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Immunology and Infection

El estudio de las comunidades microbianas doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

El estudio de la interacción huésped-patógeno nos permite comprender los mecanismos subyacentes de la patogenicidad durante la infección microbiana. El pronóstico del huésped depende de la participación de una respuesta inmune contra el patógeno adaptado 1. La respuesta inmune es complejo y los resultados de la interacción de los agentes patógenos y varios tipos celulares inmunes o no inmunes 2. Los estudios in vitro no pueden caracterizar estas interacciones y se centran en las interacciones célula-patógeno. Por otra parte, en la vía aérea 3, particularmente en pacientes con enfermedad pulmonar crónica supurativa o en pacientes con ventilación mecánica, comunidades polimicrobianas están presentes y complican la interacción huésped-patógeno. Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans son tanto problema patógenos 4, frecuentemente aislado de muestras traqueobronquiales y asociada a las infecciones severas, especialmente en la unidad de cuidados intensivos 5. Interacciones microbianas tienensido reportados entre estos patógenos in vitro, pero el impacto clínico de estas interacciones aún no está claro 6. Para estudiar las interacciones entre C. Albicans y P. aeruginosa, un modelo murino de C. colonización albicans vías respiratorias, seguido de un P. Se llevó a cabo la infección pulmonar aguda aeruginosa- mediada.

Introduction

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Los modelos animales, especialmente los ratones, se han utilizado ampliamente para explorar la respuesta inmune contra los patógenos. Aunque la inmunidad innata y adquirida difirió entre roedores y humanos 7, la facilidad en la reproducción y el desarrollo de knockouts de numerosos genes, hacen que los ratones un modelo excelente para estudiar las respuestas inmunes 8. La respuesta inmune es complejo y resulta de la interacción de un patógeno, la flora residente microbianas y varios inmunes (linfocitos, neutrófilos, macrófagos) y no inmunes (células epiteliales, células endoteliales) tipos celulares 2. Los estudios in vitro no permiten la observación de estas interacciones complejas y se centran principalmente en las interacciones únicas células de patógenos. Mientras que los modelos animales se deben utilizar con precaución y limitan a cuestiones muy específicas y relevantes, modelos de ratón proporcionan una buena visión de la respuesta inmune de mamíferos in vivo y pueden abordar partes de preguntas clínicas importantes 7.

6. Si bien lo que constituye un microbioma "normal" de las vías respiratorias que queda por determinar, las comunidades residentes son frecuentemente polimicrobiana, y se originan a partir de diversas fuentes ecológicas. Los pacientes con enfermedad supurativa crónica pulmonar (fibrosis quística, bronchectasis) o pacientes con ventilación mecánica exhiben una determinada flora debido a la colonización de las vías respiratorias por microorganismos del medio ambiente adquiridos-9. Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans son tanto problema patógenos 5, aislado con frecuencia juntos a partir de muestras traqueobronquiales , y responsable de la infección oportunista grave en estos pacientes, sobre todo en la unidad de cuidados intensivos (UCI) 4.

El aislamiento de estos microorganismos durante la neumonía aguda en los resultados de la UCI en el tratamiento anti-microbiano contra P. aeruginosa but levaduras generalmente no son considerados patógenos en este sitio 5. interacciones in vitro entre P. aeruginosa y C. albicans han sido informado ampliamente y mostraron que estos microorganismos pueden afectar el crecimiento y la supervivencia de uno al otro pero los estudios no pudieron concluir si la presencia de C. albicans es perjudicial o beneficioso para el host 10. Se desarrollaron modelos de ratón para abordar esta relevancia de P. aeruginosa y C. albicans in vivo, pero la interacción entre microorganismos no era el punto clave. De hecho, se estableció el modelo para evaluar la participación de C. albicans en la respuesta inmune del huésped, y el resultado.

