Abstract
Dysfunktionelle skeletmuskulaturen mitokondrier spille en rolle i ændret metabolisme observeret med aldring, fedme og type II diabetes. Mitokondriske respirometriske assays fra isolerede mitokondriske præparater gøre det muligt at vurdere mitokondriefunktionen, samt bestemmelse af mekanismen (r) for lægemidler og proteiner, som modulerer metabolisme. Aktuelle isoleringsprocedurer kræver ofte store mængder af væv til opnåelse af høje mitokondrier er nødvendige for respirometriske assays kvalitet. De metoder, der præsenteres heri beskriver, hvordan høj kvalitet oprenset mitokondrier (~ 450 ug) kan isoleres fra minimale mængder (~ 75-100 mg) af muse skeletmuskulatur til anvendelse i high throughput respiratoriske målinger. Vi konstateret, at vores isolation metode giver 92,5 ± 2,0% intakt mitokondrier ved måling citratsynthase aktivitet spektrofotometrisk. Desuden Western blot-analyse i isolerede mitokondrier resulterede i det svage ekspression af cytosoLIC protein, GAPDH og robust ekspression af mitokondrieprotein, COXIV. Fraværet af en fremtrædende GAPDH bånd i de isolerede mitokondrier er indikativ for lille forurening fra ikke-mitokondriske kilder i isolation procedure. Vigtigst, måling af O 2 forbrug sats med mikro-plade baseret teknologi og bestemme det respiratoriske kontrol ratio (RCR) for koblede respirometriske analyser viser stærkt koblede (RCR;> 6 for alle analyser) og funktionelle mitokondrier. Afslutningsvis, en markant reduktion motordrevet homogenisering hastigheden af en tidligere rapporteret fremgangsmåde tilsætning af et separat hakning trin og har givet isolationen af høj kvalitet og oprensede mitochondrier fra mindre mængder af muse skeletmuskulatur, der resulterer i stærkt koblede mitokondrier, der respirerer med høj funktion under mikrotiterplade-baseret respirometirc assays.
Protocol
Dyreforsøg blev udført under en godkendt protokol af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Virginia Polytechnic Institute og State University.
1. Opsætning (Tid: ~ 45 min)
- Optø frosne lagre af 0,25% trypsin, Isolation Buffer for mitokondrier (IBM) 1 og IBM2 i et 37 ° C vandbad.
- Skyl glasvarer og dissektionsinstrumenter i 70% ethanol efterfulgt af højvande renhed.
- Forbered 0,05% trypsin-opløsning fra 0,25% trypsin lager ved at fortynde 1 del trypsin i 4 dele IBM1.
- Bland protease og phosphataseinhibitor cocktail med cellelyse-buffer (1: 100-forhold) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør med skruelåg.
- Alikvote 5 ml (5 ml / mus) på 0,05% trypsin i et 15 ml plastrør.
- Indstil motordrevet vævshomogenisator til 80 RPM.
2. Isolering af Skeletal Muscle mitokondrier (Tid: ~ 90 min)
- Aflive en mus af CO 2
- Fjernelse af røde muskel fra quadriceps og gastrocnemius muskel, som omfatter soleus (~ 75-100 mg i alt) som beskrevet i de følgende trin:
- Skræl huden mod mus.
- Fjern fedtpuden over quadriceps nulpunktet. Skær quadriceps senen, der er knyttet til knæskallen med fine tippet saks.
Bemærk: quadriceps identificeres ved sin anatomiske position på den forreste del af den proximale lårben. - Langsomt røverkøb den aponeurosis mellem knoglen og quadriceps, og samtidig undgå den femorale arterie, at befri quadriceps fra knoglen. Skær senen med fine tippet sakse på oprindelsen punkt på lårbenet at befri quadriceps muskler og placer quadriceps muskel i kølet PBS.
- Fjern synligt fedtvæv over quadriceps med en saks. Flip quadriceps over, så at den del af den muskel, blev overliggende lårbenet står us. Åbn quadriceps musklen med pincet i en Fanning bevægelse. Fjern de to synlige røde muskel dele fra hver lap med fine tippet saks og sted i et bægerglas indeholdende 5 ml afkølet IBM1.
