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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

माइक्रोबियल समुदायों का अध्ययन Published: January 13, 2016 doi: 10.3791/53218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Recherche translationnelle: relations hôtepathogènes, Université Lille

Abstract

मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के दौरान pathogenicity की अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए हमें सक्षम बनाता है। मेजबान के रोग का निदान रोगज़नक़ 1 के खिलाफ एक अनुकूलित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की भागीदारी पर निर्भर करता है। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोगज़नक़ों और कई प्रतिरक्षा या गैर प्रतिरक्षा सेलुलर प्रकार 2 की बातचीत से जटिल और परिणाम है। इन विट्रो अध्ययन में इन मुलाकातों विशेषताएँ और सेल रोगज़नक़ बातचीत पर ध्यान केंद्रित नहीं कर सकते हैं। इसके अलावा, विशेष रूप से पकने वाला पुरानी फेफड़ों की बीमारी के साथ या यंत्रवत् हवादार रोगियों में रोगियों में एयरवे 3, में, polymicrobial समुदायों मौजूद हैं और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत को मुश्किल। Pseudomonas aeruginosa और कैंडिडा सफेद दोनों समस्या अक्सर tracheobronchial नमूने से अलग, 4 रोगजनक हैं, और विशेष रूप से गहन चिकित्सा इकाई में 5, गंभीर संक्रमण से जुड़े हुए। माइक्रोबियल बातचीत की हैइन विट्रो में इन रोगज़नक़ों के बीच सूचना दी लेकिन इन मुलाकातों के नैदानिक ​​प्रभाव 6 अस्पष्ट बनी किया। सी। सफेद और पी के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए aeruginosa, सी का एक murine मॉडल एक पी के द्वारा पीछा सफेद एयरवेज उपनिवेशन, aeruginosa- मध्यस्थता तीव्र फेफड़े में संक्रमण प्रदर्शन किया गया था।

Introduction

पशु मॉडल, विशेष रूप से चूहों, बड़े पैमाने पर रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सहज और अधिग्रहण उन्मुक्ति rodents और मनुष्य के बीच 7 अलग है, प्रजनन में आसानी और कई जीनों के लिए नॉकआउट के विकास, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 8 अध्ययन करने के लिए चूहों एक शानदार मॉडल बनाते हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जटिल है और एक रोगज़नक़ की बातचीत से परिणाम, निवासी सूक्ष्म वनस्पति और कई प्रतिरक्षा (लिम्फोसाइटों, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज) और गैर-प्रतिरक्षा (उपकला कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं) सेलुलर प्रकार 2। इन विट्रो अध्ययन के अवलोकन की अनुमति नहीं है इन जटिल बातचीत और मुख्य रूप से अद्वितीय सेल रोगज़नक़ बातचीत पर ध्यान केंद्रित। पशु मॉडल सावधानी के साथ प्रयोग किया है और बहुत ही विशिष्ट और प्रासंगिक सवाल तक सीमित किया जाना चाहिए, वहीं माउस मॉडल विवो में स्तनपायी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक अच्छी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और महत्वपूर्ण नैदानिक ​​सवाल 7 के कुछ हिस्सों को संबोधित कर सकते हैं।

6 की एक बड़ी संख्या जोड़ जटिल है। क्या एक "सामान्य" एयरवे Microbiome गठन निर्धारित किया जाना बना रहता है, वहीं निवासी समुदायों अक्सर polymicrobial हैं, और विविध पारिस्थितिक स्रोतों से उत्पन्न। पकने वाला पुरानी फेफड़ों के रोग (सिस्टिक फाइब्रोसिस, bronchectasis) के साथ रोगियों या यंत्रवत् हवादार रोगियों पर्यावरण की दृष्टि से हासिल कर लिया सूक्ष्मजीवों 9 से कारण एयरवेज के उपनिवेशवाद के लिए एक विशेष वनस्पति दिखा रहे हैं। Pseudomonas aeruginosa और कैंडिडा सफेद दोनों समस्या अक्सर tracheobronchial नमूनों से एक साथ अलग-थलग, 5 रोगजनक हैं , और विशेष रूप से गहन चिकित्सा कक्ष (आईसीयू) 4 में, इन रोगियों में गंभीर अवसरवादी संक्रमण का जिम्मेदार।

पी के खिलाफ एंटी-माइक्रोबियल उपचार में आईसीयू परिणामों में तीव्र निमोनिया के दौरान इन सूक्ष्मजीवों का अलगाव aeruginosa खकेन्द्र शासित प्रदेशों के खमीर आमतौर पर इस साइट 5 पर रोगजनक नहीं माना जाता है। पी के बीच इन विट्रो बातचीत aeruginosa और सी सफेद व्यापक रूप से बताया और इन सूक्ष्मजीवों के विकास और एक दूसरे के अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं, लेकिन अध्ययन के निष्कर्ष नहीं कर सकता है कि दिखाया गया है कि अगर सी की उपस्थिति सफेद मेजबान 10 के लिए हानिकारक या फायदेमंद है। माउस मॉडल पी के इस प्रासंगिकता को संबोधित करने के लिए विकसित किए गए aeruginosa और सी विवो में सफेद, लेकिन सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के प्रमुख मुद्दा नहीं था। दरअसल, मॉडल सी की भागीदारी का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया था मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, और परिणाम में सफेद।

रॉक्स एट अल द्वारा स्थापित पिछले मॉडल पहले से ही सी के साथ एक प्रारंभिक उपनिवेशन इस्तेमाल किया सफेद पी से प्रेरित एक गंभीर फेफड़ों के संक्रमण से पीछा aeruginosa। उनकी मॉडल का उपयोग करना, लेखकों पी के एक हानिकारक भूमिका पायाrior सी सफेद 11 बसाना। हालांकि रॉक्स एट अल सी के एक उच्च लोड का इस्तेमाल किया लगातार 3 दिनों के दौरान 2 एक्स 10 6 CFU / माउस के साथ अपने मॉडल में सफेद। हम सी के एक 4 दिन मॉडल की स्थापना सफेद एयरवे उपनिवेशन, या इस मॉडल सी में फेफड़ों की चोट के बिना कम से कम हठ, पर सफेद माउस (चित्रा 2 बी) 12,13 प्रति 10 5 CFU की एक भी टपकाना के बाद 4 दिनों के लिए लिया गया था। 4 दिनों के बाद, भड़काऊ सेल भर्ती, भड़काऊ साइटोकाइन उत्पादन और न ही उपकला क्षति के कोई सबूत नहीं मनाया गया। सी के शिखर उपस्थिति में 48 घंटा, - 24 पर सफेद, एक सेलुलर और साइटोकाइन सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मनाया गया, भले ही फेफड़ों की चोट के कोई सबूत नहीं था। हैरानी की बात है, चूहों इस प्रकार सी के साथ उपनिवेश पी के टपकाना Intranasal को सफेद 48 घंटा से पहले aeruginosa पी के साथ चूहों की तुलना में संक्रमण तनु था अकेले aeruginosa संक्रमण। मैंndeed, चूहों कम फेफड़ों की चोट का प्रदर्शन किया और बैक्टीरियल बोझ 12,13 कमी आई है।