Un modelo anterior establecido por Roux et al ya utilizado una colonización inicial con C. albicans seguido por una infección pulmonar aguda inducida por P. aeruginosa. Utilizando su modelo, los autores encontraron un papel deletéreo de prior C. albicans colonización 11. Sin embargo Roux et al utilizarse una alta carga de C. albicans en su modelo con 2 x 10 6 UFC / ratón durante 3 días consecutivos. Hemos establecido un modelo de 4 días de C. albicans colonización de las vías respiratorias, o al menos persistencia sin lesión pulmonar, en este modelo C. albicans fue recuperado hasta 4 días después de una sola instilación de 10 5 UFC por ratón (Figura 2B) 12,13. Después de 4 días, no se observó evidencia de reclutamiento de células inflamatorias, la producción de citoquinas inflamatorias ni daño epitelial. En 24 a 48 h, en la presencia de pico de C. albicans, aunque se observó una respuesta inmune innata celular y citoquinas, no hubo evidencia de la lesión pulmonar. Sorprendentemente, los ratones de este modo colonizados con C. albicans 48 h antes de la instilación intranasal de P. aeruginosa había atenuado la infección en comparación con ratones con P. infección aeruginosa solo. yondeed, ratones mostraron lesión pulmonar menor y la disminución de la carga bacteriana 12,13.

Varias hipótesis podrían explicar este efecto beneficioso de la colonización previa con C. albicans en P. aeruginosa mediada por infección pulmonar aguda. En primer lugar, la diafonía entre especies que implica cada microorganismos sistemas de detección de quórum, el P. basada en homoserinelactone sistema aeruginosa y la basada en farnesol C. sistema albicans, fueron evaluados. En segundo lugar, C. Se estudió albicans actuando como un objetivo "señuelo" para P. aeruginosa desviar el patógeno a partir de células epiteliales del pulmón. Ambas hipótesis fueron invalidadas (datos no publicados). La tercera hipótesis es la de un "cebado" del sistema inmune innato por C. albicans responsable de una respuesta innata posterior mejorada contra P. aeruginosa. Se confirmó Esta última hipótesis. De hecho C. albicans colonización condujo a un cebado de la inmunidad innata through IL-22, secretada principalmente por células linfoides innatas, lo que resulta en un aumento de la eliminación de bacterias y reduce la lesión pulmonar 12.

En conclusión, el anfitrión es un actor central en la interacción entre los microorganismos que modulan la respuesta inmune innata y que implican diferentes tipos de células inflamatorias. Si bien estas interacciones inmunológicas complejas pueden ser disecados in vitro las hipótesis iniciales sólo pueden ser proporcionados por apropiado en modelos in vivo. El siguiente protocolo proporciona un ejemplo de estudio in vivo de la interacción huésped-patógeno mediada que se puede adaptar a otros microorganismos.

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Protocol

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El comité regional de ética regionales para los experimentos con animales ha aprobado este método, de acuerdo con el cuidado y el uso nacional e internacional de los animales en las directrices de investigación en investigación.

1. Recogida de muestras

  1. Almacenamiento de las muestras
    1. Reunir todas las muestras e inmediatamente almacenar a - 20 ° C o en hielo hasta su almacenamiento en el congelador para evitar el deterioro. Coloque fosfato estéril (PBS) en el hielo para mejorar lavados bronco-alveolar (BAL) rendimiento.
  2. Cirugía
    1. Esterilizar todo el equipo quirúrgico utilizando un autoclave.
      NOTA: Si es posible, se recomienda el uso de dos conjuntos diferentes de instrumentos para los pasos abdominales y torácicas para evitar la contaminación cruzada. Equipos de disección requerida se detalla en la figura 4A

