Abstract
مختلة الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي تلعب دورا في عملية التمثيل الغذائي تغير لاحظ مع الشيخوخة والبدانة ومرض السكري من النوع الثاني. المقايسات respirometric الميتوكوندريا من التحضيرات الميتوكوندريا المعزولة تسمح لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، وكذلك تحديد آلية (ق) للعمل الأدوية والبروتينات التي تعدل الأيض. وغالبا ما تتطلب إجراءات العزلة الحالية كميات كبيرة من الأنسجة لانتاج الميتوكوندريا عالية الجودة اللازمة لفحوصات respirometric. الطرق الواردة في هذه الوثيقة تصف كيف عالية الجودة الميتوكوندريا المنقى (~ 450 ميكروغرام) يمكن عزله عن كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي للاستخدام في قياسات الجهاز التنفسي إنتاجية عالية. توصلنا إلى أن طريقة عزلتنا ينتج 92.5 ± 2.0٪ الميتوكوندريا سليمة من خلال قياس النشاط سينسيز سترات طيفيا. بالإضافة إلى ذلك، أدى تحليل لطخة غربية في الميتوكوندريا المعزولة في التعبير خافت من cytosoالبروتين يسانس، GAPDH، والتعبير القوي للبروتين الميتوكوندريا، COXIV. عدم وجود الفرقة GAPDH بارزة في الميتوكوندريا المعزولة يدل على التلوث القليل من مصادر غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل. الأهم من ذلك، وقياس معدل استهلاك O 2 مع لوحة الصغيرة القائمة على التكنولوجيا وتحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) لفحوصات respirometric المترابطة معارض البالغ الاقتران (RCR؛ <6 لجميع المقايسات) والميتوكوندريا وظيفية. في الختام، إضافة خطوة تنميق منفصلة وسمحت تخفيض كبير بالمواتير سرعة تجانس طريقة عنها سابقا عزلة جودة عالية والميتوكوندريا تنقيته من كميات صغيرة من الماوس العضلات والهيكل العظمي الذي ينتج في الميتوكوندريا بالإضافة جدا أن نتيجة التنفس مع وظيفة عالية خلال صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometirc.
Protocol
أجريت الدراسات على الحيوانات في إطار البروتوكول التي وافق عليها رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في معهد البوليتكنيك فرجينيا وجامعة ولاية.
1. إعداد (الوقت: ~ 45 دقيقة)
- مخازن تجميد ذوبان الجليد من 0.25٪ التربسين، عزل عازلة للالميتوكوندريا (IBM) 1 وIBM2 في حمام مائي 37 ° C.
- شطف الأواني الزجاجية وأدوات تشريح في الايثانول 70٪ تليها مياه عالية النقاء.
- إعداد 0.05٪ محلول التربسين من 0.25٪ التربسين الأسهم عن طريق تمييع 1 جزء التربسين في 4 أجزاء IBM1.
- مزيج البروتيني والفوسفاتيز المانع كوكتيل مع العازلة تحلل الخلية (1: 100 نسبة) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع غطاء المسمار.
- قسامة 5 مل (5 مل / الماوس) من 0.05٪ التربسين في أنبوب من البلاستيك 15 مل.
- تعيين بالمواتير الخالط الأنسجة إلى 80 دورة في الدقيقة.
2. عزل العضلات والهيكل العظمي الميتوكوندريا (الوقت: ~ 90 دقيقة)
- الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2
- إزالة العضلات الحمراء من عضلات الفخذ والساق العضلات، والذي يتضمن النعلية (75-100 ملغ ~ الكل) كما هو موضح في الخطوات التالية:
- قشر الجلد نحو الماوس.
- إزالة لوحة الدهون أكثر من نقطة الأصل الرباعية الرؤوس. قطع العضلة رباعية الرؤوس التي يتم تركيبها على الرضفة مع مقص يميل غرامة.
ملاحظة: يتم التعرف على عضلات الفخذ التي كتبها الوضعية التشريحية على الجزء الأمامي من الفخذ القريبة. - قص ببطء صفاق بين العظام وعضلات الفخذ، مع تجنب الشريان الفخذي، لتحرير عضلات الفخذ من العظم. قطع الوتر مع مقص يميل غرامة عند نقطة الأصل على عظم الفخذ لتحرير عضلة الفخذ ووضع عضلة الفخذ في برنامج تلفزيوني برود.
