Abstract
Bestuderen van gastheer-pathogeen interactie stelt ons in staat om de onderliggende mechanismen van de pathogeniciteit te begrijpen tijdens de microbiële besmetting. De prognose van de gastheer is afhankelijk van de betrokkenheid van een aangepaste immuunreactie tegen de pathogeen 1. Immuunrespons is complex en de resultaten van de interactie van verschillende pathogenen en immune of niet-immune celtypes 2. In vitro studies kunnen deze interacties te karakteriseren en gericht op mobiele-pathogeen interacties. Bovendien is in de luchtweg 3, vooral bij patiënten met etterige chronische longziekte of kunstmatig beademde patiënten, polymicrobiële gemeenschappen aanwezig compliceren gastheer-pathogeen interactie. Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans beide problemen pathogenen 4 vaak geïsoleerd uit tracheobronchiale monsters, en geassocieerd met ernstige infecties, vooral in intensive care unit 5. Microbiële interactiesgerapporteerd tussen deze pathogenen in vitro maar de klinische gevolgen van deze interacties onduidelijk 6. Om de interacties tussen C. Albicans en P. bestuderen aeruginosa, een muizenmodel van C. albicans luchtwegen kolonisatie, gevolgd door P. aeruginosa- gemedieerde acute longinfectie werd uitgevoerd.
Introduction
Diermodellen, in het bijzonder muizen, zijn uitgebreid gebruikt om immuunresponsen tegen ziekteverwekkers te ontdekken. Hoewel aangeboren en verworven immuniteit verschillen tussen knaagdieren en mensen 7, het gemak in kweek en de ontwikkeling van knockouts voor tal van genen maakt muizen een uitstekend model om immune responsen 8 bestuderen. De immuunrespons is complex en voortvloeit uit de wisselwerking van een pathogeen, de bewoner microbiële flora en verschillende immune (lymfocyten, neutrofielen, macrofagen) en niet-immune (epitheelcellen, endotheelcellen) celtypes 2. In vitro studies niet toestaan observeren deze complexe interacties en zich vooral richten op unieke cel-pathogeen interacties. Terwijl diermodellen moet met voorzichtigheid worden gebruikt en beperkt tot zeer specifieke en relevante vragen, muis modellen geven een goed inzicht in het zoogdier immuunrespons in vivo en kunnen delen van belangrijke klinische 7 vragen aan te pakken.
6. Terwijl wat een "normale" luchtwegen microbiome moet nog worden bepaald, inwoner gemeenschappen vaak polymicrobiële, en afkomstig van verschillende ecologische bronnen. Patiënten met een etterige chronische longziekte (cystic fibrosis, bronchectasis) of mechanisch geventileerde patiënten vertonen een bijzondere flora vanwege kolonisatie van de luchtwegen door milieuvriendelijke verworven micro-organismen 9. Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans zijn beide probleem pathogenen 5, vaak samen geïsoleerd van tracheobronchiale monsters en verantwoordelijk voor ernstige opportunistische infectie bij deze patiënten, vooral in de intensive care unit (ICU) 4.
Isolatie van deze micro-organismen tijdens acute longontsteking bij ICU resulteert in anti-microbiële behandeling tegen P. aeruginosa but gist worden gewoonlijk niet beschouwd als pathogeen op deze plaats 5. In vitro interactie tussen P. aeruginosa en C. albicans zijn op grote schaal gemeld en toonde dat deze micro-organismen groei en overleving van elkaar kunnen beïnvloeden maar studies konden concluderen of de aanwezigheid van C. albicans schadelijk hetzij gunstig voor de host 10. Muismodellen zijn ontwikkeld om dit relevant P. pakken aeruginosa en C. albicans in vivo, maar de interactie tussen micro-organismen niet het belangrijkste punt. Inderdaad, werd het model opgericht om de betrokkenheid van C. evalueren albicans in gastheer immuunrespons, en het resultaat.
Een vorige model opgericht door Roux et al reeds een eerste kolonisatie met C. albicans gevolgd door een acute longinfectie veroorzaakt door P. aeruginosa. Met behulp van hun model, vonden de auteurs een schadelijke rol van prior C. albicans kolonisatie 11. Echter Roux et al gebruikten een hoge belasting van C. albicans in hun uitvoering met 2 x 10 6 CFU / muis gedurende 3 opeenvolgende dagen. We een 4-daagse model van C. albicans luchtwegkolonisatie, althans persistentie zonder longbeschadiging, In dit model C. albicans werd teruggewonnen tot 4 dagen na een enkele indruppeling van 10 5 CFU per muis (Figuur 2B) 12,13. Na 4 dagen werd geen bewijs van inflammatoire cel werving, inflammatoire cytokine productie noch epitheelbeschadiging waargenomen. Op 24 - 48 uur, op het hoogtepunt aanwezigheid van C. albicans, terwijl een cellulaire en cytokine aangeboren immuunrespons waargenomen, was er geen bewijs van longbeschadiging. Verrassenderwijs muizen aldus gekoloniseerd met C. albicans 48 uur voorafgaand aan de instillatie van P. intranasale aeruginosa infectie was verzwakt in vergelijking met muizen met P. aeruginosa infecties alleen. ikndeed, muizen vertoonden minder longbeschadiging en verminderde bacteriële last 12,13.