2. Los ratones, bacterias y levaduras Cepas

  1. Ratones de la vivienda en cumplimiento con el uso local de los animales en la redirectrices del comité de búsqueda en un estante ventilado sin exceder 5 ratones por jaula, con comida y agua ad lib, en una instalación de vivienda nivel de bioseguridad 2, debido a la utilización de nivel de bioseguridad 2 microorganismos: P. aeruginosa y C. albicans.
  2. Mantener las cepas bacterianas a -80 ° C en 40% de medio de glicerol.
    1. Añadir bacterias directamente desde el almacén congelado en el tubo de cultivo que contiene 3 ml de caldo Luria-Bertani estéril usando un asa de siembra 10 l. Deja O / N a 37 ° C con agitación orbital (400 rpm) el día antes de la instilación.
    2. Cosecha bacterias por centrifugación a 2000 xg durante 5 min.
    3. Aspirar el sobrenadante en una eliminación de residuos de riesgo biológico apropiado cerrado. Observe pellet adherente blanco en el fondo del tubo de cultivo.
    4. Lavar y suspender el sedimento usando 5 ml de PBS.
    5. Repita los pasos 2.2.2 al 2.2.3 por segunda vez para realizar un segundo lavado.
    6. Resuspender las bacterias sedimentadas utilizando 1 ml de PBSy breve agitación en vórtex.
    7. Determinar la densidad de inóculo mediante densitómetro óptica a 600 nm utilizando un medidor de densidad óptica. Una densidad de 0,9 corresponde a 10 9 CFU / ml para PAO1, diluir en consecuencia.
      NOTA: Este resultado tiene que ser obtenido para cada cepa utilizada mediante la determinación de la densidad de diluciones sucesivas de un inóculo calibrado.
    8. Verifique el inóculo por diluciones logarítmicas de serie y la placa 100 l de cada dilución en agar púrpura de bromocresol (BCP) placas y cultivo O / N. Administrar cada ratón por vía intranasal 50 l de la solución que contiene 1 x 08 al 02 10 8 x10 UFC por ml (5 x 10 6 a 1 x10 7 UFC por ratón).
  3. Uso C. albicans SC5314 como una cepa de referencia. Conserve la cepa en el 40% de medio de glicerol a -80 ° C.
    1. Suplemento caldo de peptona de levadura-dextrosa-con 0,015% de amikacina para evitar la contaminación bacteriana y facilitar aún más la cuenta.
    2. Añadir la levadura utilizando 10 y# 181; l bucle de inoculación en preparados YPD caldo suplementado con amikacina O / N a 37 ° C.
    3. Cosecha de levadura por centrifugación a 2000 xg durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante en una eliminación de residuos bioharzard apropiado. Blanco pellet adherente debe ser observada en la parte inferior del tubo de cultivo.
    5. Lavar y suspender las bacterias sedimentadas utilizando 5 ml de PBS y breve agitación en vórtex.
    6. Repita los pasos 2.2.2 al 2.2.3 por segunda vez para realizar un segundo lavado.
    7. Resuspender el precipitado usando 1 ml de PBS y breve agitación en vórtex.
    8. Determinar el tamaño del inóculo mediante el recuento en un hematocitómetro Mallassez utilizando un microscopio estándar a un aumento de 40x.
      NOTA: Concentración (en UFC / ml) se obtiene mediante la siguiente fórmula: (número de levadura x 10 5) / (número de rectángulos de cuadrícula contados en el hematocitómetro Mallassez).
    9. Verificar por dilución logarítmica serie a 10 -5 y -6 10 para confirmar que la solución contiene 2 x 10 6 CFU / ml.
    10. Placa en placas de agar YPD suplementado con 0.015% amikacina.

3. La colonización por C. Airways albicans

NOTA: Después de adaptación ambiental, los ratones se pesan dos veces al día.

  1. Bajo una campana de extracción, depósito 500 l de sevoflurano en un 4 cm x 4 cm de gasa (técnica de soltar abierto) 14.
    1. Inmediatamente colocar la gasa en el suelo de una cámara de aproximadamente 750 ml de inducción. Inmediatamente colocar una plataforma elevada de malla por encima de la gasa para evitar el contacto directo entre el animal y la gasa.
    2. Cierre tapa hermética y esperar 1 a 2 minutos para permitir la difusión de sevoflurano en la cámara.
    3. Transferir el ratón de la jaula de malla de la plataforma y cierre la tapa. Anestesia ligera con respiración espontánea conservada debería lograrse en el 30 a 45 segundos.
    4. Monitor para hipotonía mediante la observación de la pérdida del reflejo de enderezamiento momento en el que el ratón se puede quitar fesde la caja y inculcado.
  2. Instilación intranasal (se puede realizar en 10 segundos por un operador entrenado).
    1. Mantenga el ratón con una mano situada en su parte posterior en posición vertical (Figura 4B).
    2. Utilizando el dedo índice, apoyar la cabeza y usar el pulgar para mantener la mandíbula cerrada para evitar la expectoración (Figura 4C).
    3. Como se describe en el paso 2.3.8, asegúrese de que el preparado C. solución albicans contiene 2 x 10 6 UFC por ml durante 50 l volumen inculcado.
      NOTA: El segundo punto crítico es el volumen instilado. Un volumen inferior a 50 l podrían dar lugar a una colonización insuficiente o la instilación no homogénea de las vías respiratorias, un volumen más grande puede provocar ahogamiento / asfixia y la muerte.
    4. Inculcar el ratón por vía intranasal por acercarse a la pipeta para las fosas nasales.
    5. Pipetear una formando una burbuja que contiene la solución en las fosas nasales gota 50 l, posteriormente inhalado por el spontaneously ratón respiración.
    6. Place ratón en un área de recuperación (por ejemplo, una jaula grande desnudo bien aireado con una lámpara de calentamiento overhead). Los ratones debe ser monitoreado hasta completar despertar. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal y reflejo de enderezamiento. En este punto, el ratón puede ser devuelto a una jaula normal de la vivienda.