कई परिकल्पनाएं सी के साथ पूर्व उपनिवेश की स्थापना के इस लाभकारी प्रभाव की व्याख्या कर सकता पी पर सफेद aeruginosa तीव्र फेफड़े में संक्रमण मध्यस्थता। सबसे पहले, प्रत्येक सूक्ष्मजीवों कोरम संवेदन प्रणाली, homoserinelactone आधारित पी से जुड़े एक interspecies पार बात aeruginosa प्रणाली और farnesol आधारित सी सफेद प्रणाली, का मूल्यांकन किया गया। दूसरा, सी फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं से रोगज़नक़ मनोविनोद पी aeruginosa के लिए एक "प्रलोभन" लक्ष्य के रूप में अभिनय सफेद अध्ययन किया गया था। दोनों परिकल्पनाओं (अप्रकाशित डेटा) अवैध थे। तीसरे परिकल्पना सी द्वारा सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के एक "भड़काना" की थी कि पी के खिलाफ एक बढ़ाया बाद में सहज प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार सफेद aeruginosa। यह पिछले परिकल्पना की पुष्टि की थी। दरअसल सी सफेद उपनिवेशन सहज उन्मुक्ति के एक भड़काना throu करने के लिए नेतृत्वजीएच आईएल 22, मुख्य रूप से वृद्धि हुई बैक्टीरियल निकासी में जिसके परिणामस्वरूप, जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं द्वारा स्रावित और फेफड़ों की चोट से 12 कम कर दिया।

अंत में, मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियमन और विभिन्न भड़काऊ प्रकार की कोशिकाओं को शामिल सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत में एक केंद्रीय अभिनेता है। इन जटिल प्रतिरक्षा बातचीत विट्रो में विच्छेदित किया जा सकता है, जबकि प्रारंभिक परिकल्पनाओं केवल विवो मॉडल में उचित द्वारा प्रदान किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल दूसरों सूक्ष्मजीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि मेजबान की मध्यस्थता रोगज़नक़ बातचीत के vivo अध्ययन का एक उदाहरण है।

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Protocol

पशु प्रयोगों के लिए क्षेत्रीय नैतिकता क्षेत्रीय समिति अनुसंधानात्मक अनुसंधान के दिशा-निर्देशों में राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय जानवरों की देखभाल और उपयोग के अनुसार, इस विधि को मंजूरी दी है।

1. नमूना संग्रह

  1. नमूना भंडारण
    1. गिरावट से बचने के लिए फ्रीजर भंडारण तक 20 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर - पर स्टोर तुरंत सभी नमूनों को इकट्ठा और। घोड़ा-वायुकोशीय lavages (बाल) के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए बर्फ पर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) रखें।
  2. शल्य-चिकित्सा
    1. एक आटोक्लेव का उपयोग कर सभी सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित।
      नोट: यदि संभव हो तो, यह पार संक्रमण से बचने के पेट और वक्ष कदम के लिए उपकरणों की दो अलग अलग सेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। आवश्यक विच्छेदन उपकरण चित्रा -4 ए में विस्तृत है

2. चूहे, बैक्टीरियल और खमीर उपभेदों

  1. पुनः में पशुओं के स्थानीय उपयोग के साथ अनुपालन में सदन चूहोंकारण जैव सुरक्षा स्तर 2 सूक्ष्म जीवों के उपयोग के लिए एक जैव सुरक्षा स्तर 2 आवास सुविधा में, भोजन और पानी विज्ञापन उदारीकरण के साथ पिंजरे प्रति 5 चूहों से अधिक के बिना एक हवादार रैक में सर्च कमेटी के दिशा निर्देशों: पी aeruginosa और सी सफेद।
  2. 40% ग्लिसरॉल माध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु उपभेदों रखें।
    1. एक 10 μl टीका पाश का उपयोग कर बाँझ Luria-Bertani शोरबा के 3 मिलीग्राम से युक्त संस्कृति ट्यूब में जमे हुए शेयर से सीधे बैक्टीरिया जोड़ें। कक्षीय मिलाते (400 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस टपकाना से पहले दिन में हे / एन छोड़ दें।
    2. Centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरिया 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर।
    3. एक उचित बंद Biohazard अपशिष्ट निपटान में सतह पर तैरनेवाला Aspirate। संस्कृति ट्यूब के नीचे सफेद पक्षपाती गोली का निरीक्षण करें।
    4. धो और पीबीएस के 5 मिलीलीटर का उपयोग कर गोली निलंबित।
    5. दोहराएँ एक दूसरे धोने प्रदर्शन करने के लिए एक दूसरी बार 2.2.3 के लिए 2.2.2 कदम।
    6. पीबीएस के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर pelleted बैक्टीरिया Resuspendऔर संक्षिप्त vortexing।
    7. एक ऑप्टिकल घनत्व मीटर का उपयोग कर 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग कर inoculum घनत्व का निर्धारण करें। 0.9 की एक घनत्व PAO1 के लिए 10 9 सीएफयू / एमएल से मेल खाती है, उसके अनुसार पतला।
      नोट: यह परिणाम नपे-तुले inoculum के लगातार dilutions की घनत्व के निर्धारण से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया तनाव के लिए प्राप्त हो गया है।
    8. सीरियल लघुगणक dilutions से inoculum सत्यापित करें और bromocresol बैंगनी अगर (बीसीपी) प्लेटें और हे / एन संस्कृति पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl थाली। प्रत्येक माउस के प्रति मिलीलीटर 1 एक्स 10 8 8 X10 से 2 CFU (माउस प्रति 5 एक्स 10 6 7 X10 करने के लिए 1 सीएफयू) युक्त समाधान के intranasally 50 μl प्रशासन।
  3. उपयोग सी एक संदर्भ तनाव के रूप में सफेद SC5314। -80 डिग्री सेल्सियस पर 40% ग्लिसरॉल माध्यम में तनाव संरक्षण।
    1. बैक्टीरियल संक्रमण से बचने के लिए और आगे की गिनती की सुविधा के लिए 0.015% एमिकासिन के साथ खमीर-Peptone-Dextrose शोरबा अनुपूरक।
    2. और 10 का उपयोग खमीर जोड़ें# 181; 37 डिग्री सेल्सियस पर एमिकासिन हे / एन के साथ पूरक तैयार YPD-शोरबा में एल टीका पाश।
    3. 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट खमीर।
    4. एक उचित bioharzard अपशिष्ट निपटान में सतह पर तैरनेवाला निकालें। व्हाइट पक्षपाती गोली संस्कृति ट्यूब के तल में मनाया जाना चाहिए।
    5. धो पीबीएस और संक्षिप्त vortexing के 5 मिलीलीटर का उपयोग कर pelleted बैक्टीरिया को निरस्त करने और।
    6. दोहराएँ एक दूसरे धोने प्रदर्शन करने के लिए एक दूसरी बार 2.2.3 के लिए 2.2.2 कदम।
    7. पीबीएस और संक्षिप्त vortexing के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर गोली Resuspend।
    8. 40x बढ़ाई पर एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक Mallassez hematocytometer पर भरोसा द्वारा inoculum के आकार का निर्धारण करते हैं।
      नोट: (खमीर की संख्या 10 x 5) / (Mallassez hematocytometer पर गिना ग्रिड आयतों की संख्या): एकाग्रता (सीएफयू / एमएल) में निम्न सूत्र का उपयोग कर प्राप्त की है।
    9. कि समाधान होता है इस बात की पुष्टि करने के लिए 10 -5 और 10 -6 के लिए धारावाहिक लघुगणक कमजोर पड़ने से सत्यापित करें 2 एक्स 10 6 सीएफयू / एमएल।
    10. YPD अगर प्लेटों पर प्लेट 0.015% एमिकासिन के साथ पूरक।

