Abstract
Dysfunktionella skelettmuskel mitokondrier spela en roll i förändrad ämnesomsättning observerats med åldrandet, övervikt och diabetes typ II. Mitokondriella respirometric analyser från isolerade mitokondriella förberedelser gör det möjligt att bedöma mitokondriefunktion, samt fastställandet av den mekanism (er) av verkan av läkemedel och proteiner som modulerar ämnesomsättningen. Nuvarande isoleringsförfaranden kräver ofta stora mängder av vävnad för att ge hög kvalitet mitokondrier som är nödvändiga för respirometric analyser. De metoder som presenteras här beskriva hur hög kvalitet renade mitokondrier (~ 450 mikrogram) kan isoleras från minimala mängder (~ 75-100 mg) av mus skelettmuskulatur för användning i hög kapacitet andnings mätningar. Vi bestämde att vår isolering metod ger 92,5 ± 2,0% intakt mitokondrier genom att mäta citrat syntasaktivitet spektrofotometriskt. Dessutom Western blot-analys i isolerad mitokondrier resulterade i svag expression av cytosoLic protein, GAPDH och robust uttryck för den mitokondriella proteinet, COXIV. Avsaknaden av en framstående GAPDH band i isolerade mitokondrier tyder på liten förorening från icke-mitokondriella källor under isoleringsförfarandet. Viktigast, mätning av O 2 förbrukning med mikroplatta baserad teknik och bestämma andningskontrollförhållandet (RCR) för kopplade respirometric analyser visar starkt kopplade (RCR,> 6 för alla analyser) och funktionella mitokondrier. Sammanfattningsvis, tillsatsen av ett separat hacksteg och avsevärt minska motordriven homogenisering hastigheten på en tidigare rapporterad metod har tillåtit isolering av hög kvalitet och renade mitokondrier från mindre mängder av mus-skelettmuskel som resulterar i starkt kopplade mitokondrier som andas med hög funktion under mikro baserad respirometirc analyser.
Protocol
Djurstudier genomfördes under en godkänt protokoll av Institutional Animal Care och använda kommittén vid Virginia Polytechnic Institute och State University.
1. Setup (Tid: ~ 45 min)
- Tina frysta förråd av 0,25% trypsin, isoleringsbuffert för Mitokondrier (IBM) 1 och IBM2 i en 37 ° C vattenbad.
- Skölj glas och dissekera instrument i 70% etanol följt av vatten med hög renhet.
- Förbered 0,05% trypsin lösning från 0,25% trypsin lager genom att späda ut 1 del trypsin i 4 delar IBM1.
- Blanda proteas och fosfatasinhibitor cocktail med cell-lys-buffert (1: 100-förhållande) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med skruvlock.
- Alikvotera 5 ml (5 ml / mus) av 0,05% trypsin i en 15 ml plaströr.
- Ställ motordriven vävnadshomogenisator till 80 varv per minut.
2. Isolering av skelettmuskulatur Mitokondrierna (Tid: ~ 90 min)
- Euthanize en mus genom COa 2
- Ta bort röda muskel från quadriceps och gastrocnemiusmuskeln, som omfattar soleus (~ 75-100 mg totalt) som beskrivs i följande steg:
- Skal huden mot musen.
- Ta bort fettkudden över quadriceps origo. Skär quadriceps senan som är ansluten till knäskålen med fin spets sax.
Obs: quadriceps identifieras av sitt anatomiska position på den främre delen av proximala femur. - Sakta klippa den aponeurosis mellan benet och quadriceps, samtidigt som man undviker lårbensartären, att befria quadriceps från benet. Skär senan med fin spets sax vid ursprungspunkten på lårbenet för att befria quadricepsmuskeln och placera quadricepsmuskeln i kyld PBS.
- Ta bort synlig fettvävnad över quadriceps med sax. Vänd quadriceps över så att den del av muskeln som ligger över lårbenet är vänd usid. Öppna quadricepsmuskeln med pincett i en fläkt rörelse. Ta bort de två synliga röda muskelpartier från varje lob med fin spets sax och lägg i en bägare innehållande 5 ml kyld IBM1.