4. P. aeruginosa inducida agudo de pulmón Infección

NOTA: Los ratones se pesan durante los cuatro días siguientes. Normalmente, los ratones aumentan de peso durante la C. la colonización de las vías respiratorias mediada por albicans (Figura 2A).

  1. Preparar la suspensión que contiene P. aeruginosa el día de la instilación después de O / N de crecimiento (sección 2.2).
  2. Anestesiar brevemente utilizando inhalado sevoflurano como se describe anteriormente (sección 3.1).
    NOTA: Para llevar a cabo la infección pulmonar aguda, se recomienda la carga bacteriana se sugiere enTabla 1.
  3. Inculcar el ratón como se describe anteriormente (sección 3.2), con especial atención a la recuperación después de la instilación.

5. Medida de pulmón Índice de Lesiones

  1. Preparar una solución que contiene albúmina marcada con FITC. Inyectar esta solución 2 hr antes de la eutanasia de los animales.
    1. Pesar 0,2 mg de albúmina-FITC con el equipo apropiado.
    2. Añadir 0,2 mg en 1 ml de PBS. Vórtice brevemente. Si no se utiliza inmediatamente, coloque la solución en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz ambiental.
    3. Inyectar por vía intraperitoneal 200 l de solución de albúmina marcada con FITC a cada ratón.
  2. Eutanasia
    1. Pesar los ratones durante el último dato de peso.
    2. La eutanasia a un solo ratón, de acuerdo con el uso local de los animales en las directrices del comité de investigación utilizando una inyección intraperitoneal de una sobredosis letal de pentobarbital: 300 l de 5,47% pentobarbital.
    3. Retire del ratón de la jaula y recibe linyección Ethal por el operador.
    4. Después de la inyección, transferir el ratón solamente a otra jaula, oculto a los otros animales. Observe el ratón hasta ausencia de movimiento. Confirmar la muerte es por ausencia de movimiento, movimiento particular respiratoria, falta de pulso.
    5. Realizar colección quirúrgica de muestras en animales muertos, por lo tanto, sin anestesia ni analgésicos.
  3. Quirúrgica recogida de muestras: Etapa Torácica.
    NOTA: Para mantener condiciones estériles, se realiza toda la cirugía utilizando material estéril en un entorno de nivel de bioseguridad 2.
    1. Aplicar etanol a la piel. Realice una incisión en la piel en la línea media del esternón hasta mediados abdomen con unas tijeras. De incisión en la línea media a lo largo de la caja torácica a cada lado. Doble hacia atrás la piel a cada lado del tórax para visualizar la caja torácica.
    2. Realizar una incisión vertical de la caja torácica a cada lado subiendo hacia las clavículas con el fin de ser capaz de reclinarse toda la pared anterior del tórax con la popaum permitiendo la visualización perfecta de corazón y los pulmones (Figura 5A, 5B).
    3. Recoger la sangre utilizando una jeringa pre-heparined perforando el corazón próxima a la arteria interventricular. Retirar un mínimo de 500 l para obtener al menos 100 l de plasma. Coloque la muestra de sangre en el hielo.
    4. Realice una incisión cervical línea media para visualizar la tráquea (Figura 5B y 5C). Diseccionar cuidadosamente la fascia alrededor de la tráquea. Coloque una sutura detrás de la tráquea (Figura 5C y 5D). Posteriormente la sutura se cerrará alrededor de la aguja canulando para garantizar un lavado adecuado.
    5. Cateterizar la tráquea utilizando la aguja 20-G modificado sonda (Figura 5D y 4A). Haga un nudo quirúrgico alrededor de la tráquea canulado con la sutura colocado previamente.
    6. Para realizar lavados broncoalveolares (BAL), suave y progresivamente inyectar y extraer 500 l de helado de PBS en / de pulmón. Coloque la muestra en la ice para evitar la lisis celular.
    7. Repita el paso 5.3.6, 3 veces para obtener un total de 1.500 muestras de l fluido BAL y piscina de lavado en un tubo de centrífuga de 2 ml (Figura 5E).