- إزالة الأنسجة الدهنية واضحة على عضلات الفخذ مع مقص. الوجه عضلات الفخذ بحيث تكون جزء من العضلات التي كانت تغمر عظم الفخذ يواجه شص. فتح عضلة الفخذ مع ملقط في حركة تأجيج. إزالة اثنين من مرئية أجزاء العضلات الحمراء من كل شحمة الأذن مع مقص يميل الجميلة ومكان في دورق يحتوي على 5 مل من برود IBM1.
ملاحظة: العضلة الرباعية الرؤوس تظهر كما فصين مع شريط من العضلات الحمراء بالقرب من الحافة الجانبية من كل شحمة الأذن. - قطع الجلد المغطي في وتر العرقوب مع غرامة يميل مقص وقشر الجلد نحو الماوس. قطع وتر العرقوب المكشوفة وقشر العضلات نحو جسم الفأر.
- قطع وتر في اللقم الجانبية وسطي من عظم الفخذ مع مقص يميل غرامة لتحرير الساق ووضع الساق تعلق على الأوتار في PBS المبردة.
- الوجه الساق مرارا وتقشر عضلة النعلية ووضع في دورق يحتوي على 5 مل من برود IBM1. مروحة فتح الساق. إزالة الأجزاء الثلاثة البصرية الحمراء العضلات (قطعتين الحمراء الجانبية وسطي واحد السطحية) مع غرامة يميل مقصالصورة ونقلها إلى دورق يحتوي على 5 مل من برود IBM1.
- إزالة ~ 75-100 ملغ أخرى من العضلات الحمراء من الساق الأخرى من الفأرة (كما هو موضح في الخطوة 2.2) ووضع في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع البروتيني والفوسفاتيز المانع كوكتيل وعازلة تحلل الخلية (50 ملي تريس، HCL، 1 ملي EDTA، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 1٪ البولي أوكسي إتيلين (9) nonylphenylether، تشعبت وعلى الفور فلاش-تجميد هذه العينة الثانية في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا في غرب النشاف (راجع الخطوة 6.1).
- وضع سطح البلاستيك شقة قبل المبردة على الجليد في دلو كبير. صب قطرة من IBM1 على سطح البلاستيك واستخدام الملقط لوضع كل من العضلات الحمراء مقطوع (الخطوة 2.2.4 و2.2.7) في IBM1 الحبرية. تخطر على الأنسجة العضلية لمدة 2 دقيقة واحدة باستخدام 3 شفرات الحلاقة حافة بواسطة شفرات الحلاقة تتغير كل 40 ثانية.
- نقل الأنسجة المفروم إلى دورق جديد مع 5 مل من IBM1 جديدة عن طريق الضغط على سطح البلاستيك أكثر من عشرةالبريد كوب وتجريف العضلات في الكأس بشفرة حلاقة. خذ هذا الحل واستنزاف من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون وضعت على 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- وصمة عار الأنسجة مع ممسحة مهمة حساسة ومن ثم نقلها إلى 5 مل من محلول التربسين 0.05٪. استخدام ملاقط لإزالة الأنسجة من المساحات المهمة.
- احتضان الأنسجة العضلية على الجليد لمدة 30 دقيقة في 0.05٪ محلول التربسين.
- تدور أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على خليط التربسين / العضلات في 200 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- صب طاف التربسين في حاوية النفايات و resuspend بيليه مع 3 مل من الجليد IBM1 البرد. نقل الأنسجة إلى 45 مل أنبوب زجاجي الخالط. شطف أنبوب مخروطي 15 مل مع 1.5 مل IBM1 آخر لجمع أي عينة المتبقية وهذا إضافة إلى أنبوب زجاجي الخالط.
- وضع أنبوب زجاجي الخالط الى شغل في منتصف الطريق كوب أو حاوية بلاستيكية مع الثلج حتى ينتقل الخالط الزجاج الحد الأدنى داخل الكأس.
- نقل جناسة الأنسجة لأنبوب 15 مل مخروطي الشكل الجديد وشطف أنبوب زجاجي الخالط مع 6.5 مل من IBM1. صب IBM1 إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على جناسة الأنسجة.