सी द्वारा 3. एयरवेज औपनिवेशीकरण सफेद

नोट: पर्यावरण अनुकूलन के बाद, चूहों एक दिन में दो बार तौल रहे हैं।

  1. एक धूआं हुड के तहत, एक 4 सेमी x 4 सेमी धुंध (खुले-ड्रॉप तकनीक) 14 पर Sevoflurane की जमा 500 μl।
    1. इसके तत्काल बाद एक लगभग 750 मिलीलीटर की प्रेरण कक्ष के फर्श पर धुंध जगह है। इसके तत्काल बाद पशु और धुंध के बीच सीधे संपर्क से बचने के लिए धुंध के ऊपर एक जाल उठाया मंच जगह है।
    2. वायुरोधी ढक्कन बंद करें और चैम्बर में Sevoflurane के प्रसार की अनुमति के लिए 1 मिनट 2 के लिए इंतजार।
    3. मंच और करीब ढक्कन जाल को पिंजरे से माउस स्थानांतरण। संरक्षित सहज श्वास के साथ लाइट संज्ञाहरण 30 से 45 सेकंड में हासिल किया जाना चाहिए।
    4. माउस च हटाया जा सकता है पर जो बात ठीक पलटा के नुकसान को देख कर hypotonia के लिए मॉनिटरबॉक्स और डाले रोम।
  2. Intranasal टपकाना (एक प्रशिक्षित ऑपरेटर द्वारा 10 सेकंड में किया जा सकता है)।
    1. ईमानदार आयोजित अपनी पीठ (चित्रा 4 बी) पर बसे एक हाथ माउस पकड़।
    2. तर्जनी का उपयोग करना, सिर का समर्थन और जबड़े रखने के लिए अंगूठे का उपयोग कफ (चित्रा 4C) से बचने के लिए बंद कर दिया गया।
    3. कदम 2.3.8 में वर्णित है, तैयार सी कि यह सुनिश्चित करें सफेद समाधान मात्रा डाले एक 50 μl के लिए मिलीलीटर प्रति 2 X10 6 CFU शामिल हैं।
      नोट: दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु डाले मात्रा है। कम से कम 50 μl एक अपर्याप्त बसाना या एयरवे की inhomogeneous टपकाना में परिणाम सकता है एक मात्रा, एक बड़ी मात्रा में डूबने / घुटन और मौत उत्पन्न हो सकता है।
    4. नाक के लिए पिपेट निकट से इंट्रा-नाक से माउस मुटाटकर।
    5. नाक पर समाधान युक्त एक बुलबुला गठन एक 50 μl ड्रॉप पिपेट, बाद में spontaneousl द्वारा साँसY सांस लेने के लिए माउस।
    6. एक वसूली क्षेत्र में जगह माउस (जैसे, एक भूमि के ऊपर हीटिंग दीपक के साथ एक बड़ी अच्छी तरह से वातित नंगे पिंजरे)। चूहे पूरा जागरण जब तक निगरानी की जानी चाहिए। यह स्टर्नल लेटना और ठीक पलटा बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर को मत छोड़ो। इस बिंदु पर, माउस एक सामान्य आवास पिंजरे में लौट जा सकता है।

4. पी aeruginosa प्रेरित तीव्र फेफड़े में संक्रमण

नोट: चूहे चार के बाद के दिनों के दौरान तौल रहे हैं। आम तौर पर, चूहों सी के दौरान वजन सफेद मध्यस्थता एयरवे उपनिवेशन (2A चित्रा)।

  1. पी युक्त निलंबन की तैयारी aeruginosa हे / एन वृद्धि (खंड 2.2) के बाद टपकाना के दिन।
  2. (धारा 3.1) ऊपर वर्णित के रूप में संक्षेप में anesthetize Sevoflurane साँस का उपयोग कर।
    नोट: गंभीर फेफड़ों के संक्रमण को करने में सुझाव दिया है बैक्टीरियल बोझ सिफारिशतालिका 1।
  3. पोस्ट-टपकाना वसूली करने के लिए विशेष ध्यान के साथ (खंड 3.2) ऊपर वर्णित के रूप में माउस मुटाटकर।