Obs: quadricepsmuskeln visas som två lober med en remsa av röd muskel som ligger nära sidokanten på varje lob. - Skär huden överliggande hälsenan med fina tippade sax och skala huden mot musen. Skär den exponerade hälsenan och skala muskeln mot kroppen av musen.
- Skär senan på laterala och mediala kondyler lårbenet med fin spets sax för att befria gastrocnemius och placera gastrocnemius fäst vid sina senor i kyld PBS.
- Vänd på gastrocnemius över och dra av soleusmuskeln och placera i bägaren innehållande 5 ml kyld IBM1. Fan öppna gastrocnemius. Ta bort de tre visuella röda muskelpartier (två laterala och en medial ytliga röda band) med fin spets saxs och överföra dem till bägaren innehållande 5 ml kyld IBM1.
- Ta en annan ~ 75-100 mg rött muskler från det andra benet av musen (som beskrivs i steg 2,2) och placera i en 1,5 ml mikrocentrifugrör med proteas och fosfatasinhibitor cocktail och cellysbuffert (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% natriumdodecylsulfat, 0,5% Natriumdeoxikolat, 1% Polyoxietylen (9) nonylphenylether, grenade. Omedelbart flash-frysa denna andra provet i flytande kväve för senare användning i Western-blotting (se steg 6,1).
- Placera en pre-kyld, platt plastyta på is i en stor hink. Häll en droppe IBM1 på plastytan och använda pincett för att placera alla de sektionerade röda muskeln (steg 2.2.4 och 2.2.7) i IBM1 droppen. Finhacka muskelvävnaden under 2 minuter med hjälp av 3 enkel kant rakblad genom att ändra rakhyvlar var 40 sek.
- Överför det malda vävnaden till en ny bägare med 5 ml färsk IBM1 genom att hålla plastytan över the bägare och skrapa muskeln i bägaren med ett rakblad. Ta denna lösning och tömma den genom en 100 ìm cell sil placeras på en 50 ml koniska rör.
- Blot vävnaden med en grannlaga uppgift torkare och sedan överföra den till 5 ml av trypsinlösning 0,05%. Använd pincett för att ta bort vävnad från uppgiften torkar.
- Inkubera muskelvävnaden på is under 30 minuter i 0,05% trypsinlösning.
- Snurra 15 ml koniskt rör innehållande trypsin / muskel blandningen vid 200 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Häll trypsin supernatanten i en avfallsbehållare och suspendera pelleten med 3 ml iskall IBM1. Överför vävnad till en 45 ml glashomogenisator rör. Skölj 15 ml koniska rör med ytterligare 1,5 ml IBM1 samla in all kvarvarande prov och lägga till glashomogenisator röret.
- Placera glashomogenisator röret i en bägare eller plastbehållare fylld till hälften med is så att glashomogenisator rör sig minimalt i bägaren.
- Överför vävnadshomogenatet till en ny 15 ml koniska rör och skölj glashomogenisator rör med 6,5 ml IBM1. Häll IBM1 i 15 ml koniska rör innehållande vävnadshomogenatet.
- Snurra 15 ml koniskt rör vid 700 g under 10 min vid 4 ° C. Häll försiktigt supernatanten i ett glas med hög hållfasthet centrifugrör och kasta pelleten.
- Spin supernatanten från ovanstående steg vid 8000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Avlägsna IBM1 supernatanten och återsuspendera pelleten genom att långsamt tillsätta 500 pl IBM2. Skär av änden av en pipettspets och försiktigt homogenisera pelleten i IBM2 med blandning och omröring rörelser. Lägg till ytterligare 4,5 ml IBM2 till blandningen efter pelleten helt upphängda.
Obs: Undvik rivning medan bryta större pelletsbitar som thans kan skada mitokondriemembranen. - Snurra IBM2 / vävnadshomogenat vid 8000 xg under 10 min vid 4 ° C.
Obs: Detta steg kan upprepas i en ren höghållfast centrifugrör för mer exakt protein kvantifiering av isolerade mitokondrier i steg 4, eftersom resterande BSA kan bidra till den totala proteinhalten. - Avlägsna supernatanten och försiktigt, men helt återsuspendera pelleten genom att addera två 25 pl steg om IBM2 med en pipettspets med spetsen avskuren. Försiktigt rör och blanda pelleten efter varje tillsats av 25 | il av IBM2. Placera mitokondriella lager på is.