- تدور أنبوب مخروطي 15 مل في 700 غ لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب بلطف طاف في كوب قوة عالية أنبوب الطرد المركزي وتجاهل بيليه.
- تدور طاف من الخطوة السابقة في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف IBM1 وإعادة تعليق بيليه بإضافة ببطء 500 ميكرولتر من IBM2. قطع نهاية طرف ماصة والتجانس بلطف بيليه في IBM2 مع الخلط والتقليب الاقتراحات. إضافة 4.5 مل أخرى من IBM2 إلى الخليط بعد تعليق بيليه بالكامل.
ملاحظة: تجنب الإفراط في سحن حين كسر قطعة بيليه أكبر لرله قد يؤدي إلى تلف أغشية الميتوكوندريا. - تدور IBM2 / الأنسجة جناسة في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تكرار هذه الخطوة في نظيفة قوة عالية أنبوب الطرد المركزي لأدق تقدير البروتين الميتوكوندريا معزولة في الخطوة 4 منذ المتبقي BSA قد تسهم في محتوى البروتين الكلي. - إزالة طاف وبلطف، ولكن تماما اعادة تعليق بيليه بإضافة اثنين 25 الزيادات ميكرولتر من IBM2 مع طرف ماصة مع وجهة نظرها قطع. يحرك بلطف وتخلط بيليه بعد كل إضافة 25 ميكرولتر من IBM2. ضع هذا المخزون الميتوكوندريا على الجليد.
3. تجانس النسيج كله المحللة (الوقت: ~ 45 دقيقة، ويمكن أن يتم ذلك خلال الخطوة 7)
- إزالة العضلات من أن وضعت في النيتروجين السائل من الخطوة 2.3 واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى إذابة تماما.
- تخطر على الأنسجة ل~ 30 ثانية على الجليد مع مقص يميل غرامة.
- إضافة إلى اثنين من المجارف 100 ميكرولتر من Zircoأكسيد nium الخرز لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع غطاء المسمار من الخطوة 3.2 الذي يحتوي على الأنسجة المفروم. تجانس الأنسجة في الخالط الأنسجة طاحونة حبة باستخدام 2-3 5 دورات دقيقة في إعداد سرعة 4-6 (الإعداد المتوسط).
- تدور خليط من الخطوة 3.3 في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف باستخدام 1000 ميكرولتر ماصة بعد زيادة ونقصان ونقل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تجاهل بيليه ووضع طاف على الجليد.
4. البروتين تحديد (الوقت: ~ 30 دقيقة)
- تحديد تركيز البروتين في الأنسجة المحللة كله (الخطوة 3.4) والأسهم الميتوكوندريا (الخطوة 2.17) باستخدام BCA عدة فحص البروتين وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
5. الميتوكوندريا غشاء النزاهة. سينسيز سيترات (CS) آخر (الوقت: ~ 15 دقيقة)
- جعل اثنين منفصلة 1: 20 التخفيفات من الأوراق المالية الميتوكوندريا في المياه عالية النقاء. إضافة0.1٪ من تريتون 100-X لعينة واحدة ويصوتن ذلك على إعداد منخفض (765 واط، سعة 2). ترك التخفيف الآخرين على الجليد. العودة العينة إلى الجليد بعد صوتنة.
- إجراء فحص سينسيز سترات مع كل من غير sonicated وsonicated التخفيفات الميتوكوندريا باستخدام الفحص الطيفي كما هو موضح سابقا 11،12.
- تحديد النسبة المئوية للأغشية الميتوكوندريا سليمة باستخدام المعادلات التالية:
(غير sonicated النشاط CS ÷ Sonicated النشاط CS) * 100
100- N (في المئة حققت من فوق)
6. الميتوكوندريا الجودة العزلة. الغربية التنشيف (الوقت: وفقا لبروتوكول مختبر)
- أداء النشاف الغربي على المحللة النسيج كله والميتوكوندريا معزولة كما هو موضح سابقا (12).
ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الأولية لGAPDH (1: 1000 تخفيف في 5٪ BSA / TBS-T) وCOXIV (1: 1000 تخفيف في 5٪ الخالي من الدسمالحليب / TBS-T)، يليه مكافحة الماعز، والأرانب الأجسام المضادة الثانوية، على التوالي (1: 10000).
7. Respirometric الفحص تشغيل (الوقت: ~ 90 دقيقة)
- أداء المقايسات respirometric المطلوب باستخدام صفيحة ميكروسكوبية أساس O 2 تكنولوجيا قياس الاستهلاك كما هو موضح سابقا (انظر المادة مصاحب وروجرز وآخرون 8).
- تحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) بتقسيم الدولة 3 في الدولة 4O (RCR) أو تقسيم 3U الدولة من قبل دولة 4O. استخدام أي منتصف (متوسط) نقطة أو أعلى (الدولة 3) وأدنى معدلات (4O الدولة) من آثار نقطة إلى نقطة عند تحديد RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يخدم النشاط سينسيز سترات كمقياس للسلامة الغشاء منذ سينسيز سترات يقع في غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وبالتالي يجب أن لا تكون موجودة في تعليق الميتوكوندريا مع الأغشية سليمة الشكل 1 يمثل النشاط سينسيز سيترات في عينات غير sonicated الميتوكوندريا مقارنة مع sonicated عينات من نفس العزلة. Sonicating نتائج الميتوكوندريا في زيادة ذات دلالة إحصائية في النشاط سينسيز سترات (P <0.01). الأهم من ذلك، كانت 92.5 ± 2.0٪ من الميتوكوندريا سليمة بعد العزلة.
الشكل 2 يصور GAPDH وCOXIV التعبير في الميتوكوندريا المعزولة والهيكل العظمي كله المحللة الأنسجة العضلية. GAPDH هو بروتين الموجود في العصارة الخلوية، ولكن يمكن أيضا أن توجد في نواة بعد النبات، في حين COXIV هو البروتين الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية. التعبير عن GAPDH وCOXIV جلية في TISS كلهالمحللة رق. في الميتوكوندريا معزولة، لوحظ التعبير عن COXIV، في حين فقط العصابات خافت من GAPDH واضحة. هذه النتائج تشير إلى العزلة الميتوكوندريا جيدة، مع تلوث القليل من المكونات غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل.
الرقم 3 هو تتبع ممثل من معدلات استهلاك O 2 (OCR) مقابل الوقت لفحص اقتران (10 ملي البيروفات / 5 ملي مالات) يقوم من الميتوكوندريا المعزولة باستخدام هذا البروتوكول، وأجرى مع صفيحة ميكروسكوبية أساس O 2 تكنولوجيا الاستهلاك. وتمثل كل لوحة O 2 الاستهلاك في الدول الميتوكوندريا مختلفة كما وصفها فرصة ويليامز 13. تمثل الفريق الأول القاعدية استهلاك O 2، أو دولة 2. لوحة الثانية، بعد حقن ADP، تمثل القصوى إلى جانب التنفس، أو دولة 3. لوحة ثالثة، بعد حقن أوليغوميسين A (مثبط لمجمع V)، represeاليلة التنفس نتيجة لتسرب بروتون، أو دولة 4O. لوحة الرابعة، بعد حقن FCCP، يمثل القصوى التنفس وفكت أو 3U الدولة. وأخيرا، لوحة الخامسة، بعد حقن Antimycin A، يمثل تثبيط الأكسدة التنفس. تم احتساب نسبة التنفس التحكم (RCR)، وهو مقياس وظيفة الميتوكوندريا 1، بتقسيم الدولة 3 في الدولة 4O الجدول 4 تقارير القيم RCR متوسط لفحوصات الركيزة اقتران البديلة التي يمكن القيام بها من العائد الميتوكوندريا من هذا البروتوكول. الأهم من ذلك، تتبع استهلاك O 2 وقيم RCR عالية تمثل يعمل للغاية والميتوكوندريا جانب. قيم RCR ذكرت هنا هي أعلى أو ما شابه ذلك مما ذكر في السابق باستخدام بروتوكولات العزلة مماثلة في الفئران العضلات والهيكل العظمي 7،14،15، وبالتالي إبراز جودة عالية من الميتوكوندريا المعزولة خلال هذا الإجراء.