    8. Retire los pulmones desde el pecho. Coloque un segmento pulmonar (tamaño debe corresponder a la mitad de un pulmón o un lóbulo) en 1,5 ml tubo de centrífuga y almacenar rápidamente a - 80 ° C.
    9. Coloque un segmento de pulmón en un tubo de hemólisis previamente pesado que contiene PBS para determinar la carga bacteriana y colocarlo en hielo.
  4. Quirúrgica recogida de muestras: Etapa abdominal.
    1. Realizar otra incisión en el lado izquierdo del abdomen. Observar el bazo a través del peritoneo.
    2. Retirar el bazo y colocar en un segundo tubo de hemólisis que contiene 1 ml de PBS y el lugar en el hielo.
  5. Índice de lesión pulmonar
    NOTA: permeabilidad de la membrana alveolar-capilar se evaluó midiendo marcado con FITC-albúmina de fuga desde el compartimiento vascular a la alveolar-interstcompartimento itial.
    1. Centrifugar la muestra de sangre y el fluido BAL durante 10 min a 1500 x g. Reunir los sobrenadantes en nuevos tubos de centrífuga. Los pellets corresponden a las células plasmáticas o BAL reclutados y deben ser colocados en hielo.
    2. Añadir 100 l de cada sobrenadante de la sangre (plasma, amarillo) o BAL sobrenadante a una placa de 96 pocillos transparente (300 L pozos). Coloque una lámina en la placa si no se utiliza de inmediato.
    3. Medir los niveles de fluorescencia en el plasma y sobrenadantes BAL utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación, 487 nm; emisión, 520 nm).
    4. Determinar el índice de lesión pulmonar mediante el cálculo de la relación de fluorescencia [(BAL sobrenadante sobrenadante / sangre) x 100].
  6. Lavado broncoalveolar (BAL) recuento celular diferencial.
    NOTA: Utilice el sedimento celular obtenido de la centrifugación de LBA en el paso 5.5.1.
    1. Si es necesario, utilice tampón de lisis de los glóbulos rojos. Añadir 500 l de tampón de lisis de los glóbulos rojos en el tubo de centrífuga que contiene el cell pellet. Vórtice brevemente y dejar 10 minutos en hielo. Añadir 500 l de PBS para detener la lisis de los glóbulos rojos.
    2. Cosecha células por centrifugación durante 10 min a 1500 x g. Aspirar el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 1 ml de PBS estéril. Enumerar las células en un hematocitómetro Mallassez. Usando un hemocitómetro para contar las células. Concéntrese células en un portaobjetos con una citospina.
    3. Las células de la mancha utilizando kit de coloración que permite la identificación y el recuento de células (macrófagos, linfocitos, neutrófilos).
  7. La carga bacteriana de pulmón y difusión bacteriana
    NOTA: Para evaluar la carga bacteriana pulmonar y diseminación bacteriana, los pulmones y el bazo fueron recogidos y almacenados en tubos de hemólisis previamente pesados ​​que contienen 1 ml de PBS (etapa 5.3.9), respectivamente.
    1. Pesar tubos de hemólisis que contienen 1 ml de PBS y, o bien los pulmones o bazo. Homogeneizar las muestras con un homogeneizador de tejidos para obtener homogeneizado de pulmón y los homogeneizados de bazo.
    2. Depósito 100 l de homo tejidogenates en tubos de centrífuga que contiene 900 l de PBS estéril para obtener diluciones logarítmicas seriadas.
    3. Placa de las dos últimas muestras diluidas apropiadas (10 -3 y 10 -2) a cada BCP-agar para P. aeruginosa o agar YPD-amikacina suplementada para C. albicans pulmonar y determinación carga bazo.
    4. Incubar las placas O / N a 37 ° C. El día siguiente, enumerar las colonias en las placas.
    5. Índice el resultado al peso del pulmón para obtener un CFU por gramo de pulmón. Pulmón tamaño de las muestras no son los mismos, los resultados deben ser expresados ​​en UFC por gramo de pulmón.
      Fórmula para el índice es: [UFC] x [peso del tubo de hemólisis y de pulmón] - [peso del tubo de hemólisis].