फेफड़ों की चोट सूचकांक 5. उपाय

  1. FITC लेबल एल्बुमिन युक्त समाधान तैयार करें। पशु इच्छामृत्यु से पहले इस समाधान 2 घंटा इंजेक्षन।
    1. उपयुक्त उपकरणों के साथ एल्बुमिन-FITC के 0.2 मिलीग्राम वजन।
    2. 1 मिलीलीटर पीबीएस में 0.2 मिलीग्राम जोड़ें। संक्षेप में भंवर। तुरंत इस्तेमाल यदि नहीं, परिवेश प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए पन्नी में समाधान रखें।
    3. प्रत्येक माउस के लिए FITC लेबल एल्बुमिन समाधान का इंट्रा-peritoneally 200 μl इंजेक्षन।
  2. इच्छामृत्यु
    1. पिछले वजन डेटा के लिए चूहों का वजन।
    2. 5.47% pentobarbital के 300 μl: pentobarbital की एक घातक अधिक मात्रा में से एक अंतर peritoneal इंजेक्शन का उपयोग कर अनुसंधान समिति के दिशा-निर्देशों में पशुओं के स्थानीय उपयोग के अनुसार एक माउस euthanize।
    3. पिंजरे से माउस निकालें और एल प्राप्त करता हैऑपरेटर द्वारा ethal इंजेक्शन।
    4. इंजेक्शन के बाद, किसी भी अन्य जानवरों से छिपा एक और पिंजरे, करने के लिए अकेले माउस हस्तांतरण। आंदोलन के अभाव जब तक माउस का निरीक्षण करें। इस बात की पुष्टि मौत आंदोलन, विशेष रूप से श्वसन आंदोलन, नाड़ी की कमी के अभाव से है।
    5. इसलिए निश्चेतक और न ही दर्दनाशक दवाओं के बिना, मरे हुए जानवरों पर नमूनों की शल्य संग्रह का प्रदर्शन।
  3. सर्जिकल नमूना संग्रह: छाती रोगों चरण।
    नोट: बाँझ की स्थिति बनाए रखने के लिए, सभी सर्जरी एक जैव सुरक्षा स्तर 2 माहौल में बाँझ उपकरणों का उपयोग किया जाता है।
    1. त्वचा के लिए इथेनॉल लागू करें। कैंची के साथ मध्य पेट के लिए उरोस्थि से एक midline त्वचा चीरा प्रदर्शन। दोनों तरफ ribcage साथ midline काटकर अलग कर देना है। रिब पिंजरे कल्पना करने के लिए छाती के दोनों तरफ त्वचा वापस मोड़ो।
    2. आदेश में clavicles की ओर जा रहे दोनों तरफ ribcage के एक ऊर्ध्वाधर चीरा प्रदर्शन स्टर्न के साथ पूरे पूर्वकाल छाती दीवार झुकना करने के लिए सक्षम होने के लिएउम दिल और फेफड़ों (चित्रा 5 ए, 5 ब) का सही दृश्य की अनुमति।
    3. Interventricular धमनी के बगल में दिल puncturing द्वारा एक पूर्व heparined सिरिंज का उपयोग कर खून ले लीजिए। प्लाज्मा के कम से कम 100 μl प्राप्त करने के लिए 500 μl की एक न्यूनतम वापस ले लें। बर्फ पर खून का नमूना रखें।
    4. श्वासनली (चित्रा 5 ब और 5C) कल्पना करने के लिए एक midline ग्रीवा चीरा प्रदर्शन। ध्यान से श्वासनली के आसपास प्रावरणी काटना। श्वासनली (चित्रा 5C और 5 डी) के पीछे एक सिवनी रखें। इसके बाद सिवनी समुचित पानी से धोना सुनिश्चित करने के लिए cannulating सुई के आसपास बंद कर दिया जाएगा।
    5. 20-जी संशोधित gavage सुई (चित्रा 5 डी और 4 ए) का उपयोग श्वासनली कैथीटेराइज़। पहले से रखा सीवन के साथ cannulated श्वासनली के चारों ओर एक शल्य गाँठ बाँध।
    6. ब्रोन्कोएल्वियोलर lavages (बाल) करने के लिए, धीरे और उत्तरोत्तर इंजेक्षन और फेफड़ों से / में ठंडा पीबीएस के 500 μl आकर्षित। मैं पर नमूना प्लेससीई सेलुलर सेल से बचने के लिए।
    7. दोहराएँ कदम 5.3.6, 3 बार एक 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (चित्रा 5E) में 1,500 μl बाल द्रव और पूल पानी से धोना नमूनों की कुल प्राप्त करने के लिए।
    8. सीने से फेफड़ों निकालें। 80 डिग्री सेल्सियस - 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में (आकार एक फेफड़े या एक पालि के आधे के अनुरूप होना चाहिए) और कम से तेजी से स्टोर एक फेफड़ों खंड रखें।
    9. बैक्टीरियल बोझ का निर्धारण और बर्फ पर जगह के लिए पीबीएस युक्त एक पूर्व तौला रक्तापघटन ट्यूब में एक फेफड़ों खंड रखें।
  4. सर्जिकल नमूना संग्रह: पेट की अवस्था।
    1. पेट के बाएं तरफ एक और चीरा प्रदर्शन। पेरिटोनियम के माध्यम से तिल्ली का निरीक्षण करें।
    2. तिल्ली निकालें और बर्फ पर एक दूसरे रक्तापघटन 1 मिलीलीटर पीबीएस युक्त ट्यूब और जगह में जगह है।
  5. फेफड़ों की चोट सूचकांक
    नोट: वायुकोशीय केशिका झिल्ली पारगम्यता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है FITC लेबल-एल्बुमिन रिसाव संवहनी डिब्बे से वायुकोशीय-interstitial डिब्बे।
    1. अपकेंद्रित्र खून का नमूना और 1500 x जी पर 10 मिनट के लिए बाल द्रव। नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में supernatants लीजिए। छर्रों की भर्ती प्लाज्मा या बाल कोशिकाओं के अनुरूप हैं और बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
    2. एक 96 अच्छी तरह से पारदर्शी प्लेट (300 μl कुओं) के लिए प्रत्येक रक्त सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा, पीला) या बाल सतह पर तैरनेवाला के 100 μl जोड़ें। तुरंत इस्तेमाल नहीं करता है, तो थाली पर एक पन्नी रखें।
    3. प्रतिदीप्ति प्लाज्मा में स्तर और एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर (; उत्सर्जन, 520 एनएम उत्तेजना, 487 एनएम) का उपयोग करते हुए बाल supernatants उपाय।
    4. प्रतिदीप्ति अनुपात की गणना के द्वारा फेफड़ों की चोट सूचकांक का निर्धारण [(बाल सतह पर तैरनेवाला / रक्त सतह पर तैरनेवाला) 100 x]।
  6. ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) अंतर कोशिका गिनती।
    नोट: कदम 5.5.1 पर बाल द्रव की centrifugation से प्राप्त सेल गोली का प्रयोग करें।
    1. यदि आवश्यक हो, लाल-सेल बफर का उपयोग करें। सेल युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब में लाल-सेल बफर के 500 μl जोड़ेंएल गोली। संक्षेप में भंवर और बर्फ पर 10 मिनट के लिए छोड़ दें। लाल-सेल को रोकने के लिए 500 μl पीबीएस जोड़ें।
    2. 1,500 x जी पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। तैरनेवाला निकालें और बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित। कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक hemacytometer का उपयोग। एक Mallassez hematocytometer पर कोशिकाओं की गणना करें। एक cytospin के साथ एक स्लाइड पर कोशिकाओं ध्यान लगाओ।
    3. सेल की पहचान और गिनती (मैक्रोफेज, लिम्फोसाइट, न्यूट्रोफिल) की अनुमति रंगाई किट का उपयोग कोशिकाओं दाग।
  7. फेफड़े बैक्टीरियल बोझ और बैक्टीरियल प्रसार
    नोट: फेफड़ों बैक्टीरियल बोझ और बैक्टीरियल प्रसार, फेफड़े और तिल्ली का आकलन करने के लिए क्रमशः एकत्र की है और पीबीएस (कदम 5.3.9) के 1 मिलीलीटर युक्त पूर्व तौला रक्तापघटन ट्यूबों में जमा थे।
    1. 1 मिलीलीटर पीबीएस और फेफड़ों या तिल्ली या तो युक्त रक्तापघटन नलियों वजन। फेफड़ों homogenates और तिल्ली homogenates प्राप्त करने के लिए एक ऊतक homogenizer के साथ नमूने homogenize।
    2. ऊतक होमोसेक्सुअल के 100 μl जमासीरियल लघुगणक dilutions प्राप्त करने के लिए बाँझ पीबीएस के 900 μl युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में genates।
    3. पी के लिए बीसीपी-अगर किसी पर पिछले दो उचित पतला नमूने (10 -3 और 10 -2) प्लेट aeruginosa या सी के लिए अगर YPD-एमिकासिन पूरक सफेद फेफड़ों और तिल्ली बोझ दृढ़ संकल्प।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों हे / एन सेते हैं। अगले दिन, प्लेटों पर कालोनियों की गणना करें।
    5. सूचकांक फेफड़ों के वजन के लिए परिणाम फेफड़ों के ग्राम प्रति एक सीएफयू प्राप्त करने के लिए। फेफड़े नमूना आकार परिणाम फेफड़ों के प्रति ग्राम सीएफयू में व्यक्त किया जाना चाहिए, एक ही नहीं कर रहे हैं।
      सूचकांक के लिए सूत्र है: [सीएफयू] एक्स [रक्तापघटन ट्यूब के वजन और फेफड़ों] - [रक्तापघटन ट्यूब के वजन]।