Verschillende hypotheses kan dit gunstige effect van voorafgaande kolonisatie met C. verklaren albicans op P. aeruginosa gemedieerde acute longinfectie. Ten eerste, een interspecies overspraak waarbij elk micro-quorum sensing systemen, de homoserinelactone gebaseerde P. aeruginosa systeem en de Farnesol gebaseerde C. albicans systeem geëvalueerd. Ten tweede, C. albicans als een "decoy" target voor P. aeruginosa omleiden van het pathogeen uit longepitheelcellen bestudeerd. Beide hypothesen werden ongeldig (ongepubliceerde gegevens). De derde hypothese was dat van een "priming" van het aangeboren immuunsysteem door C. albicans verantwoordelijk voor een versterkte volgende aangeboren respons tegen P. aeruginosa. Deze laatste hypothese werd bevestigd. Inderdaad C. albicans kolonisatie leidde tot een priming van aangeboren immuniteit through IL-22, voornamelijk uitgescheiden door aangeboren lymfoïde cellen, wat resulteert in verhoogde bacteriële verwijdering en verminderde longbeschadiging 12.
Concluderend is de gastheer een centrale actor in de interactie tussen microorganismen moduleren van de aangeboren immuunrespons en waarbij verschillende inflammatoire celtypen. Hoewel deze complexe immuuninteracties kan worden ontleed in vitro de oorspronkelijke hypothesen alleen nodig, worden voorzien in vivo modellen. Het volgende protocol geeft een voorbeeld van in vivo onderzoek van gastheer pathogeen gemedieerde interacties die kunnen worden aangepast voor andere micro-organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De regionale ethische regionale commissie voor dierproeven heeft deze methode goedgekeurd, in overeenstemming met de nationale en internationale dierlijke zorg en gebruik in onderzoek richtlijnen onderzoek.
1. Sample Collection
- Monster opslag
- Verzamel alle monsters en onmiddellijk op te slaan bij - 20 ° C of op ijs tot diepvries opslag verslechtering te voorkomen. Plaats steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs bronchoalveolaire spoelingen (BAL) te verbeteren.
- Chirurgie
- Steriliseren alle chirurgische apparatuur met behulp van een autoclaaf.
LET OP: Als het mogelijk is, is het raadzaam om twee verschillende sets van instrumenten te gebruiken voor abdominale en thoracale stappen om kruisbesmetting te voorkomen. Dissectie benodigde apparatuur is beschreven in Figuur 4A
- Steriliseren alle chirurgische apparatuur met behulp van een autoclaaf.
2. Muizen, Bacteriële en giststammen
- Huis muizen in overeenstemming met de plaatselijke gebruik van dieren in rerichtlijnen zoekopdracht commissie in een geventileerde rack zonder overschrijding van 5 muizen per kooi, met voedsel en water ad lib, in een bioveiligheidsniveau 2 woningen faciliteit te wijten aan het gebruik van bioveiligheidsniveau 2 micro-organismen: P. aeruginosa en C. albicans.
- Houd de bacteriestammen bij -80 ° C in 40% glycerol medium.
- Voeg bacteriën direct uit ingevroren voorraad in kweekbuis met 3 ml steriel Luria-Bertani bouillon met een 10 pl entoog. Laat O / N bij 37 ° C met orbitaal schudden (400 rpm) de dag vóór instillatie.
- Harvest bacteriën door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant in een geschikt gesloten biologisch gevaarlijk afval. Observeren witte aanhangend pellet op de bodem van de cultuur buis.
- Was de pellet met behulp 5 ml PBS opschorten.
- Herhaal de stappen 2.2.2 tot een tweede keer om een tweede wasbeurt te voeren 2.2.3.
- Resuspendeer de gepelleteerde bacteriën via 1 ml PBSen kort vortexen.
- Bepaal de inoculumdichtheid met optische densitometer bij 600 nm met behulp van een optische dichtheid meter. Een dichtheid van 0,9 komt overeen met 10 9 CFU / ml voor PAO1 dienovereenkomstig verdund.
Opmerking: Dit resultaat voor elke gebruikte stam worden verkregen door bepalen van de dichtheid van opeenvolgende verdunningen van een gekalibreerde inoculum. - Controleer de entstof door seriële logaritmische verdunningen en de plaat 100 ul van elke verdunning op broomkresolpurper agar (BCP) platen en O / N cultuur. Dien elke muis intranasaal 50 pl van de oplossing met 1 x 10 8 om 2 x 10 8 CFU per ml (5 x 10 6 om 1 x10 7 CFU per muis).
- Gebruik C. albicans SC5314 als referentiestam. Behoud van de stam in 40% glycerol medium bij -80 ° C.
- Supplement Gist-pepton-dextrose bouillon met 0,015% amikacine om bacteriële besmetting te voorkomen en verder tellen vergemakkelijken.
- Gist toe te voegen met behulp van 10 &# 181; l enting lus in de voorbereide YPD-bouillon aangevuld met amikacine O / N bij 37 ° C.
- Gist oogsten door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 min.
- Verwijder supernatant in een geschikt bioharzard afvalverwijdering. Witte aanhangend pellet moeten worden waargenomen in de bodem van de cultuur buis.
- Was en schorten de gepelleteerde bacteriën met behulp van 5 ml PBS en kort vortexen.
- Herhaal de stappen 2.2.2 tot een tweede keer om een tweede wasbeurt te voeren 2.2.3.
- Resuspendeer de pellet met behulp van 1 ml PBS en kort vortexen.