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Representative Results

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Como se ha visto anteriormente en la descripción del protocolo, el experimento necesita 5 días para completar (Figura 1: línea de tiempo experimento). Un operador se solicita durante todo el plazo del experimento y puede manejar los procesos hasta un máximo de 10 ratones. Si se requieren más animales, se necesitan dos personas en particular para la recogida de muestras quirúrgica. De hecho todas las muestras deben recogerse en menos de 2 horas para evitar una mayor fuga de alveolocapilar pasiva de albúmina marcada con FITC en los últimos ratones.

El primer paso es la preparación de C. albicans inóculo y la instilación intra-nasal para obtener la colonización de las vías respiratorias por C. albicans. Un modelo de 4 días, la persistencia se obtiene mediante instilación intranasal de 5 x 10 5 UFC de C. albicans por ratón (Figura 2B). Durante estos 4 días, los ratones aumentan de peso (Figura 2A) y la instilación de 5x10 5 UFC no induce llesiones ung (Figura 2C). Aunque C. albicans puede persistir hasta 4 días en este modelo, la carga disminuye después de 48 horas. Por lo tanto, P. infección pulmonar aguda inducida aeruginosa se ​​desempeñasen a las 48 h de C. persistencia albicans.

P. aeruginosa cepa PAO1 es una cepa de laboratorio ampliamente caracterizado comprende el principal factor de virulencia, el tipo de sistema de tres secreción (SST3), como en el 75% de los pulmones aislados clínicos 15. Por razones de tesis, PAO1 es una cepa relevante en modelos animales de infección pulmonar aguda. La lesión pulmonar se evalúa a través alveolo-capilar permeabilidad medida por fuga de proteína a partir del compartimento vascular en la vía aérea expresada como el índice de lesiones pulmonares. Aumenta la lesión pulmonar con el inóculo (Figura 3A). Aquí mostramos cinética de la componente de la lesión pulmonar aguda de nuestro modelo inducida por la cepa PAO1 (5x10 6 UFC / ratón) (Figura 3B-3F) por sí sola sin necesidad de previoC. albicans- cebado mediada. Dependiendo de la cepa y el tiempo de transcurso del modelo, la elección de inicial P. aeruginosa inóculo se discute en la siguiente sección y se sugiere en la Tabla 1.

Se utilizaron cinco ratones por grupo. Índice de lesión pulmonar (Figura 3B), la carga bacteriana en el pulmón (Figura 3C), la carga bacteriana en el bazo, lo que refleja diseminación bacteriana (Figura 3D), BAL celularidad (Figura 3E) y el recuento diferencial de células (Figura 3F) se determinaron cada 12 hora La lesión pulmonar fue máxima entre las 24 horas y 36 horas después de la infección (Figura 3B). Carga bacteriana mostró una 1-log CFU / ml disminuir cada 24 horas (Figura 3C). Diseminación bacteriana acumulada evaluado por las culturas de homogeneizado de bazo aumenta cada día (Figura 3D). Por último, aunque BAL celularidad en los ratones no infectados se compone principalmente (90%) omacrófagos alveolares f, en BAL de ratones infectados, los neutrófilos fueron ampliamente reclutados y diferencial de células mostraron 90% de neutrófilos y 10% de macrófagos y linfocitos (Figura 3E, 3F).