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Representative Results

प्रोटोकॉल विवरण के दौरान पहले से देखा के रूप में, प्रयोग (: प्रयोग समय चित्रा 1) को पूरा करने के लिए 5 दिन की जरूरत है। एक ऑपरेटर प्रयोग के पूरे चलाने के दौरान मांगा जाता है और 10 चूहों की एक अधिकतम करने के लिए प्रक्रियाओं को संभाल सकते हैं। अधिक जानवरों के लिए आवश्यक हैं, तो दो व्यक्तियों को विशेष रूप से शल्य नमूना संग्रह के लिए आवश्यक हैं। दरअसल सभी नमूनों पिछले चूहों में FITC लेबल एल्बुमिन का एक बढ़ा निष्क्रिय वायुकोशीय केशिका रिसाव से बचने के लिए 2 घंटा के तहत एकत्र किया जाना चाहिए।

पहले कदम के लिए सी की तैयारी है सफेद inoculum और इंट्रा-नाक टपकाना सी द्वारा एयरवे उपनिवेशन प्राप्त करने के लिए सफेद। एक 4 दिन-हठ मॉडल सी के 5 एक्स 5 10 CFU की intranasal टपकाना द्वारा प्राप्त की है माउस प्रति सफेद (चित्रा 2 बी)। इन 4 दिनों के दौरान, चूहों एल प्रेरित नहीं करता 5x10 5 सीएफयू के वजन (2A चित्रा) और टपकाना लाभUng चोट (चित्रा -2)। सी यद्यपि इस मॉडल में 4 दिनों के लिए, भार 48 घंटे के बाद कम हो जाती है ऊपर सफेद बना रह सकता है। इसलिए, पी aeruginosa प्रेरित तीव्र फेफड़े में संक्रमण सी की 48 घंटा में perfomed है सफेद हठ।

नैदानिक ​​फेफड़ों के 75% से 15 आइसोलेट्स में के रूप में पी aeruginosa तनाव PAO1, प्रमुख विषैलापन कारक, प्रकार तीन-स्राव प्रणाली (T3SS) जिसमें काफी हद तक विशेषता प्रयोगशाला तनाव है। शोध करे कारणों के लिए, PAO1 तीव्र फेफड़े में संक्रमण के पशु मॉडल में एक प्रासंगिक तनाव है। फेफड़ों की चोट फेफड़ों की चोट सूचकांक के रूप में व्यक्त एयरवे में संवहनी डिब्बे से प्रोटीन रिसाव से मापा alveolo-capillar पारगम्यता के माध्यम से मूल्यांकन किया है। Inoculum (चित्रा 3) के साथ फेफड़ों की चोट बढ़ जाती है। यहाँ हम पूर्व के बिना अकेले PAO1 तनाव (5x10 6 सीएफयू / माउस) (चित्रा 3 बी-3F) द्वारा प्रेरित हमारे मॉडल की गंभीर फेफड़ों की चोट घटक के कैनेटीक्स की रिपोर्टसी मध्यस्थता भड़काना albicans-। मॉडल के तनाव और समय बेशक, प्रारंभिक पी की पसंद पर निर्भर करता है aeruginosa inoculum अगले भाग में चर्चा की है और तालिका 1 में सुझाव दिया है।

समूह के अनुसार पांच चूहों का इस्तेमाल किया गया था। फेफड़ों की चोट सूचकांक (चित्रा 3 बी), फेफड़ों (चित्रा 3 सी) जीवाणु प्रसार (चित्रा 3 डी), बाल कोषमयता (3E चित्रा) और अंतर कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 3F) दर्शाती तिल्ली में, बैक्टीरियल बोझ में बैक्टीरियल बोझ हर 12 निर्धारित किया गया है घंटा। फेफड़ों की चोट 24 घंटा और 36 घंटे के संक्रमण के बाद (चित्रा 3 बी) के बीच अधिक से अधिक था। बैक्टीरियल बोझ से पता चला एक 1-लॉग इन करने के लिए हर 24 घंटा (चित्रा 3 सी) में कमी मिलीग्राम / सीएफयू। तिल्ली homogenate संस्कृतियों के द्वारा मूल्यांकन संचयी जीवाणु प्रसार प्रत्येक दिन (चित्रा 3 डी) की वृद्धि हुई। अंत में, असंक्रमित चूहों में बाल कोषमयता मुख्य रूप से (90%) बना है जबकि ओसंक्रमित चूहों से बाल में च वायुकोशीय मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल व्यापक रूप से भर्ती थे और अंतर कोशिकाओं की संख्या में 90% न्यूट्रोफिल और 10% मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों (3E चित्रा, 3F) से पता चला है।

आकृति 1
गंभीर फेफड़ों की चोट मॉडल की चित्रा 1. समय सेल्सियस के बीच होस्ट की मध्यस्थता बातचीत का पता लगाने के लिए सफेद और पी aeruginosa।
पूरी प्रक्रिया के ग्राफिक प्रतिनिधित्व। पहले कदम के लिए आवास की सुविधा चूहों के पर्यावरणीय रूपांतर है। दूसरा कदम सी है सफेद एयरवे उपनिवेशन मध्यस्थता। अंत में, तीसरे चरण के लिए पी द्वारा मध्यस्थता तीव्र फेफड़े में संक्रमण है aeruginosa। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2 सी सफेद एयरवे औपनिवेशीकरण।
(ए, बी) चूहों intranasally 10 5 सीएफयू सी के साथ डाले रहे हैं सफेद (तनाव SC5314)। चूहे सी के दौरान वजन सफेद मध्यस्थता एयरवे उपनिवेशन (ए)। एयरवे का औपनिवेशीकरण केवल एक प्रारंभिक टपकाना के साथ 3-4 दिनों के लिए लंबे समय तक जा सकता है। पिछले एक अध्ययन में, सहज उन्मुक्ति का भड़काना 24 और 48 घंटे के बीच होता है। (एन = 5 प्रति समूह), त्रुटि सलाखों एसडी ± साधन प्रतिनिधित्व करते हैं। सी (सी, डी) चूहों intranasally डाले हैं 5 एक्स 10 5 या 5 एक्स 10 6 CFU सफेद। 24 घंटा में वायुकोशीय केशिका बाधा पारगम्यता द्वारा मूल्यांकन फेफड़ों की चोट सूचकांक (सी)। वजन (डी) प्रारंभिक वजन के प्रतिशत के रूप में (एन = 5 प्रति समूह) व्यक्त किया।त्रुटि सलाखों एसडी ± साधन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
गंभीर फेफड़ों की चोट की चित्रा 3. मॉडल पी aeruginosa द्वारा प्रेरित किया।
(ए) C57BL / 6J चूहों-नाक से इंट्रा पी के बढ़ते भार से संक्रमित हैं aeruginosa (माउस प्रति 1 एक्स 10 6 7 से 10 एक्स 5 को सीएफयू) से (एन = 5 प्रति समूह), त्रुटि सलाखों एसडी ± साधन प्रतिनिधित्व करते हैं। चूहे 24 घंटा में euthanized हैं। फेफड़ों की चोट सूचकांक बैक्टीरियल बोझ के साथ आनुपातिक बढ़ जाती है कि वायुकोशीय केशिका बाधा पारगम्यता द्वारा मूल्यांकन किया है। फेफड़ों की चोट सूचकांक की तुलना (ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना supernatants का उपयोग कर फेफड़ों homogenates supernatants (काली सलाखों) और नए संयुक्त-विधि के साथ ग्रे बार पुरानी पद्धति का उपयोग कर प्राप्तएस) (बीएफ) चूहों इंट्रा-नाक से माउस प्रति 5 X10 6 CFU से संक्रमित हैं। चूहे गंभीर चोट मॉडल कैनेटीक्स के लिए हर 12 से 48 घंटा euthanized हैं। फेफड़ों की चोट (बी), फेफड़ों बैक्टीरियल बोझ (सी), तिल्ली बैक्टीरियल बोझ (डी), ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) कोषमयता (ई) और बाल अंतर सेल गिनती (एफ) भी मूल्यांकन कर रहे हैं। (एन = 5) समूह के प्रति, त्रुटि सलाखों एसडी ± साधन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. सर्जिकल उपकरण और Intranasal टपकाना।
(ए)   सर्जिकल उपकरण गंभीर चोट मॉडल और ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। यहां सांस की नली प्रवेशनी (20जी) और दो 1 मिलीलीटर सीरिंज एक luer ताला 3 तरह वाल्व से जुड़े हैं। एक सिरिंज फेफड़ों से बाहर वापस ब्रोन्कोएल्वियोलर द्रव आकर्षित करने के लिए, फेफड़ों में एक पानी इंजेक्षन करने के लिए। (बी, सी)   हाथ में माउस की स्थिति इंट्रा-नाक टपकाना प्रदर्शन करने के लिए। इस तस्वीर में, जबड़े के नीचे अंगूठे टपकाना दौरान एक बंद मुंह को सुनिश्चित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. सर्जरी और घोड़ा वायुकोशीय Lavage।
सीने में व्यापक रूप से (ए) खोला है और पसलियों दिल (बी) के लिए चोट से बचने के लिए laterally खोला है। रक्त संग्रह के बाद, गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र श्वासनली (सी) को बेनकाब करने के विच्छेदित है। चिकित्सकीय सोता एक के रूप में प्रयोग किया जाता हैसिवनी और श्वासनली (सी, डी) के पीछे पारित कर दिया है। श्वासनली तो सिरिंज और 3 तरह वाल्व पर घुड़सवार (डी) संयुक्त 20-जी प्रवेशनी साथ cannulated है। श्वासनली कसकर श्वासनली के पीछे जगह में सीवन का उपयोग कर एक शल्य गाँठ बांधने से प्रवेशनी चारों ओर सुरक्षित किया जाना चाहिए। अंत में पीबीएस के 500 μl धीरे फेफड़ों में डाले जाते हैं और फिर बाल धीरे से बाहर खींचा है। (ई) तरल पदार्थ डाले फेफड़ों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मिनिमल डाले बोझ अधिकतम डाले बोझ
T3SS- 5 10 x 7 1 एक्स 10 8
T3SS + 5 एक्स 10 6 1 10 x 7
T3SS + exoU + 5 एक्स 10 1 एक्स 10 5