3. Homogenisering av hela Tissue Lysate (Tid: ~ 45 min, kan göras under steg 7)
- Avlägsna muskeln från den som placerades i det flytande kvävet från steg 2,3 och inkubera vid rumstemperatur tills fullständigt tinade.
- Finhacka vävnad för ~ 30 sekunder på is med fin spets sax.
- Lägg till två 100 il skopor Zirconium Oxide Pärlor till 1,5 ml mikrocentrifugrör med skruvlock från steg 3.2 som innehåller malet vävnaden. Homogenisera vävnad i en pärlkvarn vävnadshomogenisator med användning av två till tre 5 min gånger i en hastighetsinställning av 4-6 (medelinställning).
- Spin blandningen från steg 3,3 vid 12 tusen xg under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten med hjälp av en 1000 mikroliter pipettspets efter utdelningen och överföring till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Kassera pelleten och placera supematanten på is.
4. proteinbestämning (Tid: ~ 30 min)
- Bestäm proteinkoncentrationen av hela vävnads lysatet (steg 3,4) och mitokondriell lager (steg 2,17) med användning av BCA-proteinanalyskitet enligt tillverkarens specifikationer.
5. Mitokondrier Membrane Integrity; Citrat-syntas (KS) Aktivitet (Tid: ~ 15 min)
- Gör två separata 1: 20 utspädningar av mitokondriell lager i hög renhet vatten. Tillägga0,1% av Triton 100-X till ett prov och sonikera den på en låg nivå (765 Watts, amplitud 2). Låt andra spädning på is. Återgå provet till is efter ultraljudsbehandling.
- Utför en citratsyntas analys med både icke-sonikerad och sonikerades mitokondriella utspädningar med hjälp av en spektrofotometrisk analys som tidigare beskrivits 11,12.
- Bestäm andelen intakta mitokondrier membran med hjälp av följande ekvationer:
(Icke-sonikerat CS aktivitet ÷ sonikerade CS aktivitet) * 100
100- N (procent nås från ovan)
6. Mitokondrier Isolering Kvalitet; Western blotting (Tid: Enligt Lab Protocol)
- Utför Western blotting på hela vävnaden lysat och isolerade mitokondrier som beskrivits tidigare 12.
Obs: Använd primära antikroppar för GAPDH (1: 1000 utspädning i 5% BSA / TBS-T) och COXIV (1: 1000 utspädning i 5% fettfrimjölk / TBS-T), följt av anti-get och kanin sekundära antikroppar, respektive (1: 10.000).
7. Respirometric analys Run (Tid: ~ 90 min)
- Utför önskade respirometric analyser med hjälp av mikrobaserad O 2 konsumtionen mätteknik som tidigare beskrivits (se artikeln följeslagare och Rogers et al 8).
- Bestäm andningskontrollförhållandet (RCR) genom att dividera staten 3 av statliga 4o (RCR) eller dividera staten 3u av statliga 4o. Använd antingen mitten (genomsnitt) punkt, eller den högsta (State 3) och låga priser (State 4o) från punkt-till-punkt-spår vid fastställandet RCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Citrat syntasaktivitet tjänar som ett mått på membranintegritet, eftersom citratsyntas ligger i det inre mitokondriemembranet, och bör därför inte förekomma i suspensioner av mitokondrier med oskadade hinnor. Figur 1 visar citrat syntasaktivitet i icke-sonikerad mitokondriella prover jämfört med sonikerades prover från samma isolering. Sonikering av mitokondrier resulterar i en statistiskt signifikant ökning i citrat syntasaktivitet (P <0,01). Viktigt var intakt 92,5 ± 2,0% av mitokondrier efter isoleringen.
Figur 2 visar GAPDH och COXIV uttryck i isolerade mitokondrier och hela skelettmuskelvävnaden lysat. GAPDH är ett protein som ligger i cytosolen, men kan också hittas i kärnan efter translokeringen, medan COXIV är ett protein som ligger i det inre mitokondriemembranet. Expression av GAPDH och COXIV är uppenbara i hela tissue lysatet. I den isolerade mitokondrier, är expression av COXIV observeras, medan endast svaga band av GAPDH är uppenbara. Dessa fynd tyder på bra mitokondriella isoleringar, med liten förorening från icke-mitokondriella komponenter under isoleringsförfarandet.