Bemærk: quadricepsmusklen vises som to lapper med en strimmel af røde muskler placeret nær den laterale kant af hver lap. - Skær huden overliggende akillessenen med fine tippet sakse og skræl huden mod mus. Skær den udsatte akillessenen og skræl musklen mod kroppen af musen.
- Skær senen på laterale og mediale condyler på femur med fine tippet saks for at befri gastrocnemius og placere gastrocnemius knyttet til dens sener i afkølet PBS.
- Flip gastrocnemius igen og skrælle soleus muskel og anbringes i bægerglasset, der indeholder 5 ml afkølet IBM1. Fan åbne gastrocnemius. Fjern de tre visuelle røde muskel dele (to laterale og en medial overfladiske røde strimler) med fine tippet sakss og overføre dem til bægerglas, der indeholder 5 ml afkølet IBM1.
- Fjern anden ~ 75-100 mg røde muskel fra det andet ben af mus (som beskrevet i trin 2.2) og anbringes i et 1,5 ml mikrocentrifugerør med protease og phosphataseinhibitoren cocktail og cellelyse-buffer (50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natriumdodecylsulfat, 0,5% natriumdeoxycholat 1% polyoxyethylen (9) nonylphenylether, forgrenede. Umiddelbart lynfryser denne anden prøve i flydende nitrogen til senere brug i Western blotting (se trin 6.1).
- Placere en forhånds-kølet, flad plastoverflade på is i en stor spand. Hæld en dråbe IBM1 på plastic overflade og bruge pincet til at placere alle de sektioneret røde muskel (trin 2.2.4 og 2.2.7) i IBM1 dråbe. Hakkekød muskelvæv i 2 min hjælp 3 enkelt kant barberblade ved at ændre barbermaskiner hver 40 sek.
- Overfør det hakkede væv til et nyt bæger med 5 ml frisk IBM1 ved at holde plastoverfladen i the bæger og skrabe musklen i bægeret med et barberblad. Tag denne løsning, og dræne det gennem en 100 um cellefilter placeret på en 50 ml konisk rør.
- Dup vævet med en delikat opgave visker og derefter overføre det til 5 ml af 0,05% trypsin løsning. Brug en pincet til at fjerne væv fra opgaven visker.
- Inkubér muskelvæv på is i 30 minutter i 0,05% trypsin-opløsning.
- Spin 15 ml koniske rør indeholdende trypsin / muskel blandingen ved 200 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Hæld trypsin supernatanten i en affaldsbeholder, og pellet resuspenderes med 3 ml iskold IBM1. Overfør væv til en 45 ml glashomogenisator rør. Skyl de 15 ml konisk rør med en anden 1,5 ml IBM1 indsamle alle resterende prøve og tilføje dette til glashomogenisator røret.
- Placer glashomogenisator røret i et bæger eller plastikbeholder fyldt halvt op med is, så glashomogenisator bevæger minimalt i bægeret.
- Overfør vævshomogenatet til en ny 15 ml konisk rør og skyl glashomogenisator rør med 6,5 ml IBM1. Hæld IBM1 i 15 ml koniske rør indeholdende vævshomogenat.
- Spin 15 ml konisk rør ved 700 g i 10 minutter ved 4 ° C. Hæld forsigtigt supernatanten i et glas med høj styrke centrifugerør og kassér pelleten.
- Spin supernatanten fra det ovennævnte trin ved 8.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Fjern IBM1 supernatanten og re-suspendere pellet ved langsomt at tilsætte 500 pi af IBM2. Skær enden af en pipettespids og forsigtigt homogeniseres pelleten i IBM2 med blanding og omrøring bevægelser. Tilføje yderligere 4,5 ml IBM2 til blandingen efter pellet fuldt suspenderet.
Bemærk: Undgå overdreven findeling mens bryde større pellet stykker som thans kan beskadige mitochondriemembraner. - Spin IBM2 / vævshomogenatet ved 8.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
Bemærk: Dette trin kan gentages i en ren høj styrke centrifugerør til mere nøjagtig kvantificering af protein isoleret mitokondrier i trin 4, idet tilbageværende BSA kan bidrage til den samlede proteinindhold. - Fjern supernatanten og forsigtigt, men fuldstændig re-suspendere pellet ved at tilføje trin på IBM2 to 25 pi med en pipettespids med punkt afskåret. Forsigtigt omrøres og blandes pelleten efter hver tilsætning af 25 pi IBM2. Placer denne mitokondrie bestand på is.