- Bepaal de grootte van het inoculum door telling op een Mallassez hematocytometer met een standaard microscoop bij een vergroting van 40x.
OPMERKING: Concentratie (in CFU / ml) verkregen met de volgende formule: (aantal gist 5 x 10) / (aantal getelde raster rechthoeken op de Mallassez hematocytometer). - Controleren door logaritmische seriële verdunning tot 10 -5 en 10 -6 om te bevestigen dat de oplossing bevat 2 x 10 6 CFU / ml.
- Plaat op YPD-agar-platen, aangevuld met 0,015% amikacine.
3. Airways kolonisatie door C. albicans
OPMERKING: Na het milieu aanpassing worden muizen twee keer per dag gewogen.
- Onder een zuurkast, borg 500 pi van sevofluraan op een 4 cm x 4 cm gaas (open-drop techniek) 14.
- Onmiddellijk het gaas op de vloer van een ongeveer 750 ml inductie kamer. Plaats onmiddellijk een mesh verhoogd platform boven het gaas om direct contact tussen het dier en het gaas te voorkomen.
- Sluit luchtdicht deksel en wacht 1-2 min tot diffusie van Sevofluraan laten in de kamer.
- Breng de muis van kooi naar platform en sluit het deksel mesh. Lichte anesthesie met geconserveerde spontane ademhaling moet worden bereikt om 30 45 sec.
- Monitor voor hypotonie door het waarnemen van het verlies van oprichtreflex waarna de muis f kan worden verwijderdROM De doos en ingeprent.
- Intranasale instillatie (kan in 10 seconden worden uitgevoerd door een getrainde operator).
- Houd de muis een hand genesteld op zijn rug overeind gehouden (Figuur 4B).
- Met behulp van de wijsvinger, ondersteunen het hoofd en gebruik de duim aan de kaak gesloten te houden om te voorkomen dat slijm (Figuur 4C).
- Zoals beschreven in stap 2.3.8, ervoor te zorgen dat de voorbereide C. albicans oplossing bevat 2 x10 6 CFU per ml van een 50 pl volume ingeprent.
OPMERKING: De tweede kritische punt is de bijgebracht volume. Een volume van minder dan 50 ul kan leiden tot een onvoldoende kolonisatie of inhomogene instillatie van de luchtwegen, kan een groter volume verdrinking / verstikking en dood veroorzaken. - Boezemen de muis intra-nasaal door het naderen van de pipet om de neusgaten.
- Pipetteer 50 ul druppel vormen van een bel die de oplossing op de neus vervolgens ingeademd door de spontaneously ademhaling muis.
- Plaats muis in een herstel gebied (bijvoorbeeld een grote, goed belucht kale kooi met een overhead verwarming lamp). Muizen moeten worden gecontroleerd tot volledig ontwaken. Heeft een dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn borstligging en oprichtende reflex behouden heeft herwonnen. Op dit punt kan de muis worden teruggebracht naar normale behuizing kooi.
4. P. aeruginosa geïnduceerde Acute Lung Infectie
LET OP: De muizen worden gewogen tijdens de volgende vier dagen. Normaal, muizen gewichtstoename tijdens C. albicans-gemedieerde luchtwegkolonisatie (Figuur 2A).
- Bereid de suspensie die P. aeruginosa de dag van de instillatie na O / N groei (paragraaf 2.2).
- Verdoven kort met behulp ingeademd Sevoflurane zoals hierboven (punt 3.1) beschreven.
OPMERKING: acute longontsteking uit te voeren, raden bacteriële last worden voorgesteld inTabel 1. - Boezemen de muis, zoals hierboven (punt 3.2) beschreven met bijzondere aandacht voor de post-instillatie herstel.
5. Meet van Lung Injury Index
- Bereid een oplossing van FITC-gemerkte albumine. Injecteer deze oplossing 2 uur voor dieren euthanasie.
- Weeg 0,2 mg albumine-FITC met de juiste apparatuur.
- Voeg 0,2 mg in 1 ml PBS. Kort vortex. Indien niet onmiddellijk gebruikt, plaatst u de oplossing in folie om de blootstelling aan omgevingslicht te voorkomen.
- Injecteer intraperitoneaal 200 ul FITC-gelabelde albumine oplossing voor elke muis.
- Euthanasia
- Weeg de muizen voor de laatste gegevens over het gewicht.
- Euthanaseren een enkele muis in overeenstemming met lokale gebruik van dieren in het onderzoek de commissie richtlijnen met behulp van een intra-peritoneale injectie van een dodelijke overdosis van pentobarbital: 300 ul van 5,47% pentobarbital.
- Verwijder muis van de kooi en ontvangt lEthal injectie door de operator.
- Na injectie, overdracht van de muis alleen een andere kooi, verborgen voor andere dieren. Let op de muis totdat er geen beweging. Bevestig de dood is door de afwezigheid van beweging, met name respiratoire beweging, gebrek aan impuls.
- Het uitvoeren van chirurgische verzamelen van monsters op dode dieren, dus zonder verdoving of pijnstillers.
- Chirurgische monstername: Thoracic podium.
OPMERKING: Om steriele omstandigheden te handhaven, wordt al een operatie uitgevoerd met behulp van steriele apparatuur in een bioveiligheidsniveau 2 omgeving.- Breng ethanol op de huid. Voer een middellijn incisie in de huid van het borstbeen tot medio buik met een schaar. Van middellijn insnijden langs de ribbenkast aan beide zijden. Vouw de huid aan beide zijden van de thorax aan de ribbenkast visualiseren.