الشكل 1: سترات سينسيز آخر. سترات نشاط انزيم سينسيز كما هو محدد في طيفيا محضرات غير sonicated وsonicated الميتوكوندريا. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM. ** ف <0.01. تمثل البيانات ن = 3 إقران مكررات البيولوجية وأعرب بالنسبة إلى ملغ من البروتين. 
الشكل 2: عصاري خلوي والميتوكوندريا التعبير البروتين في الميتوكوندريا المعزولة والمحللة النسيج كله وimmunoblotted كل من الميتوكوندريا المعزولة ولست] النسيج كله مع COXIV والأجسام المضادة GAPDH. كان البروتين الميتوكوندريا، COXIV، اضح في كل العينات، ولكن كان GAPDH فقط اضح بصوت ضعيف في الميتوكوندريا المعزولة. عدم وجود الفرقة GAPDH بارزة في الالبريد الميتوكوندريا المعزول يدل على التلوث القليل من مصادر غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل.
الرقم 3: تتبع الممثل اقتران مقايسة مع الميتوكوندريا المعزولة من الماوس العضلات والهيكل العظمي 10 ملي البيروفات / 5 ملي مالات جانب الميتوكوندريا اقتفاء أثر التنفس فحص النحو الذي يحدده قياس متعددة جيدا من O 2 الاستهلاك. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD. كان الميتوكوندريا البروتين تحميل لكل بئر 2.5 ميكروغرام. OCR = O 2 معدل استهلاك. ADP = ثنائي فسفات الأدينوزين. بنسبة ضئيلة = أوليغوميسين A؛ FCCP = الكربونيل cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. مكافحة A = Antimycin A.
| كاشف | الأسهم تركيز | الحجم النهائي | واضاف كتلة | |
| (م) | (ز / مول) | (مل) | (ز) | |
| تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 | 2 | 157.56 | 250 | 78.8 |
| تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 | 1 | 157.56 | 250 | 39.39 |
| بوكل | 1 | 74.55 | 500 | 37.28 |
| تريس قاعدة | 1 | 121.14 | 100 | 12.11 |
| EDTA، ودرجة الحموضة 8 | 0.5 | 416.2 | 100 مل (في 1 M تريس قاعدة) | 20.81 |
| EGTA، ودرجة الحموضة 7.2 | 0.1 | 380.35 | 100 (في 1 M تريس قاعدة) | 3،801 |
الجدول 1: إعداد الحلول المالية.
| كاشف | الأسهم تركيز | واضاف كتلة | المولية النهائي / في المئة |
| (م) | (ز أو مل) | ||
| سكر القصب | - | 11.47 ز | 67 ملي |
| تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 | 2 | 12.5 مل | 50 ملي |
| بوكل | 1 | 25 مل | 50 ملي |
| EDTA / تريس قاعدة، ودرجة الحموضة 8 | 0.5 | 10 مل | 10 ملي |
| أساسا FA الحرة BSA | - | 1 ز | 0.20٪ |
| درجة الحموضة 7.4، 500 مل: قسامة 50 مل وتجميد | |||
الجدول 2: إعداد عزل عازلة للالميتوكوندريا 1 (IBM1).
| كاشف | الأسهم تركيز | واضاف كتلة | المولية النهائي / في المئة |
| (م) | (ز أو مل) | ||
| D-المانيتول | - | 10.9 ز | 200 ملي |
| سكر القصب | - | 7،188 ز | 70 ملي |
| EGTA / تريس قاعدة | 0.1 | 15 مل | 5 مم |
| تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 | 1 | 3 مل | 10 ملي |
| درجة الحموضة 7.4، 300 مل: قسامة 15 مل وتجميد | |||
الجدول 3: إعداد عزل عازلة للالميتوكوندريا 2 (IBM2).