3. Homogenisering af Whole Tissue Lysate (Tid: ~ 45 min; kan gøres under trin 7)
- Fjern muskel fra der blev anbragt i flydende nitrogen fra trin 2,3 og inkuberes ved stuetemperatur, indtil fuldstændig optøet.
- Hakke vævet i ~ 30 sek på is med fine tippet saks.
- Tilføj to 100 gl skefulde af zircon dnium Oxide Perler til 1,5 ml mikrocentrifugerør med skruelåg fra trin 3.2, der indeholder det hakkede væv. Homogenisere vævet i en perlemølle vævshomogenisator ved hjælp af to til tre 5 min cykler ved en hastighedsindstilling på 4-6 (medium indstilling).
- Spin blandingen fra trin 3.3 ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten under anvendelse af en 1.000 pi pipettespids efter spin og overførsel i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Kassér pellet og placere supernatanten på is.
4. Protein Bestemmelse (Tid: ~ 30 min)
- Bestem proteinkoncentrationen af hele væv lysat (trin 3.4) og mitokondrie lager (trin 2.17) under anvendelse af BCA Protein Assay kit ifølge producentens specifikationer.
5. Mitokondrier membranintegritet; Citratsynthase (CS) Aktivitet (Tid: ~ 15 min)
- Lav to separate 1: 20 fortyndinger af mitokondrie lager i højvande renhed. Tilføje0,1% Triton-X 100 til en prøve og lydbehandling det til et lavt niveau (765 watt, amplitude på 2). Lad den anden fortynding på is. Prøven Retur til is efter lydbehandling.
- Udfør en citratsynthase assay med både ikke-sonikeret og sonikeret mitokondrielle fortyndinger under anvendelse af et spektrofotometrisk assay som tidligere beskrevet 11,12.
- Bestem procentdelen af intakte mitokondrier membraner ved hjælp af følgende ligninger:
(Ikke-ultralydbehandlet CS aktivitet ÷ sonicated CS aktivitet) * 100
100- N (procent opnået fra oven)
6. Mitokondrier Isolering Kvalitet; Western blotting (Tid: Ifølge Lab-protokollen)
- Udfør Western blotting på hele væv lysat og isoleret mitokondrier som tidligere beskrevet 12.
Bemærk: Brug primære antistoffer for GAPDH (1: 1000 fortynding i 5% BSA / TBS-T) og COXIV (1: 1000 fortynding i 5% fedtfrimælk / TBS-T) efterfulgt af anti-ged, kanin og sekundære antistoffer, henholdsvis (1: 10.000).
7. respirometrisk Assay Run (Tid: ~ 90 min)
- Udfør ønskede respirometriske assays under anvendelse af mikroplade baseret O 2 forbruget måleteknik som tidligere beskrevet (se ledsagende artikel og Rogers et al 8).
- Bestem den respiratoriske kontrol ratio (RCR) ved at dividere stat 3 ved State 4o (RCR) eller dividere stat 3U af State 4o. Brug enten den midterste (gennemsnit) punkt, eller den højeste (stat 3) og laveste satser (stat 4o) fra punkt-til-punkt-spor, når det bestemmes RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Citrat syntaseaktivitet fungerer som et mål for membran integritet, da citrat syntase er beliggende i den indre mitokondrielle membran, og derfor ikke bør være til stede i suspensioner af mitokondrier med intakte membraner. Figur 1 repræsenterer citrat syntaseaktivitet i ikke-ultralydbehandlet mitokondrie prøver sammenlignet med lydbehandledes prøver fra samme isolation. Sonikering mitokondrierne resulterer i en statistisk signifikant stigning i citratsynthase aktivitet (p <0,01). Det er vigtigt, 92,5 ± 2,0% af mitokondrier var intakte efter isolation.