- Voer een verticale insnijding van de ribbenkast aan weerszijden gaand naar de sleutelbeenderen om te kunnen het gehele voorste borstwand aanliggen met de achterstevenum waardoor de perfecte visualisatie van het hart en de longen (figuur 5A, 5B).
- Verzamel bloed met behulp van een pre-heparined spuit door aanprikken van het hart naast de interventriculaire slagader. Trek minimaal 500 ul minstens 100 pl plasma te verkrijgen. Leg het bloedmonster op het ijs.
- Voer een middenlijn cervicale insnijding aan de luchtpijp (figuur 5B en 5C) te visualiseren. Ontleden de fascia rond de luchtpijp zorgvuldig. Plaats een hechting achter de luchtpijp (figuur 5C en 5D). Vervolgens wordt de hechtdraad gesloten rond de canule naald om goede lavage waarborgen.
- Katheteriseren de luchtpijp met behulp van de 20-G gemodificeerd maagsonde naald (Figuur 5D en 4A). Bind een chirurgische knoop rond de gecanuleerde luchtpijp met de eerder geplaatste hechtdraad.
- Om bronchoalveolaire spoelingen (BAL) uit te voeren, voorzichtig en geleidelijk te injecteren en trekken 500 ul ijskoude PBS in / uit de long. Plaats het monster op de ice cellulaire lyse voorkomen.
- Herhaal stap 5.3.6, 3 keer in totaal 1500 pl BAS vloeistof en pool lavage monsters krijgen in een 2 ml centrifugebuis (figuur 5E).
- Verwijder de longen uit de borst. Plaats een long-segment (grootte moet overeenkomen met de helft van een long of een kwab) in 1,5 ml centrifugebuis en opslaan snel bij - 80 ° C.
- Plaats een long-segment in een vooraf gewogen hemolyse buis met PBS om bacteriële last te bepalen en plaats het op het ijs.
- Chirurgische monstername: abdominale podium.
- Voer een incisie aan de linkerkant van de buik. Let op de milt door het buikvlies.
- Verwijder de milt en plaats in een tweede hémolyse buis met 1 ml PBS en plaats op ijs.
- Longbeschadiging index
OPMERKING: alveolaire capillaire membraan-permeabiliteit wordt bepaald door het meten FITC-gelabelde albumine lekkage uit het vasculaire compartiment naar de alveolaire-interstvrijwaart de oorspronkelijke compartiment.- Centrifuge bloedmonster en BAL vloeistof voor 10 min bij 1500 x g. Verzamel supernatanten in nieuwe centrifugebuisjes. De pellets overeen met aangeworven plasma of BAL cellen en moeten op ijs geplaatst.
- Voeg 100 ul van elk supernatant bloed (plasma, geel) of BAL supernatant van een 96-well ruit (300 ui putjes). Plaats een folie op de plaat als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.
- Meet fluorescentie niveaus in plasma en BAL supernatanten met behulp van een fluorescentie microplaat lezer (excitatie 487 nm, emissie 520 nm).
- Bepaal de longbeschadiging index door het berekenen van de fluorescentieverhouding [(BAL supernatant / bloed supernatans) x 100].
- Bronchoalveolaire lavage (BAL) differentiële celtelling.
OPMERKING: Gebruik de cel pellet verkregen uit centrifugeren van BAL vloeistof in stap 5.5.1.- Indien nodig, gebruik van rode cellysisbuffer. Voeg 500 ul van rode cellen lysis buffer in de centrifugebuis die de CELl pellet. Kort vortex en laat 10 min op ijs. Voeg 500 ul PBS rode-cellysis stoppen.
- Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1500 x g. Verwijder supernatant en schorten de cel pellet in 1 ml steriele PBS. Inventariseer cellen op een Mallassez hematocytometer. Met behulp van een hemacytometer om Cells Count. Concentreer cellen op een dia met een cytospin.
- Vlek cellen met behulp van kleuring kit voor de identificatie en telling (macrofagen, lymfocyten, neutrofielen) cel.
- Long bacteriële belasting en bacteriële verspreiding
OPMERKING: long bacteriële belasting en bacteriële verspreiding, longen en milt beoordelen respectievelijk verzameld en opgeslagen in vooraf gewogen hemolyse buizen met 1 ml PBS (stap 5.3.9).- Weeg hemolyse buisjes met 1 ml PBS en hetzij longen en milt. Homogeniseer de monsters met een weefselhomogenisator long homogenaten en milt homogenaten verkrijgen.
- Stort 100 pl weefsel homogenates in centrifuge buisjes die 900 ul steriel PBS tot seriële logaritmische verdunningen te verkrijgen.
- Plaat de laatste twee geschikte verdunde monsters (10 -3 en 10 -2) aan beide BCP-agar voor P. aeruginosa of YPD-amikacine-aangevuld agar voor C. albicans long en milt last bepalen.
- Incubeer de platen O / N bij 37 ° C. De volgende dag opsommen de kolonies op platen.
- Index het resultaat longgewicht een CFU per gram long verkrijgen. Lung steekproefomvang niet hetzelfde, de resultaten worden uitgedrukt in CFU per gram long.