Figura 1
Figura 1. Cronología del Modelo de la lesión pulmonar aguda para explorar la interacción anfitrión mediada entre C. albicans y P. aeruginosa.
Representación gráfica de todo el procedimiento. El primer paso es la adaptación ambiental de los ratones de la instalación de la vivienda. El segundo paso es C. albicans mediada colonización de las vías respiratorias. Por último, el tercer paso es la infección pulmonar aguda mediada por P. aeruginosa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2. C. albicans vía aérea Colonización.
(A, B) Los ratones se infundieron por vía intranasal con 10 5 CFU C. albicans (SC5314 cepa). Los ratones aumentan de peso durante la C. la colonización de las vías respiratorias mediada por albicans (A). La colonización de la vía aérea puede ser prolongada hasta 3-4 días con una sola instilación inicial. En un estudio previo, el cebado de la inmunidad innata se produce entre 24 y 48 horas. (n = 5 por grupo), barras de error representan las medias ± SD. (C, D) los ratones se inculcan intranasal 5 x 10 5 o 5 x 10 6 UFC de C. albicans. Índice de pulmón lesiones (C) evaluada por alveolar barrera de permeabilidad capilar a las 24 horas. El aumento de peso (D), expresada en por ciento del peso inicial (n = 5 por grupo).Las barras de error representan las medias ± SD. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Modelo de lesión pulmonar aguda inducida por P. aeruginosa.
(A) ratones C57BL / 6J se intra-nasal infectado con el aumento de las cargas de P. aeruginosa (de 1 × 10 6 a 5 x 10 7 UFC por ratón) (n = 5 por grupo), barras de error representan las medias ± SD. Los ratones son sacrificados a las 24 horas. Índice de lesión pulmonar se evaluó por alveolar-capilar permeabilidad de la barrera que aumenta proporcionalmente con la carga bacteriana. Comparación del índice de lesión pulmonar obtenida mediante el método de edad con el pulmón homogeneizado sobrenadantes (barras negras) y nuevo método combinado utilizando sobrenadantes de lavado broncoalveolar (barra griss) (BF) ratones son por vía intranasal infectado con 5 x 10 6 UFC por ratón. Los ratones son sacrificados cada 12 a 48 horas a la cinética modelo lesiones agudas. La lesión pulmonar (B), la carga bacteriana de pulmón (C), la carga bacteriana bazo (D), el lavado broncoalveolar (BAL) celularidad (E) y recuento diferencial de células BAL (F) también se evaluó. (n = 5) por grupo, barras de error representan las medias ± SD. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Equipo quirúrgico y instilación intranasal.
(A)   Equipo quirúrgico necesario para realizar modelo de lesión aguda y lavado broncoalveolar. Aquí cánula traqueal (20G) y las dos jeringas de 1 ml se conectan a un Luer-lock válvula de 3 vías. Una jeringa para inyectar agua en los pulmones, uno para sacar el líquido broncoalveolar a salir de los pulmones. (B, C)   Posición del ratón en la mano para realizar la instilación intranasal. En esta foto, el pulgar debajo de la mandíbula asegura una boca cerrada durante la instilación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Cirugía y lavado broncoalveolar.
El pecho es ampliamente abierto (A), y la caja torácica se abre lateralmente para evitar lesiones en el corazón (B). Tras la recogida de sangre, el área cervical se diseca para exponer la tráquea (C). El hilo dental se utiliza como unasutura y se pasa detrás de la tráquea (C, D). La tráquea se canula a continuación, con la cánula 20-G combinado (D) montado en la jeringa y la válvula de 3 vías. La tráquea debe ser fijado firmemente alrededor de la cánula atando un nudo quirúrgico utilizando la sutura en su lugar detrás de la tráquea. Finalmente 500 l de PBS se inculcan con suavidad en los pulmones y luego el BAL se dibuja suavemente. (E) pulmones Fluid-inculcado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Carga mínima inculcado Maximal inculcado Carga
T3SS- 5 x 10 7 1 x 10 8
SST3 + 5 x 10 6 1 x 10 7
SST3 + exoU + 5 x 10 1 x 10 5

Tabla 1. P. aeruginosa inóculos usados ​​en el infarto agudo de pulmón modelos de infección.
Concentraciones intranasales óptimos sugeridos de inóculos para inducir la lesión pulmonar aguda según las cepas.