Figur 2 viser GAPDH og COXIV ekspression i isolerede mitokondrier og hele skeletmuskelvæv lysat. GAPDH er et protein ligger i cytosolen, men kan også findes i kernen efter translokation, mens COXIV er et protein placeret i den indre mitochondriemembran. Udtryk for GAPDH og COXIV er tydelige i hele Tissue lysat. I isolerede mitokondrier, observeres ekspression af COXIV, mens kun svage bånd af GAPDH er indlysende. Disse resultater indikerer gode mitokondrielle isolationer, med ringe forurening fra ikke-mitokondrie komponenter under isolation proceduren.
Figur 3 er et repræsentativt sporing af O 2 forbrug satser (OCR) vs. tid for en kobling assay (10 mM pyruvat / 5 mM Malate) og udføres fra mitokondrier isolerede ved hjælp af denne protokol og udført med mikrotiterplade-baseret O 2 forbrug teknologi. Hvert panel repræsenterer O 2 forbrug i forskellige mitokondrie tilstande som beskrevet af Chance og Williams 13. Det første panel repræsenterer basal O 2 forbrug eller stat 2. Det andet panel, efter injektion af ADP, repræsenterer maksimal koblet respiration eller stat 3. Det tredje panel, efter injektion af oligomycin A (en hæmmer af Complex V), represeNTS respiration på grund af proton lækage eller stat 4o. Den fjerde panel, efter injektion af FCCP repræsenterer maksimal afkoblet åndedræt eller stat 3U. Endelig femte panel, efter injektion af antimycin, betegner inhibering af oxidative respiration. Den respiratoriske kontrol ratio (RCR), et mål for mitokondriefunktion 1, blev beregnet ved at dividere stat 3 ved State 4o. Tabel 4 rapporter de gennemsnitlige RCR-værdier for alternative substrat kobling analyser, der kan udføres fra mitokondrierne udbytte af denne protokol. Vigtigere er det, O 2 forbrug sporing og de høje RCR værdier repræsenterer yderst velfungerende og koblede mitokondrier. RCR-værdier er rapporteret heri, er højere eller lignende end tidligere rapporteret under anvendelse af lignende isolation protokoller i murine skeletmuskulatur 7,14,15, hvilket forstærker den høje kvalitet af mitokondrierne isolerede under denne procedure.
Figur 1: citratsynthase aktivitet. Citratsynthase enzymaktivitet som bestemt spektrofotometrisk i ikke-sonikerede og sonikerede mitochondrierne preps. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM. ** p <0,01. Data repræsenterer n = 3 parrede biologiske replikater og udtrykt i forhold til mg protein. 
Figur 2:. Cytosolisk og mitokondrie proteinekspression i isolerede mitokondrier og hele væv lysat Begge isolerede mitokondrier og hele væv lysater blev immunoblottet med COXIV og GAPDH antistoffer. Mitokondrie-protein, COXIV, var tydelig i begge prøver, men GAPDH var kun svagt tydeligt i de isolerede mitokondrier. Fraværet af en fremtrædende GAPDH band i the isolerede mitokondrier er tegn på lidt forurening fra ikke-mitokondrie kilder i løbet af isolation procedure.
Figur 3:. Repræsentant sporing af kobling assay med mitokondrier isoleret fra muse skeletmuskel 10 mM pyruvat / 5 mM malat koblet mitokondrielle respiration assay kurver som bestemt ved multi-brønds måling af O 2 forbrug. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Mitokondrieprotein indlæst per brønd var 2,5 ug. OCR = O 2 Forbrug Pris; ADP = adenosindiphosphat; Oligo = oligomycin A; FCCP = carbonyl cyanide- 4 - (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Anti-A = Antimycin A.
| Reagens | Stock Concentration | | Slutvolumen | Mass Tilføjet | |
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g) | |
| Tris / HCI, pH 7,4 | 2 | 157,56 | 250 | 78,8 |
| Tris / HCI, pH 7,4 | 1 | 157,56 | 250 | 39,39 |
| KCL | 1 | 74,55 | 500 | 37,28 |
| Tris Base | 1 | 121,14 | 100 | 12.11 |
| EDTA, pH 8 | 0,5 | 416,2 | 100 ml (i 1 M Tris-base) | 20.81 |
| EGTA, pH 7,2 | 0.1 | 380,35 | 100 (i 1 M Tris-base) | 3,801 |
Tabel 1: fremstilling af stamopløsninger.