Figur 3 är en representativ spårning av O 2 förbrukning (OCR) kontra tid för en kopplingsanalys (10 mM pyruvat / 5 mM malat) utförs från mitokondrier isolerade med hjälp av detta protokoll och framförda med mikrobaserad O 2 konsumtionen teknik. Varje panel representerar O 2 konsumtionen i olika mitokondriella tillstånd såsom beskrivits av Chance och Williams 13. Den första panelen representerar basal O 2 konsumtion eller stat 2. Den andra panelen, efter injektion av ADP, representerar maximal kopplad andning, eller staten 3. Den tredje panelen, efter injektion av oligomycin A (en inhibitor av komplex V), represenätter andning på grund av protonläckage eller staten 4o. Den fjärde panelen, efter injektion av FCCP representerar maximal okopplad andning eller statliga 3u. Slutligen, den femte panelen, efter injektion av antimycin A, representerar hämning av oxidativ andning. Den andningskontroll kvoten (RCR), ett mått på mitokondriefunktion 1, beräknades genom att dividera staten 3 av statliga 4o. Tabell 4 rapporterar genomsnittliga RCR värden för alternativa substrat kopplingsanalyser som kan utföras från mitokondrierna avkastningen från detta protokoll. Viktigt är att O 2 konsumtionen spårning och höga RCR värdena representerar mycket fungerande och kopplade mitokondrier. RCR värden som rapporteras häri är högre eller lika än tidigare rapporterats med användning av liknande isoleringsprotokoll i murin skelettmuskel 7,14,15, vilket förstärker den höga kvaliteten på mitokondrierna isolerade under den här proceduren.
Figur 1: citratsyntas aktivitet. Citratsyntas enzymaktivitet som bestämts spektrofotometriskt i icke sonikerade och sonikerade mitokondrier preps. Värden uttrycks som medelvärde ± SEM. ** p <0,01. Data representerar n = 3 parade biologiska replikat och uttrycktes relativt till mg protein. 
Figur 2:. Cytosoliska och mitokondriell proteinuttryck i isolerade mitokondrier och hela vävnads lysat Både isolerade mitokondrier och hela vävnads lysat immunoblottades med COXIV och GAPDH antikroppar. Den mitokondriella proteinet, COXIV var tydligt i båda proven, men GAPDH var endast svagt tydligt i de isolerade mitokondrier. Avsaknaden av en framstående GAPDH band i the isolerade mitokondrier tyder på liten förorening från icke-mitokondriella källor under isoleringsförfarandet.
Figur 3:. Representant spårning av kopplingsanalys med mitokondrier isolerade från mus skelettmuskel 10 mM Pyruvate / 5 mM malat kopplad mitokondriella andningsanalys kurvor som bestäms av flerbrunns mätning av O 2 konsumtionen. Värden uttrycks som medelvärde ± SD. Mitochondrial protein laddades per brunn var 2,5 mikrogram. OCR = O 2 förbrukning; ADP = adenosindifosfat; Oligo = Oligomycin A; FCCP = Karbonyl cyanide- 4 - (trifluormetoxi) fenylhydrazon; Anti-A = antimycin A.
| Reagens | Lager Koncentration | | Slutlig volym | Mäss tillagd | |
| (M) | (g / mol) | (ml) | (g) | |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 157,56 | 250 | 78,8 |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 1 | 157,56 | 250 | 39,39 |
| KCL | 1 | 74,55 | 500 | 37,28 |
| Tris Base | 1 | 121,14 | 100 | 12,11 |
| EDTA, pH 8 | 0,5 | 416,2 | 100 ml (i 1 M Tris Base) | 20,81 |
| EGTA, pH 7,2 | 0,1 | 380,35 | 100 (i 1 M Tris Base) | 3,801 |
Tabell 1: Framställning av stamlösningar.