Formule voor de index is: [CFU] x [gewicht van hemolyse buis en longen] - [gewicht van hemolyse buis].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals eerder gezien tijdens het protocol beschrijving, het experiment moet 5 dag (Figuur 1: experiment tijdlijn) te voltooien. Een operator gevraagd tijdens de gehele run van het experiment en kan omgaan met de processen tot een maximum van 10 muizen. Als er meer dieren nodig zijn, zijn twee personen nodig zijn in het bijzonder voor chirurgische monstername. Inderdaad alle monsters moeten worden verzameld in het kader van 2 uur tot een verhoogde passief alveolaire-capillaire lekkage van FITC-gelabelde albumine in de laatste muizen voorkomen.
De eerste stap is de bereiding van C. albicans entstof en intra-nasale instillatie van de luchtwegen kolonisatie door C. verkrijgen albicans. Een 4-dagen-persistentie model wordt verkregen door intranasale instillatie van 5 x 10 5 CFU van C. albicans per muis (Figuur 2B). Tijdens deze 4 dagen, muizen gewicht (Figuur 2A) en het inbrengen van 5x10 5 CFU krijgen doet l induceertung letsel (figuur 2C). Hoewel C. albicans kan aanhouden tot 4 dagen in dit model, belasting afneemt na 48 uur. Daarom P. aeruginosa geïnduceerde acute longinfectie wordt perfomed op 48 uur van C. albicans doorzettingsvermogen.
P. aeruginosa stam PAO1 is een grotendeels gekenmerkt laboratorium stam omvattende de belangrijke virulentiefactor, type drie-secretiesysteem (T3SS), zoals bij 75% van de klinische isolaten long 15. Om redenen stellingen, PAO1 een relevante stam bij diermodellen van acute longinfectie. Longbeschadiging wordt beoordeeld door middel van alveolo-capillaire permeabiliteit gemeten door eiwit lekken uit het vasculaire compartiment in de luchtweg uitgedrukt als de longschade index. Longbeschadiging neemt toe met het inoculum (figuur 3A). Hier kinetiek van de acute longbeschadiging onderdeel van ons model veroorzaakt door PAO1 stam (5x10 6 CFU / muis) (figuur 3B-3F) alleen rapporteren we zonder voorafgaandeC. albicans- gemedieerde priming. Afhankelijk van spanning en tijdsverloop van het model, de keuze van de initiële P. aeruginosa inoculum wordt in het volgende deel is voorgesteld in Tabel 1.
Vijf muizen per groep gebruikt. Longbeschadiging index (Figuur 3B), bacteriële last in de long (figuur 3C), bacteriële last in de milt, als gevolg van bacteriële verspreiding (figuur 3D), BAL cellulariteit (figuur 3E) en differentiële celgetal (figuur 3F) werden bepaald elke 12 hr. Longbeschadiging was maximaal tussen 24 h en 36 h na infectie (Figuur 3B). Bacteriële last toonde een 1-log CFU / ml per 24 uur (figuur 3C) te verlagen. Cumulatieve bacteriële verspreiding beoordeeld door milt homogenaat kweken verhoogde geplaatst (Figuur 3D). Tenslotte, terwijl BAL cellulariteit bij niet-geïnfecteerde muizen bestaat voornamelijk (90%) of alveolaire macrofagen, in BAL van geïnfecteerde muizen werden neutrofielen op grote schaal geworven en differentiële celgetal toonde 90% neutrofielen en 10% macrofagen en lymfocyten (figuur 3E, 3F).
Figuur 1. Tijdlijn van het Acute Lung Injury Model Explore-Host bemiddelde Interactie tussen C. albicans en P. aeruginosa.
Grafische weergave van de gehele procedure. De eerste stap is het milieu aanpassing van muizen de behuizing faciliteit. De tweede stap C. albicans gemedieerde luchtwegen kolonisatie. Het derde stap is de acute longinfectie gemedieerd door P. aeruginosa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. C. albicans luchtwegen kolonisatie.
(A, B) Muizen worden intranasaal ingeprent met 10 5 CFU C. albicans (stam SC5314). Muizen gewichtstoename tijdens C. albicans-gemedieerde luchtwegkolonisatie (A). Kolonisatie van de luchtwegen kan worden verlengd tot 3-4 dagen met slechts één eerste indruppeling. In een eerdere studie, priming van aangeboren immuniteit vindt plaats tussen 24 en 48 uur. (n = 5 per groep), fout balken geven ± SD. (C, D) muizen worden intranasaal ingedruppeld 5 x 10 5 of 5 x 10 6 CFU C. albicans. Longbeschadiging index (C) beoordeeld door alveolaire capillaire barrière permeabiliteit bij 24 uur. Gewichtstoename (D), uitgedrukt als percentage van het oorspronkelijke gewicht (n = 5 per groep).Error bars geven ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Model van Acute Lung Injury geïnduceerd door P aeruginosa.
(A) C57BL / 6J muizen intranasaal geïnfecteerd met toenemende belasting van P. aeruginosa (van 1 x 10 6 om 5 x 10 7 CFU per muis) (n = 5 per groep), foutbalken geven gemiddelden ± SD. Muizen worden gedood op 24 uur. Longbeschadiging index wordt bepaald door alveolaire-capillaire barrière permeabiliteit die evenredig toeneemt met bacteriële last. Vergelijking van longbeschadiging index verkregen met behulp van de oude methode met longhomogenaten supernatanten (zwarte balken) en de nieuwe gecombineerde methode met bronchoalveolaire lavage supernatanten (grijze balks) (BF) muizen worden intra-nasaal geïnfecteerd met 5 x10 6 CFU per muis. Muizen worden gedood elke 12 tot 48 uur om acuut letsel model kinetiek. Longbeschadiging (B), long bacteriële belasting (C), milt bacteriële belasting (D), bronchoalveolaire lavage (BAL) cellulariteit (E) en BAL differentiële celtelling (F) worden beoordeeld. (n = 5) per groep, foutbalken vertegenwoordigen gemiddelden ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Chirurgische Apparatuur en Intranasale Blaasinstillatie.