| Reagens | Stock Concentration | Mass Tilføjet | Slutmolariteten / Procent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| Saccharose | - | 11,47 g | 67 mM |
| Tris / HCI, pH 7,4 | 2 | 12,5 ml | 50 mM |
| KCL | 1 | 25 ml | 50 mM |
| EDTA / Tris Base, pH 8 | 0,5 | 10 ml | 10 mM |
| Væsentlige FA BSA | - | 1 g | 0,20% |
| pH 7,4, 500 ml: Alikvot 50 ml og fryse | |||
Tabel 2: Fremstilling af Isolation Buffer for mitokondrier 1 (IBM1).
| Reagens | Stock Concentration | Mass Tilføjet | Slutmolariteten / Procent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| D-Mannitol | - | 10,9 g | 200 mM |
| Saccharose | - | 7,188 g | 70 mM |
| EGTA / Tris Base | 0.1 | 15 ml | 5 mM |
| Tris-HCI, pH 7,4 | 1 | 3 ml | 10 mM |
| pH 7,4, 300 ml: Alikvot 15 ml og fryse | |||
Tabel 3: Fremstilling af Isolation Buffer for mitokondrier 2 (IBM2).
| Substrat Medium | Slutkoncentration | RCR |
| Pyruvat / Malate | 10 mM / 5 mM | 16,2 ± 4,6 |
| Succinat / Rotenon | 10 mM / 2 uM | 10,6 ± 3,8 |
| Palmitoyl L-carnitin / Malate | 40 pM / 1 mM Malate | 6,7 ± 0,6 |
| Glutamat / Malate | 10 mM / 10 mM | 8,6 ± 0,4 |
Tabel 4: Respiratory Kontrol Nøgletal for Koblede Mitokondrie Respiration assays Respiratory kontrol nøgletal som bestemt ved først at måle O 2 forbrug satser med mikrotiterplade-baseret respirometriske analyser, efterfulgt ved at dividere maksimal koblet respiration (ADP Stimulated stat 3) ved respiration på grund af proton lækage (oligomycin. Et svar stat 4o). Værdier er udtrykt som migen ± SE. Mitokondrieprotein indlæst per brønd var 2,5 ug til pyruvat / malat og succinat / Rotenon assays, og 3,5 ug mitokondrieprotein per brønd for palmitoyl-L-carnitin / malat og glutamat / Malate assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der præsenteres heri give en detaljeret beskrivelse af et mitokondrie isolation proceduren fra minimale mængder (~ 75-100 mg) af mus skeletmuskulatur. Denne isolation procedure er i stand til at give høj funktion, ren mitochondrier (~ 450 mg) som det fremgår af O 2 forbrug priser, RCR værdier, maksimal citrat syntaseaktivitet og protein udtryk fra immunoblotting. Vigtigt er det, kan mitokondrierne isoleret fra denne fremgangsmåde bruges til flere respirometirc assays med mikrotiterplade-baseret O 2 forbrug teknologi, der giver mulighed for høj kapacitet.
Isoleringen af skeletmuskulaturen mitokondrier kræver ofte barske metoder til at befri mitokondrier fra omgivende bindevæv og strukturelle proteiner 7,16. Derfor kan mitochondriemembraner blive forstyrret og dermed skader de aktivitet (og dermed nøjagtighed) af mitokondrie O 2 forbrug i efterfølgende respiromeTRIC assays. Ved at inkludere et yderligere trin med væv hakning ved anvendelse af barberblade efter væv excision en tidligere beskrevet protokol 7, en betydeligt reduceret rotorhastighed for motordrevet homogenisering var muligt (80 rpm vs. 1.600 rpm). Disse blidere homogenisering og resuspension teknikker fører til en høj procentdel af mitokondrier med intakte membraner (92,5 ± 2,0%), vurderet fra citratsynthase aktivitet efter isolering procedure. Vores resultater er i overensstemmelse med Asmann et al. 17, der rapporterer mellem 90-95% intakte mitokondrie præparater efter isolering fra human skeletmuskulatur. Det er vigtigt at bemærke, at måle citratsynthase aktivitet er bedre egnet til at måle fysiske integritet mitochondriemembraner og bør ikke anvendes til at vurdere funktionel integritet af de isolerede mitokondrier. På den anden side bør O 2 forbrug assays og bestemmelse af RCR fra disse assays anvendes til at measikker funktion isolerede mitokondrier 1. Derudover kan RCR også anvendes som en indikator for koblede mitokondrier. Derfor OCR og mitokondrielle myndigheder inden for en typisk område fra pyruvat / malat assay 8, og de høje RCR-værdier opnås fra en række af respirometriske assays indikerer, at mitochondrier afledt af denne protokol tæt koblet og yderst funktionel.