तालिका 1 पी एक्यूट फेफड़े में संक्रमण मॉडल में इस्तेमाल aeruginosa inocula।
Inocula के सुझाए गए इष्टतम intranasal सांद्रता उपभेदों के अनुसार गंभीर फेफड़ों की चोट प्रेरित करने के लिए।

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Discussion

पशु मॉडल, विशेष रूप से स्तनधारियों, प्रतिरक्षा के क्षेत्र में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के जटिल तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी होते हैं। बेशक, केवल आवश्यक होना चाहिए पशु मॉडल से प्राप्य जानकारी के लिए की जरूरत है; अन्यथा, जानवरों के इस्तेमाल के लिए इन विट्रो मॉडल की जगह होना चाहिए। इस पशु मॉडल रोगजनकों के बीच बातचीत के लिए एक बहु-घटक मेजबान प्रतिक्रिया द्वारा मध्यस्थता है के बाद से केवल एक पशु मॉडल के आधार पर उपलब्ध कराया जा सकता है कि अंतर्दृष्टि को दिखाता है। वर्तमान में इस मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल चूहे एक परिपक्व और अनछुए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ 6 से 10 सप्ताह की आयु के युवा वयस्कों हैं। सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित करते हैं, C57BL6 / जम्मू पृष्ठभूमि चूहों पसंद कर रहे हैं। सेक्स और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर हार्मोनल चक्र (विशेष रूप से एस्ट्रोजन) का एक प्रभाव से बचने के लिए, पुरुषों इसलिए सबसे अच्छा विकल्प हैं। सांख्यिकीय महत्व को प्राप्त करने के लिए, समूहों प्रयोग के अंत में कम से कम 5 व्यक्तियों के लिए है, लेकिन सभी पशु experimen ने सुझाव दिया है चाहिएtation दिशा निर्देशों, प्रयुक्त जानवर की संख्या एक सख्त न्यूनतम करने के लिए कम और परिष्कृत किया जाना चाहिए।

अनुसंधान सुविधा के लिए पशुओं को उपलब्ध कराने के ब्रीडर से परिवहन चूहों में तनाव लाती है। परिणाम हमारे जैसे बाद के प्रयोगों को बदल सकते हैं कि भड़काऊ साइटोकिन्स का एक बढ़ा स्राव है। इसके अलावा, एक नए माहौल और नए "पिंजरे साथियों" तनाव के लिए योगदान करते हैं। नतीजतन, चूहों को अपने नए आवास वातावरण में अध्ययन करने से पहले कम से कम सात दिनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस आवास पर्यावरण मानक भोजन और पानी मसलन, एक दिन / रात चक्र, और उचित स्थिर नमी और तापमान प्रदान करने, नियंत्रित किया जाना है।

दोनों फेफड़ों के उपनिवेशवाद और फेफड़ों के संक्रमण मॉडल अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है। टपकाना इंट्रा-नाक से या इंट्रा-tracheally किया जा सकता है। बाद में अधिक मुश्किल होता है और कारण ऑक्सीजन में कमी हृदय की गिरफ्तारी के एक उच्च जोखिम को प्रशिक्षण के माध्यम से अधिक से अधिक विशेषज्ञता की आवश्यकता है। दरअसल, जनसंपर्कocedure सफलतापूर्वक कम से कम 15 सेकंड और इसलिए आवश्यक गहरी संज्ञाहरण में एक माउस intubate करने की आवश्यकता है। प्रशासन का मार्ग, कम जोखिम भरा आवश्यकता होती हल्का संज्ञाहरण सुलभ है और इसलिए अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है के बाद से इंट्रा-नाक टपकाना की हमारी पसंद के प्रदर्शन करने के लिए आसान है।

Boutoille एट अल पहले से ही FITC लेबल एल्बुमिन 16 का उपयोग वायुकोशीय केशिका बाधा पारगम्यता को मापने के माध्यम से हमारे गंभीर फेफड़ों की चोट मॉडल, फेफड़ों की चोट की विशेष रूप से मूल्यांकन का वर्णन किया। प्रयोग के प्रति चूहों की संख्या को कम करने के लिए, इस विधि के अनुकूल है और ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) के साथ मिलकर किया गया था। Boutoille एट अल के अध्ययन में, हम फेफड़ों homogenate supernatants में FITC लेबल एल्बुमिन की प्रतिदीप्ति और रक्त supernatants 17 के बीच तुलना का इस्तेमाल किया।

