks IV. Mens ingen informasjon om koblings effektivitet oppnås, er metoden ideell for svært små utvalg som utelukker kjører flere underlag uavhengig. Til slutt tillater bruken av palmitoyl karnitin / malat for vurdering av koordineringen mellom β-oksidasjon og ETC siden reduksjonstilsvarende fremstilt fra oksidasjon av palmitinsyre (β-oksidasjon) mates inn i ETC gjennom elektron overføring flavoprotein 15. Det skal bemerkes at koplingen og elektronstrømning assays kan også bli brukt i tandem for å identifisere endringer i mitokondriefunksjon på grunn av noen intervensjon (behandling, genetisk manipulering).
Den høye presisjon oppnås for disse analyser er først og fremst på grunn av grundig blanding av mitokondriene, uansett om det er før proteinbestemmelse, eller med substratet løsninger. Langs disse linjene, er når mitokondriene resuspendend i underlaget løsning;ns, er det avgjørende å blande denne oppløsning grundig før lasting av cellekulturplaten som beskrevet i trinn 2.2 med en utvidet åpning pipettespiss. Unnlatelse av å blande mitokondriene grundig vil føre til store variasjoner i analysen. I tillegg, ved hjelp av en smal åpning pipettespissen vil skape skjærkrefter under blanding av mitochondria og øker potensialet for å skade mitokondrielle membraner og frigjøring av cytokrom C. adherenstrinn (2,7) også er et kritisk trinn i denne protokollen. Unnlatelse av å spinne den belastede cellekulturplaten lenge / hurtig nok vil resultere i ufullstendig klebing av mitokondriene til brønnen, og dermed fører økt variasjon mellom brønnene og målinger.
Den beskrevne protokollen er optimalisert for å inkludere: lasting en optimal mengde av mitokondriell protein per brønn, bruker de riktige konsentrasjoner / tilberedningsmetoder for å gjøre aksje- og underlaget løsninger, endre analysekjøring for å sikre mitokondrie tilstand plateaus, og passende blanding av mitokondrie lager og mitokondrie / substratblandinger. Før disse optimalisering innsats, forfatterne møtte fallgruvene i analysen løp. Følgende diskuterer feilsøkingsmetoder / modifikasjoner som var nyttig i å optimalisere denne protokollen. Med hensyn til optimal lasting, vil laste for lite mitokondriene ikke lokke fram en robust respons, mens lasting for mye mitokondrier vil eksos oksygen inne i mikrokammeret og føre til unøyaktige målinger. Rogers et al 9 gir eksempler på å bestemme optimale laste mengder mitokondrier per brønn for mikro basert respirometrisk analyser. Oftere, er for mye mitokondrier lastet per brønn som dokumentert av staten 2 priser i løpet av 100-200 pmol / min / godt og stat 3 priser> 1500 pmol / min / brønn. Hvis over lasting skjer, utføre et eksperiment med varierende konsentrasjon av mitokondriell protein (f.eks mellom 1 -. 10 mikrogram) for å lokke fram OCRs innenfor den dynamiske range av oksygenforbruksmåling maskin. Klargjøring og bruke de riktige konsentrasjonen av substrater og aksjer er av største betydning. Bruk alltid syreformen av underlag / injeksjoner og justere pH med kaliumhydroksid eller HCl; natrium buffere / løsninger er ikke anbefalt. I tillegg nytt oppslemme substrater / lager i DMSO eller 100% etanol fører til målingsfeil eller feil. Pass på å bruke 95% etanol der det er angitt. Det er vanlig for palmitoyl karnitin å utfelles fra 95% etanol etter tining av frosset lager, og dermed forårsaker stor variabilitet. Husk å varme opp palmitoyl karnitin lager og virvle godt før bruk. I tillegg kan en svært variabel pyruvat / malat assay-resultatet skyldes det pyruvat lager vesen> 2 uker gamle. Sørg for å remake frosne prøver av pyruvat hver 2. uke. Analysen løp ble endret til to-min målinger for å sikre mitokondrielle statlige platåer. Hvis observasjon av utmattelse av ADP er ønsket, forskeren kanutvide måletiden under "Protokoll" fanen under "analysen Wizard" forum. Endelig skjer stor variasjon når det mitokondrielle aksje- og mitokondrier pluss substrat løsninger ikke er homogenisert fullt før lasting. Hvis variasjon mellom brønnene er høy etter at analysekjøring, sørg for å fullt blande substratoppløsningen før neste eksperiment. Aldri vortex mitokondriene / underlaget løsninger, heller røre, mos, og forsiktig triturer med en utvidet åpning pipettespissen.
Det er noen begrensninger i denne teknikken som er verdt å merke seg. For det første er antallet brønner på cellekulturplaten anvendt for disse analyser relativt lav (f.eks., 24 brønner og minst to angitt for blanke brønner). Hvis det er ønskelig å utføre alle fem av disse analyser på en plate, er forskeren bare i stand til å undersøke svarene fra en mus på en gang. Imidlertid bør det bemerkes at 96-brønners instrumenter er tilgjengelige for higher gjennomstrømming. Dernest er det iboende styrker og svakheter i vurderingen av mitokondriell dysfunksjon i isolerte mitokondrier i forhold til i intakte celler 1. Noen svakheter inkluderer å ha mindre fysiologiske relevans i forhold til intakte celler og induserer gjenstander fra isolasjon prosessen. Endelig er suksessen med denne metoden avhengig av kvaliteten på den mitokondrielle isolasjonsprosess.
Selv om noen av disse analyser enten er utviklet i forskjellige systemer, eller har blitt validert i andre dyremodeller, er den første til å syntetisere alle de nevnte analyser for optimal bruk i en multi-brønn oksygenforbruksmåling maskinen ved hjelp av musen metodene som presenteres heri skjelettmuskulatur. Viktigere, kan alle fem av disse analyser utføres med mengden av mitokondriene isolert fra ~ 75 - 100 mg av mus skjelettmuskulatur, noe som gir høy gjennomstrømning med minimal materiale. Av stor betydning, evne til multi-brønnoksygenforbruk teknologi for å utføre analyser med minimale mengder av mitokondrier, kombinert med en optimalisert isolasjonsmetoden, gjør det mulig for forskeren til å utføre en rekke andre forsøk med det gjenværende av skjelettmuskelvevet (f.eks., western blotting, RT-PCR, enzymatiske analyser etc.), som ofte er en kamp med denne dyremodell.
I konklusjonen, metodene som presenteres her gir trinnvise instruksjoner for ytelsen til en samling av mikro basert respirometrisk analyser ved hjelp av minimale mengder av mus skjelettmuskulatur. Viktigere, de presenterte metodene krever minimale mengder vev og mitokondrier. Når mestret, vil de teknikker som er beskrevet her tillater forskere å fastslå en mulig mekanisme av en forbindelse eller genprodukt på mitokondrieoksygenforbruket i et vanlig anvendt dyremodell.
Disclosures
George W. Rogers er en ansatt i Seahorse Bioscience som produserer instrument som disse analysene ble utviklet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at RT |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at RT |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at RT |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at RT |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at RT |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at RT |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4 °C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at RT |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at RT |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at RT |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at RT |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2 - 8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at RT |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).
- Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Frisard, M. I., et al. Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle. Metabolism. 64, 416-427 (2015).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).
- Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).