(A) Chirurgische apparatuur die nodig is om acuut letsel model en bronchoalveolaire lavage uitvoeren. Hier Tracheale canule (20G) en twee 1 ml injectiespuiten zijn verbonden met een Luer-lock 3-wegklep. Een spuit om water te injecteren in de longen, een aan de bronchoalveolaire vloeistof terug te trekken uit de longen. (B, C) Positie van de muis in de hand naar de intranasale instillatie voeren. In deze foto, de duim onder de kaak zorgt voor een gesloten mond tijdens instillatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Chirurgie en Broncho-alveolaire Lavage.
De kist wordt wijd geopend (A), en ribbenkast wordt zijdelings geopend om schade aan het hart (B) te voorkomen. Volgende bloedafname, is de cervicale gebied ontleed aan de luchtpijp (C) bloot te leggen. Tandzijde wordt gebruikt alshechtdraad en afgelopen achteren luchtpijp (C, D). De trachea wordt vervolgens canule met 20-G canule gecombineerd (D) bevestigd op de spuit en de 3-wegklep. De luchtpijp moet stevig worden vastgezet rond de canule door koppelverkoop een chirurgische knoop met behulp van de hechtdraad op zijn plaats achter de luchtpijp. Tenslotte 500 pi PBS worden langzaam ingedruppeld in de longen en de BAL zachtjes getrokken. (E)-Fluid bijgebracht longen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Minimal ingeprent Burden | Maximale ingeprent Burden | |
| T3SS- | 5 x 10 7 | 1 x 10 8 |
| T3SS + | 5 x 10 6 | 1 x 10 7 |
| T3SS + ExoU + | 5 x 10 | 1 x 10 5 | |
Tabel 1. P. aeruginosa Inocula Gebruikt in acute longinfectie Models.
Stelde optimale intranasale concentraties van inocula tot acute longschade veroorzaken volgens stammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diermodellen, in het bijzonder zoogdieren, bruikbaar complexe mechanismen van gastheer-pathogeen interactie helderen op het gebied van immuniteit. Natuurlijk, de behoefte aan informatie verkregen uitsluitend uit dierlijke modellen moeten onontbeerlijk zijn; Anders moet gebruik van dieren worden vervangen door in vitro modellen. Dit diermodel illustreert het inzicht dat alleen kan worden verschaft door een diermodel aangezien de interactie tussen pathogenen wordt gemedieerd door een multi-component gastheerrespons. Muizen die momenteel worden gebruikt om deze gastheer-pathogeen interacties zijn jonge volwassenen 6 tot 10 weken leeftijd met een volwassen en ongewijzigde immuunrespons. Wanneer wordt gekeken naar de aangeboren immuunrespons worden C57Bl6 / J muizen voorkeur achtergrond. Om een effect van geslacht en hormonale cyclus (met name oestrogeen) op de immuunrespons te voorkomen, mannetjes zijn daarom de beste keuze. Om statistische significantie te bereiken, moeten groepen tenminste 5 personen aan het eind van het experiment, maar zoals door alle dierlijke Experimentatie richtlijnen moet het aantal gebruikte dieren te worden verminderd en verfijnd tot een strikt minimum.
Transport van de fokker die de dieren naar de onderzoeksfaciliteit spanning induceert bij muizen. Het gevolg is een verhoogde afscheiding van inflammatoire cytokines die latere experimenten kan veranderen als de onze. Bovendien, een nieuwe omgeving en de nieuwe "kooi mates" bijdragen aan stress. Bijgevolg moet muizen worden geacclimatiseerd gedurende ten minste zeven dagen voorafgaand aan de studie in hun nieuwe woonomgeving. Deze woonomgeving moet worden gecontroleerd, het verstrekken van standaard voedsel en water ad lib een dag / nacht cyclus, en passende stabiele vochtigheid en temperatuur.
Zowel long- kolonisatie en longinfectie modellen vereisen praktijk en behendigheid. Instillatie kan worden uitgevoerd intra-nasaal of intra-tracheaal. Het laatste is moeilijker en vereist meer kennis via training vanwege een hoog risico anoxische hartstilstand. Inderdaad, de procedure vereist succesvolle intuberen muis in minder dan 15 seconden en daarom verplicht diepere anesthesie. De keuze voor intranasale instillatie is eenvoudiger uit te voeren omdat de toedieningsroute toegankelijk minder risicovol die lichter anesthesie en derhalve beter reproduceerbaar.
Boutoille et al al onze acute longbeschadiging model, in het bijzonder de beoordeling van de longbeschadiging beschreven door middel van het meten van alveolaire-capillaire barrière permeabiliteit met behulp van FITC-gelabelde albumine 16. Om het aantal muizen per experiment verlagen, deze werkwijze aangepast en in combinatie met bronchoalveolaire lavage (BAL). In de studies van Boutoille et al, gebruikten we de vergelijking van de fluorescentie van FITC-gemerkte albumine in de long homogenaat supernatanten en het bloed supernatanten 17.