पूरी तरह से इस तुलना करने के लिए, हीमोग्लोबिन का स्तर और hematocrit स्तर भी आवश्यक हैं। इस विधि allo करने के लिए अनुकूलित किया गया थाhomogenization और फेफड़ों की चोट के आकलन और पानी से धोना और मेजबान प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक दूसरे के फेफड़ों समर्पित द्वारा मेजबान प्रतिक्रिया के सहवर्ती विश्लेषण डब्ल्यू। दरअसल, बाल द्रव साइटोकाइन स्तर, प्रोटीन का स्राव और सेल भर्ती का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे अनुकूलन पशु प्रयोग के दिशा-निर्देशों में सिफारिश के रूप में नाक आउट चूहों 17 का उपयोग करते हुए, खासकर जब लागत और चूहों की अपेक्षित संख्या को कम करने, एक भी पशु प्रयोग से अधिक परिणाम प्रदान करता है। इसके अलावा, फेफड़ों का एक हिस्सा कुल शाही सेना निकासी और मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन या histologic विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है। पिछले विधि और बाल के साथ युग्मित नया अनुकूलित विधि के बीच तुलना तुलनीय परिणाम (चित्रा 3) के फेफड़ों की चोट सूचकांक का आकलन करने से पता चलता है।

उसी प्रक्रिया का उपयोग Mear एट अल के अध्ययन में, विश्लेषण प्रवाह cytometer बाल द्रव की centrifugation द्वारा प्राप्त बाल कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया था। इसी तरह की एकnalyses फेफड़ों 12 से कुल फेफड़े की कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया। इस मामले में, FITC लेबल एल्बुमिन साथ फेफड़ों की चोट के आकलन के कारण FITC (हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन की तुलना में एक ही चैनल) द्वारा प्रेरित कलाकृतियों के लिए, समन्वित रूप से नहीं किया जा सकता। फ्लो की आवश्यकता है, तो इसलिए, प्रयोगों के हिसाब से योजना बनाई जानी चाहिए।

इच्छामृत्यु का समय महत्वपूर्ण है। पहले 72 घंटा से अधिक तीव्र फेफड़े में संक्रमण मॉडल की एक समय के पाठ्यक्रम चित्रा 3 में प्रस्तुत किया है। इस मॉडल में, फेफड़ों की चोट और मेजबान प्रतिक्रिया की परिपूर्णता (3 चित्रा) घंटा 24 के बीच और 36 होता है। इस प्रकार, हमारे डिजाइन में 24 घंटा अंत बिंदु 3 कारणों के लिए एक readout के रूप में चुना गया था: पहला, यह दूसरे की वजह से अंत में 24 और 36 घंटा, और बीच मृत्यु दर के लिए चूहों के नुकसान से बचने के लिए प्रयोगशाला में व्यवस्थित करने के लिए आसान है, मेजबान प्रतिक्रिया इस समय बिंदु पर अधिक से अधिक था।

हमारी बातचीत के अध्ययन के पहले कदम के साथ एयरवे की बसाना है <उन्हें> सी। सफेद। माउस प्रति 10 5 CFU की एक टपकाना का उपयोग करना, एक 4 दिन हठ मॉडल किसी भी फेफड़ों की चोट के बिना प्राप्त की है। वास्तव में, चूहों इस चरण के समय के पाठ्यक्रम पर वजन प्राप्त की। संक्रमण के लिए विरोध के रूप में वजन उपनिवेशन के साथ लाइन में चोट के अभाव का एक उपयोगी सूचक है। दरअसल, एक वृद्धि की प्रारंभिक लोड (माउस के अनुसार 6 से 10 से अधिक सीएफयू) प्रेरित फेफड़ों की चोट (चित्रा -2) और मामले चूहों वजन खो दिया है जिसमें अब तक भड़काना परे एक हानिकारक मेजबान प्रतिक्रिया (चित्रा 2 डी)। इसके विपरीत, एक छोटे प्रारंभिक लोड (माउस प्रति उदाहरण के लिए 10 4 सीएफयू) एक airway हठ मॉडल प्राप्त नहीं किया जा सकता है का उपयोग कर। इस प्रकार, Mear एट अल 12 से वर्णित मेजबान उन्मुक्ति के मनाया भड़काना प्राप्त करने के लिए, डाले कवक बोझ की जांच के सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और वजन वक्र की निगरानी एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है।

एक ही सटीक पी के लिए आवश्यक है aeruginosa पी प्रेरित नहीं करता aeruginosa तेजी से एक उपयुक्त मेजबान प्रतिक्रिया से वायुमार्ग से मंजूरी दे दी है। एक पीढ़ी उच्च प्रारंभिक पी का प्रयोग aeruginosa मेजबान रक्षा की क्षमता बढ़कर या भी लोड है, जिसके परिणामस्वरूप एक अनुचित और derleterious प्रतिक्रिया लाती है समूहों के बीच सभी मतभेदों को मिटा के लिए बड़े पैमाने पर गंभीर चोट और मौत की ओर जाता है। गंभीर चोट के लिए प्रेरित करने के लिए इष्टतम inoculum एक कार्यात्मक टाइप -3 स्राव प्रणाली (T3SS) और exotoxin यू, मेजबान कोशिका कोशिका द्रव्य में T3SS द्वारा translocated एक विष के उत्पादन की उपस्थिति की निर्भर करता है। इन दोनों के तनाव-विशिष्ट विशेषताओं प्रारंभिक बैक्टीरियल बोझ के चुनाव में विचार किया जाना है। निचले और ऊपरी सीमा के उदाहरण T3SS नकारात्मक या सकारात्मक तनाव, और दबाव से exotoxin यू के उत्पादन या नहीं (तालिका 1) के साथ गंभीर फेफड़ों की चोट के लिए प्रेरित करने के रूप में प्रारंभिक बैक्टीरियल बोझ इस लेख में सुझाव दिया है। अध्ययन करते हैंT3SS की भागीदारी, तनाव हे / एन हो गई है और inoculum की तैयारी T3SS का इष्टतम गतिविधि प्राप्त करने से पहले नए लेग माध्यम 3 घंटा के साथ पुनर्जीवित किया जाना है।

पी के बाद बैक्टीरियल और फंगल बोझ 24 घंटा के निर्धारण aeruginosa प्रेरित फेफड़ों के संक्रमण के इस खंड में चर्चा विशिष्ट विचार की आवश्यकता है। के रूप में दिखाया दरअसल, चूहों 24 घंटा होगा पर फेफड़ों में 5 एक्स 10 6 CFU T3SS पॉजिटिव तनाव, बैक्टीरियल बोझ से संक्रमित हैं के बारे में जब एक लॉग (चित्रा 3 सी) को कम किया है। नमूने के सीरियल dilutions 5 लॉग कमजोर पड़ने अप करने के लिए प्रदर्शन किया और बीसीपी-अगर प्लेटों पर चढ़ाया जाना चाहिए। सी के विषय में फेफड़ों में सफेद, 72 घंटा में, कवक बोझ के बारे में 2 लॉग करने के लिए कम हो जाती है और नमूने कॉलोनी पहचान की सुविधा के लिए एमिकासिन के साथ पूरक YPD-अगर पर चढ़ाया जा के लिए करना चाहिए। अंत में, जीवाणु प्रसार के निर्धारण बीसीपी-अगर पर रक्त नमूने के 100 μl चढ़ाना द्वारा या तिल्ली घंटा की 100 μl चढ़ाना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकताएक ही माध्यम पर omogenates। दो तरीकों पहले से ही तुलना में और तिल्ली संस्कृति और अधिक सटीक हो रहा है कर दिया गया था। दरअसल, तिल्ली "फिल्टर" पूरे रक्त और "ध्यान" और बैक्टीरिया के संरक्षण हो सकता है खून पर प्रचारित कर रही है कि एक अंग है। इस प्रकार, तिल्ली homogenates खून से एक उच्च संवेदनशीलता के साथ तीव्र फेफड़े में संक्रमण के दौरान प्रणालीगत जीवाणु प्रसार को दर्शाते हैं। रक्त के नमूने एक बहुत विशिष्ट निश्चित समय पर बैक्टीरियल प्रसार का प्रतिनिधित्व करते हैं और सही मायने में एक पूरे के रूप में जीवाणु प्रसार की घटना को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है। इसलिए तिल्ली homogenate संस्कृतियों पसंद कर रहे हैं।