Isolering af intakte og rene mitokondrier har vigtige implikationer for respirometic analyser. Forureningen af ikke-mitokondrielle proteiner i den endelige mitokondrie præparat kan resultere i lastning ulige mængder mitokondrie protein til hver brønd under målingerne O 2 forbrug, og dermed mindske nøjagtigheden af enhver sammenligning mellem forsøg udført ved anvendelse af forskellige præparater af mitokondrier. Endvidere forurening af mitokondrie midlet sammen med andre respirerende organeller (f.eks peroxisomer) CAn yderligere reducere nøjagtigheden af målingerne O 2 forbrug. Tilstedeværelsen af den indre mitokondrielle protein, COXIV, og fraværet af en fremtrædende bånd med den cytosoliske (og potentielt nuklear) protein, GAPDH, i vores isoleret mitokondrie præparat efter immunoblotting er indikativ for lille forurening fra ikke-mitokondriske kilder under isoleringsproceduren .
Det er vigtigt at bemærke, at selv om isolering af et oprenset mitokondrie forberedelse er vigtig med hensyn til ovennævnte, er opretholdelsen af mitokondrie integritet af yderste vigtighed i respiration assays. Den ydre mitokondriemembran kan nemt blive beskadiget under isolation procedure, der fører til frigørelse af cytochrom c til isolering buffer og dermed blive hastighedsbegrænsende under O 2 forbrug og ATP-syntese 18. Derfor kan integriteten af isolerede mitokondrier vurderes nærmere ved at kvantificere cytochromec proteinekspression i supernatanten af det mitokondrielle præparat (trin 2.15, før resuspension) og i isolerede mitokondrier med Western blotting. Cytochrom c bør ikke være til stede i den mitokondriske fremstilling supernatanten hvis mitochondriemembraner er intakte efter isoleringsprocedurer.
Alle trin i denne protokol er vigtige, men der er tre kritiske trin til denne protokol. Først til hakning af røde skeletmuskulatur med tre forskellige barberblade (trin 2.4) er kritisk, fordi dette trin giver mulighed for langsommere rotorhastigheder under homogenisering (trin 2.11). For det andet, udførelsen af mange skridt på is eller i kølede buffere er afgørende for at bevare mitokondrier i en hviletilstand før mikropladen baserede respirometriske analyser. Endelig er den blide resuspension af mitokondrier pillen ind IBM2 er af allerstørste betydning. Forsigtig blanding fastholder mitokondrie integritet, som er afgørende for nøjagtig hhvirometic assays.
Nogle begrænsninger af denne teknik er værd at nævne. Først det nødvendige udstyr (f.eks ultracentrifuge, motordrevet homogenisator, etc.) at udføre isolation procedure kan være dyrt. Desuden er der behov for flere kvalitetskontrol metoder til at sikre rene og intakte mitokondrier. Men når forskeren er dygtige i isolation procedure, er kvalitet mitokondrier høje viste, som kan anvendes i en lang række målinger, herunder, men ikke begrænset til: Western blots, enzymatiske assays, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 assays og high throughput mikroplade respiratoriske målinger. Det er vigtigt at bemærke, at denne isolation procedure er blevet optimeret og modificeret til små mængder af muse skeletmuskulatur og der skal udvises forsigtighed, når de forsøger at anvende isoleringsteknikker fra et givet væv fra den samme art (og endda til det samme væv fra forskellige arter ) til andre væv / species. For at opnå optimale resultater, vil litteraturen søger være den bedste løsning, når de forsøger at finde den bedste isolation metode til de tilsigtede væv / arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