Om deze vergelijking volledig uit te voeren, zijn hemoglobinegehalte en hematocrietwaarden ook vereist. Deze werkwijze werd aangepast aan allow de gelijktijdige analyse van de gastheer respons door wijden een long homogenisering en beoordeling van longschade en de andere aan spoeling en de studie van gastheer respons. Inderdaad kan BAS vloeistof worden gebruikt voor cytokine niveaus, eiwit secretie en celrecrutering beoordelen. Onze aanpassing geeft meer resultaten uit een dierproef, waardoor de kosten en het vereiste aantal muizen, vooral bij gebruik van knock-out muizen 17 zoals aanbevolen in dierproeven richtlijnen. Bovendien wordt een deel van de long bewaard bij -80 ° C tot totale RNA-extractie en kwantitatieve polymerasekettingreactie of histologische analyse. Vergelijking tussen de voorgaande werkwijze en de nieuwe aangepaste methode gekoppeld BAL geeft vergelijkbare resultaten (figuur 3A) om longschade index beoordelen.
In de studie van Mear et al, volgens dezelfde procedures flowcytometer werd uitgevoerd op BAL-cellen verkregen door centrifugeren van de BAL-vloeistof. Vergelijkbare eennalyses werden uitgevoerd op totale pulmonale cellen van de longen 12. In dit geval, longbeschadiging assessment met FITC-gemerkte albumine kan niet gelijktijdig uitgevoerd, als gevolg van artefacten veroorzaakt door FITC (zelfde kanaal dan groen fluorescentie-eiwit). Daarom, als flowcytometrie nodig, experimenten dienovereenkomstig worden gepland.
De timing van euthanasie kritisch. Een tijdsverloop van de acute longinfectie model over de eerste 72 uur wordt weergegeven figuur 3. In dit model, het toppunt van longbeschadiging en gastheerrespons optreedt tussen 24 en 36 uur (figuur 3). Dus in ons ontwerp het 24 hr eindpunt werd gekozen als een uitlezing voor 3 redenen: ten eerste is het gemakkelijk te organiseren in het laboratorium, tweede, verlies van muizen te voorkomen als gevolg van sterfte tussen 24 en 36 uur, en ten slotte, omdat gastheerreactie was maximaal op dit tijdstip.
De eerste stap van onze interactie studie is de kolonisatie van de luchtwegen met <em> C. albicans. Met behulp van een instillatie van 10 5 CFU per muis, is een 4-daagse persistentie model verkregen zonder longschade. In feite, muizen aangekomen in het tijdsverloop van deze fase. Gewichtstoename is een bruikbare indicator van de afwezigheid van schade overeenkomstig kolonisatie in plaats van infectie. Inderdaad, een verhoogde initiële belasting (meer dan 10 6 CFU per muis) geïnduceerde longbeschadiging (figuur 2C) en een schadelijke gastheer-reactie ver voorbij priming, waarbij muizen verloren gewicht (Figuur 2D). Integendeel, met een kleinere initiële belasting (bijvoorbeeld 10 4 CFU per muis) een persistentie luchtweg model kon niet worden verkregen. Dus, om de waargenomen priming van gastheer immuniteit beschreven door Mear et al 12 verkrijgen, kalibratie van de bijgebracht schimmel last is van cruciaal belang voor het succes en de monitoring van het gewicht curve is een essentiële controle.
Dezelfde precisie vereist voor P. aeruginosa P. induceren aeruginosa wordt sneller uit de luchtwegen verwijderd door een geschikte gastheer-reactie. Met behulp van een te hoge initiële P. aeruginosa overtreft de capaciteiten van afweer of zelfs leidt tot een ongepaste en derleterious reactie resulteert in belasting leidt tot massale acuut letsel en dood wissen van alle verschillen tussen de groepen. De optimale inoculum voor acuut letsel te induceren hangt af van de aanwezigheid van een functionele type 3 secretiesysteem (T3SS) en de productie van exotoxine U, een toxine getransloceerd door de T3SS in de gastheercel cytoplasma. Deze twee stamspecifieke attributen moeten worden overwogen bij de keuze van de initiële bacteriële belasting. Initiële bacteriële lasten worden voorgesteld in dit artikel als voorbeelden van de onder- en bovengrenzen van acute longbeschadiging induceren met T3SS-negatieve of positieve stam, en stammen die exotoxine U of niet (tabel 1). Bij het bestuderen vanbetrokkenheid van T3SS, stam moet worden gekweekt O / N en herleven nieuwe LB medium 3 uur vóór de bereiding van het inoculum voor optimale activiteit van T3SS verkrijgen.