| الركيزة المتوسطة | تركيز النهائي | RCR |
| البيروفات / مالات | 10 ملي / 5 ملي | 16.2 ± 4.6 |
| سوسينات / روتنون | 10 ملم / 2 ميكرومتر | 10.6 ± 3.8 |
| بالميتويل L-كارنيتين / مالات | 40 ميكرومتر / 1 ملم مالات | 6.7 ± 0.6 |
| الغلوتامات / مالات | 10 ملم / 10 ملم | 8.6 ± 0.4 |
الجدول 4: نسب تحكم الجهاز التنفسي للأضفنا الميتوكوندريا التنفس فحوصات نسب سيطرة الجهاز التنفسي على النحو الذي يحدده قياس أولا O 2 معدلات الاستهلاك مع صفيحة ميكروسكوبية المقايسات respirometric أساس، تليها تقسيم القصوى إلى جانب التنفس (ADP محفز الدولة 3) عن طريق التنفس بسبب تسرب بروتون (أوليغوميسين. A 4O الدولة الاستجابة). يتم التعبير عن القيم كما ليو± SE. كان الميتوكوندريا البروتين تحميل لكل بئر 2.5 ميكروغرام للالبيروفات / مالات وسوسينات / المقايسات روتينون، و 3.5 ميكروغرام من الميتوكوندريا البروتين لكل بئر لبالميتويل L-كارنيتين / مالات والغلوتامات / المقايسات مالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطرق الواردة في هذه الوثيقة تقدم وصفا مفصلا لإجراء العزلة الميتوكوندريا من كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي. هذا الإجراء العزلة هي قادرة على تسفر عن أداء عالية، الميتوكوندريا النقي (~ 450 ميكروغرام) كما يتضح من O 2 معدلات الاستهلاك، والقيم RCR، أقصى النشاط سينسيز سترات وتعبير البروتين من immunoblotting. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا المعزولة من هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لفحوصات respirometirc متعددة مع صفيحة ميكروسكوبية أساس O 2 تكنولوجيا الاستهلاك التي تسمح للإنتاجية عالية.
عزل الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي وغالبا ما يتطلب أساليب قاسية لتحرير الميتوكوندريا من الأنسجة المحيطة الضام والبروتينات الهيكلية 7،16. ونتيجة لذلك، أغشية الميتوكوندريا يمكن أن تصبح تعطلت، وبالتالي إضعاف النشاط (وبالتالي دقة) من الميتوكوندريا استهلاك O 2 خلال respirome احقاالمقايسات TRIC. من قبل بما في ذلك خطوة إضافية من الأنسجة تنميق استخدام شفرات الحلاقة بعد استئصال الأنسجة لبروتوكول سبق وصفها 7، وكانت سرعة الدوار انخفاض كبير للمحرك التجانس مدفوعة الممكنة (80 دورة في الدقيقة مقابل 1600 دورة في الدقيقة). هذه التجانس وإعادة تعليق تقنيات ألطف يؤدي إلى نسبة عالية من الميتوكوندريا مع الأغشية سليمة (92.5 ± 2.0٪)، وفقا لتقييم من النشاط سينسيز سيترات بعد إجراء العزل. نتائجنا تتفق مع Asmann وآخرون 17، الذين يبلغون بين 90-95٪ التحضيرات الميتوكوندريا سليمة التالية بمعزل عن الهيكل العظمي والعضلات الإنسان. ومن المهم أن نلاحظ أن قياس النشاط سينسيز سيترات هو أكثر ملاءمة لقياس السلامة الجسدية للأغشية الميتوكوندريا، وينبغي ألا تستخدم لتقييم سلامة وظيفية من الميتوكوندريا المعزولة. من ناحية أخرى، O 2 المقايسات الاستهلاك وتحديد RCR من هذه المقايسات ينبغي أن تستخدم لشركة طيران الشرق الأوسطتأكد من أن وظيفة الميتوكوندريا المعزولة 1. بالإضافة إلى ذلك، RCR يمكن أيضا أن تستخدم كمؤشر على الميتوكوندريا جانب. ولذلك، فإن OCR والدول الميتوكوندريا داخل مدى محدد من البيروفات / فحص مالات 8، والقيم RCR عالية تم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من المقايسات respirometric يشير إلى أن الميتوكوندريا المستمدة من هذا البروتوكول تقترن بإحكام وظيفية للغاية.