फेफड़ों की चोट सूचकांक संक्रमण और / या अनुचित मेजबान प्रतिक्रिया और इन घटकों पर संभावित चिकित्सा के प्रभाव से उत्पन्न फेफड़ों की चोट का एक संवेदनशील आकलन है। साथ ही, इस में विव ओ मॉडल मेजबान प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए कई अलग अलग नमूनों के संग्रह की अनुमति देता है। फेफड़े आरएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताजीन प्रतिलेखन के। फेफड़े के नमूने भी आगे ऊतकीय टिप्पणियों के paraformaldehyde (पीएफए) में रखा जा सकता है। बाल द्रव इस तरह के भड़काऊ साइटोकिन्स के रूप में प्रोटीन का स्राव के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, प्रोटोकॉल के ऊपर चर्चा के रूप में प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए नमूने प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल सी modelize करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता ऐसे स्ताफ्य्लोकोच्चुस 18 या Enterobacteriae के रूप में वेंटीलेटर जुड़े निमोनिया में शामिल albicans- रोगाणुओं बातचीत। एक और अनुकूलन बैक्टीरिया का उपयोग करने के बजाय सी एयरवे उपनिवेशन हो सकता है सफेद ऐसे श्वासनलिकाविस्फार के रूप में पुरानी पकने वाला फेफड़ों के रोग में बैक्टीरिया बातचीत modelize करने के लिए। प्रतिरक्षा सक्षम चूहों में बैक्टीरियल क्लीयरेंस एक लगातार एयरवे उपनिवेशन की अनुमति नहीं है, क्योंकि यह अंत करने के लिए, immunocompromised चूहों, इस्तेमाल किया जा रहा है।

टपकाना के लिए, पशु पकड़े हाथ की स्थिति CRI हैराजनैतिक। पहले से ही पिछले भाग में रेखांकित के रूप में इंट्रा-नाक से माउस instilling, जब ऑपरेटर कि मुंह पूरी तरह से समाधान के कफ से बचने के लिए बंद कर दिया है यह सुनिश्चित करना चाहिए। अंगूठे पूरे टपकाना प्रक्रिया (चित्रा 4 बी) के दौरान बंद मुंह जबड़े का समर्थन करता है और रखता है। फिर, दूसरे हाथ से, पिपेट उत्तरोत्तर और धीरे बुलबुला बनने से रोकने के लिए हवा के बिना डाले एक नथुने (चित्रा 4C) और समाधान पर जमा किया जाता है। जाहिर है, टपकाना एक स्तर 2-जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

नमूने का संग्रह ऑपरेटर की certifed छोटे पशु शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण की आवश्यकता है। हर कदम पर, नमूने सेल से बचने और विकृतीकरण से प्रोटीन की रक्षा करने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। बेसिक सर्जिकल उपकरण (चित्रा -4 ए) के लिए आवश्यक हैं। वे उपयोग करने से पहले autoclaving द्वारा निष्फल हो के लिए करना चाहिए। यह अलग शल्य चिकित्सा उपकरण सेट abdomina के लिए इस्तेमाल किया जा सिफारिश की हैएल और फेफड़ों के नमूने के पार संदूषण से परहेज वक्ष शल्य कदम,। शल्य विच्छेदन के विभिन्न महत्वपूर्ण कदम (चित्रा 5 ए-5E) प्रस्तुत कर रहे हैं। माउस की स्थिति गंभीर है; यह ऑपरेटर और सीधे से सिर विपरीत वापस आ गया है पर पशु फ्लैट स्थिर किया जाना चाहिए। इथेनॉल उदारतापूर्वक त्वचा से नमूनों में बाल के प्रसार और संभावित जीवाणु संक्रमण से बचने के लिए पहले चीरा से पहले प्रस्तुत करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। त्वचा को अच्छी तरह vascularized है और खून बह रहा है (चित्रा 5 ए) से बचने के लिए सावधानी से मुकर जाना चाहिए।

तब ribcage ribcage लगातार चीरा के दौरान दिल और फेफड़ों के लिए चोट से बचने के लिए चिमटी से पकड़ में बनाए रखा जाना चाहिए, जिसके दौरान एक पार्श्व छाती चीरा निम्नलिखित reclined है। फेफड़े और दिल (चित्रा 5 ब) सामने आ रहे हैं। असंक्रमित फेफड़ों श्वेताभ (चित्रा 5 ब) दिखाई देते हैं। ग्रीवा क्षेत्र के विच्छेदन श्वासनली उजागर करता है और एक सिवनी कार हैefully ऊपरी श्वासनली (चित्रा 5C) के पीछे रखा। श्वासनली cannulating सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। एक oversized प्रवेशनी का उपयोग न करें (अधिकतम आकार 20 जी) है। दो उपास्थि के छल्ले के बीच झिल्ली का श्वासनली का एक छोटा सा चीरा पूर्वकाल प्रवेशनी की प्रविष्टि की अनुमति देता है। प्रवेशनी कैरिना (चित्रा 5 डी) के ऊपर श्वासनली के माध्यम से पारदर्शिता से मनाया जाता है, सीवन कसकर प्रवेशनी (चित्रा 5E) के आसपास इसे हासिल श्वासनली चारों ओर बंधा हुआ है। प्रवेशनी महिला बंदरगाहों से जुड़े 2 सीरिंज के साथ एक 3-तरह पुरुष luer ताला वाल्व से जुड़ा है। एक सिरिंज ठंडा पीबीएस ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना के लिए होता है; अन्य बाल द्रव वापस आकर्षित करने के लिए खाली है। ये सीरिंज समूहों के बीच chaged किया जाना चाहिए।

अंत में, गंभीर फेफड़ों की चोट मॉडल के लिए पूर्व भड़काना रोगजनकों के बीच विवो मेजबान की मध्यस्थता बातचीत में पता लगाने के लिए एक प्रासंगिक और शक्तिशाली मॉडल है। जानवरों का इस्तेमाल होता हैमुख्य सीमा और ध्यान से इन विट्रो में प्राप्य जानकारी खिलाफ तौला जाना चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 107, भड़काना प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया फेफड़ों की चोट
माइक्रोबियल समुदायों का अध्ययन<em&gt; Vivo</em&gt;: बीच होस्ट की मध्यस्थता बातचीत का एक मॉडल<em&gt; Candida Albicans</em&gt; और<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; एयरवेज में
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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis,… More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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