| Reagens | Lager Koncentration | Mäss tillagd | Slut Molaritet / Procent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| Sackaros | - | 11,47 g | 67 mM |
| Tris / HCl, pH 7,4 | 2 | 12,5 ml | 50 mM |
| KCL | 1 | 25 ml | 50 mM |
| EDTA / Tris Base, pH 8 | 0,5 | 10 ml | 10 mM |
| I huvudsak FA Gratis BSA | - | 1 g | 0,20% |
| pH 7,4, 500 ml: Alikvotera 50 ml och frys | |||
Tabell 2: Beredning av isolering buffert för Mitochondria 1 (IBM1).
| Reagens | Lager Koncentration | Mäss tillagd | Slut Molaritet / Procent |
| (M) | (g eller ml) | ||
| D-Mannitol | - | 10,9 g | 200 mM |
| Sackaros | - | 7,188 g | 70 mM |
| EGTA / Tris Base | 0,1 | 15 ml | 5 mM |
| Tris-HCl, pH 7,4 | 1 | 3 ml | 10 mM |
| pH 7,4, 300 ml: Alikvotera 15 ml och frys | |||
Tabell 3: Framställning av isoleringsbuffert för Mitochondria 2 (IBM2).
| Substrat Medium | Slutlig koncentration | RCR |
| Pyruvat / malat | 10 mM / 5 mM | 16,2 ± 4,6 |
| Succinat / Rotenon | 10 mm / 2 iM | 10,6 ± 3,8 |
| Palmitoyl L-karnitin / malat | 40 pM / 1 mM malat | 6,7 ± 0,6 |
| Glutamat / malat | 10 mM / 10 mM | 8,6 ± 0,4 |
Tabell 4: Andningskontroll Nyckeltal för Kopplade Mitochondrial Andnings ANALYSER Andningskontrollförhållanden som bestäms genom att först mäta O 2 konsumtionspriser med mikrobaserade respirometric analyser, följt genom att dividera maximal kopplad andning (ADP stimulerad State 3) genom andning på grund av protonläckage (Oligomycin. Ett svar statliga 4o). Värden uttrycks som migen ± SE. Mitochondrial protein laddades per brunn var 2,5 mikrogram för pyruvatet / malat och succinat / rotenon analyser och 3,5 mikrogram av mitokondrie protein per brunn för palmitoyl L-karnitin / malat och glutamat / malat analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som presenteras här ger en detaljerad beskrivning av en mitokondriell isoleringsförfarande från minimala mängder (~ 75-100 mg) av mus skelettmuskulaturen. Denna isoleringsförfarandet kan ge högfungerande, rena mitokondrier (~ 450 mikrogram) som framgår av O 2 konsumtionspriser, RCR värden, maximal citratsyntas aktivitet och proteinuttryck från immunoblotting. Viktigt kan mitokondrierna isolerade från detta förfarande användas för flera respirometirc analyser med mikrobaserad O 2 konsumtionen teknik som möjliggör hög genomströmning.
Isoleringen av skelettmuskel mitokondrier kräver ofta hårda metoder för att befria mitokondrierna från omgivande bindväv och strukturproteiner 7,16. Följaktligen kan mitokondriemembranen bli störd, vilket försämrar aktiviteten (och därmed noggrannhet) av mitokondriell O 2 konsumtionen under efterföljande respirometric analyser. Genom att inkludera ett ytterligare steg av vävnad mals med hjälp av rakblad efter vävnads excision en tidigare beskriven protokoll 7, en betydligt reducerad hastighet rotor för motordriven homogenisering var möjligt (80 rpm jämfört med 1600 rpm). Dessa mildare homogenisering och resuspension tekniker leder till en stor andel av mitokondrier med intakta membran (92,5 ± 2,0%), enligt bedömning från citratsyntas aktivitet efter isoleringsproceduren. Våra resultat överensstämmer med et al. Asmann 17, som rapporterar mellan 90-95% intakt mitokondriella preparat efter isolering från human skelettmuskel. Det är viktigt att notera att mäta citrat syntasaktivitet är bättre lämpad för att mäta fysiska integriteten för mitokondriemembranen och bör inte användas för att bedöma funktionell integritet av de isolerade mitokondrier. Å andra sidan bör O 2 konsumtions analyser och bestämning av RCR från dessa analyser användas för att meaSe till att funktionen hos isolerade mitokondrier 1. Dessutom kan RCR också användas som en indikator på kopplade mitokondrier. Därför, OCR och mitokondriella stater inom ett typiskt intervall från pyruvat / malat analys 8, och de höga RCR värden som erhållits från en mängd olika respirometric analyser tyder på att mitokondrierna härrör från detta protokoll är tätt kopplade och mycket funktionell.