De bepaling van bacteriën en schimmels last 24 uur na P. aeruginosa geïnduceerde longinfectie vereist specifieke overwegingen besproken in deze sectie. Zoals getoond bij muizen geïnfecteerd met 5 x 10 6 CFU T3SS-positieve stam bacteriële belasting in de longen bij 24 HV daalde tot ongeveer 1 log (Figuur 3C). Seriële verdunningen van monsters moeten worden uitgevoerd om 5-log verdunning en uitgeplaat op BCP-agarplaten. Inzake C. albicans in de longen, in 72 uur, schimmelbelasting verminderd tot ongeveer 2 log en monsters moeten worden uitgeplaat op YPD-agar aangevuld met amikacine om kolonie identificatie te vergemakkelijken. Ten slotte kan de bepaling van bacteriële verspreiding worden bepaald door plateren 100 ui bloedmonster op BCP-agar of plateren 100 pl milt homogenates op hetzelfde medium. De twee methoden werden al vergeleken en de milt cultuur lijkt nauwkeuriger te zijn. Inderdaad, de milt is een orgaan dat "filters" volbloed en kunnen "concentreren" en de instandhouding van bacteriën te hebben verspreid naar het bloed. Aldus milt homogenaten weerspiegelen de systemische bacteriële verspreiding tijdens acute longinfectie met een hogere gevoeligheid dan bloed. Bloedmonsters vertegenwoordigen bacteriële verspreiding op een zeer specifieke bepaalde tijd en kan niet echt het fenomeen van bacteriële verspreiding als geheel weerspiegelen. Daarom milt homogenaat kweken voorkeur.
Longbeschadiging index is een gevoelige beoordeling van longbeschadiging gevolg van infectie en / of ongepaste gastheer reactie en het effect van mogelijke geneesmiddelen voor deze componenten. Bovendien, dit in viv o model staat de inzameling van verschillende monsters gastheer reactie te bestuderen. Lung kan worden gebruikt voor RNA-extractie en analysevan gentranscriptie. Lung monsters kunnen ook in paraformaldehyde (PFA) verdere histologische waarnemingen worden geplaatst. BAL vloeistof kan worden gebruikt voor de beoordeling van eiwitsecretie zoals inflammatoire cytokines. Tenslotte, zoals hierboven beschreven protocol kan worden aangepast aan monsters van flowcytometrie analyse.
Ten slotte kan dit protocol worden aangepast aan te modelleren C. albicans- microben interactie betrokken bij ventilator-geassocieerde pneumonie zoals Staphylococcus aureus 18 of Enterobacteriae. Een andere aanpassing zou luchtwegen kolonisatie worden met behulp van bacteriën in plaats van C. albicans bacteriële interactie chronische etterige longziekten zoals bronchiectasieën te modelleren. Daartoe immuun muizen worden gebruikt omdat bacteriële verwijdering in immuun-competente muizen geen blijvende luchtwegkolonisatie toestaan.
Voor instillatie, de positie van de hand houden van het dier is crische. Zoals reeds benadrukt in de vorige paragraaf, bij intranasaal indruppelen van de muis, moet de exploitant dat mond perfect gesloten ophoesten van de oplossing te voorkomen. De duim ondersteunt de kaak en onderhoudt de mond gesloten tijdens de gehele instillatie procedure (Figuur 4B). Dan, met de andere hand wordt de pipet aangebracht op een neusgat (figuur 4C) en de oplossing geleidelijk en voorzichtig ingeprent zonder lucht belvorming te voorkomen. Uiteraard moet indruppelen worden uitgevoerd in een level 2-bioveiligheid kast.
Verzamelen van monsters vereist certifed kleine dieren chirurgische training van de operator. Bij elke stap moeten de monsters op ijs geplaatst om cellysis te voorkomen en te behouden eiwitten van denaturatie. Basic chirurgische instrumenten nodig zijn (Figuur 4A). Zij moeten worden gesteriliseerd in een autoclaaf voor gebruik. Aanbevolen wordt om verschillende chirurgisch instrument sets worden gebruikt abdominal en thoracale chirurgische stappen, het vermijden van kruisbesmetting van long monsters. De verschillende kritische stappen van chirurgische dissectie worden (figuur 5A-5E). Positie van de muis is kritisch; het dier moet vlak worden geïmmobiliseerd op zijn rug hoofd tegenover de operator en recht. Ethanol moet ruim worden gebruikt om prep voordat de eerste incisie om de verspreiding van haar in de monsters en eventuele bacteriële besmetting van de huid te voorkomen. De huid is goed doorbloed en moeten zorgvuldig worden teruggetrokken naar een bloeding (figuur 5A) te vermijden.
Dan is de ribbenkast wordt achterover na een laterale borst incisie waarbij de ribbenkast voortdurend moet worden gehandhaafd in het pincet grip op schade aan het hart en de longen tijdens de incisie te vermijden. Heart Lung en blootgesteld (Figuur 5B). Niet geïnfecteerde longen verschijnen witachtig (Figuur 5B). Dissectie van de cervicale gebied bloot de luchtpijp en een hechting is autoefully geplaatst achter het bovenste luchtpijp (figuur 5C). Cannuleren de luchtpijp moet worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid. Heeft een oversized canule geen gebruik (maximale grootte is 20 G). Een kleine incisie anterior van het vliezig luchtpijp tussen twee kraakbeen ringen maakt het inbrengen van de canule. Als de canule wordt waargenomen door transparantie door de trachea boven de carina (figuur 5D), wordt de hechtdraad strak gebonden rond de trachea vastzetten rond de canule (figuur 5E). De canule is verbonden met een 3-weg male Luer-lock ventiel met 2 spuiten verbonden met de vrouwelijke poorten. Een spuit bevat ijskoude PBS voor bronchoalveolaire lavage; de andere is leeg terug te trekken van de BAL vloeistof. Deze spuiten moeten worden chaged tussen groepen.
Tot slot, priming voorafgaand aan acute longschade model is een relevant en krachtig model te verkennen in vivo-host-gemedieerde interacties tussen pathogenen. Het gebruik van de dierenbelangrijkste beperking en moet zorgvuldig worden afgewogen tegen de informatie te verkrijgen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
- Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