عزل الميتوكوندريا سليمة ونقية آثار هامة لفحوصات respirometic. تلوث بروتينات غير الميتوكوندريا في إعداد الميتوكوندريا النهائي يمكن أن يؤدي إلى تحميل كميات متفاوتة من البروتين الميتوكوندريا إلى كل بئر خلال قياسات O 2 الاستهلاك، وبالتالي يقلل من دقة أي مقارنة بين التجارب التي أجريت باستخدام تحضيرات مختلفة من الميتوكوندريا. وعلاوة على ذلك، وتلوث إعداد الميتوكوندريا مع العضيات تتنفس أخرى (على سبيل المثال، peroxisomes) كاليفورنيان مزيد من الانخفاض دقة القياسات O 2 الاستهلاك. وجود الميتوكوندريا البروتين الداخلي، COXIV، وعدم وجود الفرقة بارزة من عصاري خلوي (وربما النووي) بروتين، GAPDH، في منطقتنا معزولة إعداد الميتوكوندريا immunoblotting التالية يدل على التلوث القليل من مصادر غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل .
ومن المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من العزلة لإعداد الميتوكوندريا النقي مهمة فيما يتعلق المذكورة أعلاه، والحفاظ على سلامة الميتوكوندريا هي ذات أهمية قصوى في فحوصات التنفس. غشاء الميتوكوندريا الخارجي يمكن أن تتلف بسهولة أثناء إجراء العزل، مما أدى إلى هروب السيتوكروم ج في المخزن المؤقت العزلة، وبالتالي يصبح معدل الحد خلال O 2 الاستهلاك وATP التوليف 18. ولذلك، فإن سلامة الميتوكوندريا معزولة يمكن تقييمها كذلك عن طريق قياس cytochromالمفوضية الأوروبية تعبير البروتين في طاف من إعداد الميتوكوندريا (الخطوة 2.15، قبل إعادة تعليق) والميتوكوندريا معزولة مع الغرب النشاف. السيتوكروم ج لا ينبغي أن يكون حاضرا في إعداد طاف الميتوكوندريا إذا أغشية الميتوكوندريا سليمة وفقا للإجراءات العزل.
جميع الخطوات من هذا البروتوكول مهمة، ولكن هناك ثلاث خطوات حاسمة لهذا البروتوكول. أولا، تنميق من الهيكل العظمي والعضلات الحمراء مع ثلاث شفرات الحلاقة مختلفة (الخطوة 2.4) أمر بالغ الأهمية لأن هذه الخطوة تتيح سرعات الدوار أبطأ خلال خطوة التجانس (الخطوة 2.11). ثانيا، أداء العديد من الخطوات على الجليد أو في المخازن المبردة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الميتوكوندريا في حالة الراحة قبل صفيحة ميكروسكوبية المقايسات respirometric القائمة. وأخيرا، فإن إعادة تعليق لطيف من بيليه الميتوكوندريا في IBM2 أمر في غاية الأهمية. يحتفظ خلط لطيف سلامة الميتوكوندريا، وهو أمر حاسم بالنسبة التركيب الدقيقالمقايسات irometic.
بعض القيود المفروضة على هذه التقنية تستحق الذكر. أولا، المعدات اللازمة (على سبيل المثال، نابذة فائقة السرعة، بالمواتير الخالط، الخ) لتنفيذ الإجراء العزلة يمكن أن تكون مكلفة. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى أساليب مراقبة الجودة متعددة لضمان الميتوكوندريا نظيفة وسليمة. ومع ذلك، وبمجرد أن الباحث متمكنا في إجراء العزل، وأسفرت الميتوكوندريا الجودة العالية والتي يمكن استخدامها في العديد من القياسات بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: البقع الغربية، المقايسات الأنزيمية، RT-PCR، PCR، H 2 O 2 المقايسات ، وارتفاع الإنتاجية صفيحة ميكروسكوبية قياسات الجهاز التنفسي. ومن المهم أن نلاحظ أن هذا الإجراء العزلة وقد تم تحسين وتعديل لكميات صغيرة من الماوس العضلات والهيكل العظمي والحذر يجب اتخاذها عند محاولة تطبيق تقنيات العزل من نسيج معين من نفس النوع (وحتى لنفس الأنسجة من مختلف الأنواع ) إلى الأنسجة الأخرى / SPECIوفاق. لأفضل النتائج، والبحث في أدب سيكون أفضل خيار عند محاولة للعثور على أفضل طريقة لعزل المقصود الأنسجة / الأنواع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