Isolering av intakta och rena mitokondrier har stor betydelse för respirometic analyser. Föroreningen av icke-mitokondriella proteiner i den slutliga mitokondrie preparatet kan leda till lastning ojämlika mängder mitokondrie protein till varje brunn under O 2 förbrukningsmätning, vilket minskar noggrannheten hos någon jämförelse mellan experimenten utförs med hjälp av olika beredningar av mitokondrier. Dessutom, förorening av mitokondrie beredning med andra respirerande organeller (t.ex. peroxisomer) can ytterligare minska noggrannheten hos O 2 förbrukningsmätningar. Närvaron av det inre mitokondrieproteinet, COXIV, och frånvaron av ett framträdande band av cytosoliska (och potentiellt nukleärt) -protein, GAPDH, i vår isolerade mitokondrie behandling efter immunblotting indikerar liten kontaminering från icke-mitokondriella källor under isoleringsförfarandet .
Det är viktigt att notera att även om isoleringen av en renad mitokondriell preparat är viktigt med avseende på den ovan nämnda, är upprätthållandet av mitokondriell integriteten av yttersta vikt i respirations analyser. Det yttre mitokondriemembranet kan lätt skadas under isoleringsförfarandet, vilket leder till frisättning av cytokrom c i isoleringsbuffert och därmed bli hastighetsbegränsande under O 2 konsumtion och ATP-syntes 18. Därför kan integriteten hos isolerade mitokondrier bedömas ytterligare genom att kvantifiera cytokromec-proteinexpression i supernatanten från den mitokondriella preparatet (steg 2,15, före återsuspension) och i isolerade mitokondrier med Western blotting. Cytokrom c bör inte förekomma i den mitokondriella förberedelser vätskan om mitokondriemembranen är intakta efter isoleringsförfaranden.
Alla steg i detta protokoll är viktiga, men det finns tre viktiga steg i detta protokoll. För det första är malningen av röda skelettmuskel med tre olika rakblad (steg 2,4) kritisk, eftersom det här steget möjliggör långsammare rotorhastigheter under homogenisering (steg 2,11). För det andra, är resultatet av många steg på is eller i kylda buffertar viktigt att upprätthålla mitokondrierna i ett vilotillstånd före mikrobaserade respirometric analyser. Slutligen är den milda resuspension av mitokondrierna pelleten i IBM2 av yttersta vikt. Varsam blandning bibehåller mitochondrial integritet, vilket är avgörande för korrekt respirometic analyser.
Vissa begränsningar med denna teknik är värda att nämna. Först den utrustning som krävs (t.ex. ultracentrifug, motordriven homogeniseringsanordning, etc.) för att utföra isoleringsförfarandet kan vara dyra. Dessutom är flera metoder för kvalitetskontroll för att säkerställa ren och intakta mitokondrier. Men när forskaren är skicklig i isoleringsförfarandet, är av hög kvalitet mitokondrier gav som kan användas i en mängd olika mätningar inkluderande, men inte begränsat till: Western blöts, enzymatiska analyser, RT-PCR, PCR, H 2 O 2-analyser och hög genomströmning mikroandnings mätningar. Det är viktigt att notera att detta isoleringsförfarande har optimerats och ändras för små kvantiteter av mus skelettmuskel och försiktighet bör iakttas när man försöker tillämpa isoleringstekniker från en given vävnad från samma art (och även till samma vävnad från olika arter ) till andra vävnader / species. För bästa resultat, kommer att söka litteraturen vara det bästa alternativet när du försöker hitta den bästa isoleringsmetod för den avsedda vävnads / arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
| Acid Free- BSA | |||
| Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
| KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
| Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
| Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
| Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
| Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
| Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
| Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
| Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
| GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
| Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
| Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
| Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
| Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20 °C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8 °C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20 °C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
References
- Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
- Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
- Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746 (2011).
- Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
- Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
- Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
- Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
- Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