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Discussion

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Los modelos animales, en particular los mamíferos, son útiles para dilucidar los mecanismos complejos de interacción huésped-patógeno en los campos de la inmunidad. Por supuesto, la necesidad de información sólo puede obtenerse de modelos animales deben ser esenciales; de lo contrario, el uso de animales debe ser reemplazado por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra la idea de que sólo puede ser proporcionada por un modelo animal ya que la interacción entre los agentes patógenos está mediado por una respuesta del huésped multi-componente. Los ratones utilizados en la actualidad para estudiar esta interacción huésped-patógeno son adultos jóvenes de 6 a 10 semanas, con una respuesta inmune madura y sin alteraciones. Al centrarse en la respuesta inmune innata, se prefieren los ratones fondo C57Bl6 / J. Para evitar un efecto del sexo y el ciclo hormonal (particularmente de estrógeno) sobre la respuesta inmune, los machos son, por tanto, la mejor opción. Para alcanzar significación estadística, los grupos deben tener al menos 5 individuos al final del experimento, pero según lo sugerido por todos los animales experimendirectrices tación, el número de animales utilizados deben reducirse y refinado a lo estrictamente necesario.

Transporte desde el criador de proporcionar a los animales a las instalaciones de investigación induce estrés en ratones. La consecuencia es un aumento de la secreción de citoquinas inflamatorias que pueden alterar los experimentos posteriores como la nuestra. Por otra parte, un nuevo ambiente y nuevos "compañeros de jaula" contribuyen al estrés. En consecuencia, los ratones deben ser aclimatados durante al menos siete días antes de estudiar en su nuevo entorno de la vivienda. Este entorno de la vivienda tiene que ser controlado, el suministro de alimentos estándar y agua ad-lib, un ciclo de día / noche, humedad estable y adecuada y la temperatura.

Tanto la colonización pulmonar y modelos de infección de pulmón requieren práctica y destreza. La instilación se puede realizar por vía intranasal o intra-traqueal. Este último es más difícil y requiere una mayor experiencia a través de la formación debido a un alto riesgo de paro cardiaco anóxica. De hecho, el procedure requiere de intubar con éxito un ratón en menos de 15 segundos y una anestesia más profunda, por lo tanto requeridos. Nuestra elección de la instilación intra-nasal es más fácil de realizar ya que la vía de administración es accesible, menos arriesgado que requiere anestesia más ligero y por lo tanto es más reproducible.

Boutoille et al ya descrito nuestro modelo de lesión pulmonar aguda, en particular la evaluación de la lesión pulmonar a través de la medición de alvéolo-capilar permeabilidad de la barrera usando albúmina marcada con FITC 16. Para reducir el número de ratones por experimento, este método fue adaptado y acoplado con lavado broncoalveolar (BAL). En los estudios de Boutoille et al, se utilizó la comparación entre la fluorescencia de la albúmina marcada con FITC en los sobrenadantes de homogeneizado de pulmón y los sobrenadantes de sangre 17.

Para realizar plenamente esta comparación, también se requieren niveles de hemoglobina y hematocrito. Este método fue adaptado en Allow el análisis concomitante de respuesta del huésped al dedicar un pulmón a la homogeneización y la evaluación de la lesión pulmonar y el otro para el lavado y el estudio de respuesta del huésped. De hecho, el fluido BAL se puede utilizar para evaluar los niveles de citoquinas, la secreción de proteínas y el reclutamiento de células. Nuestra adaptación ofrece más resultados desde un único experimento con animales, lo que reduce el costo y el número necesario de los ratones, especialmente cuando se utilizan los ratones knock-out 17 como se recomienda en las directrices de experimentación animal. Por otra parte, una parte del pulmón se mantiene a -80 ° C para llevar a cabo la extracción de RNA total y la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa o análisis histológico. Comparación entre el método anterior y el nuevo método adaptado junto con BAL muestra resultados comparables (Figura 3A) para evaluar índice de lesión pulmonar.

En el estudio de Mear et al, utilizando los mismos procedimientos, citómetro de flujo análisis se realizó en células de BAL obtenidas por centrifugación de fluido BAL. Un similaresnalyses se realizaron en células pulmonares totales de los pulmones 12. En este caso, la evaluación de la lesión pulmonar con albúmina marcada con FITC no se puede realizar de forma concomitante, debido a los artefactos inducidos por FITC (mismo canal que la proteína de fluorescencia verde). Por lo tanto, si se requiere citometría de flujo, los experimentos deben planificarse en consecuencia.

El momento de la eutanasia es crítica. Una evolución en el tiempo del modelo de infección pulmonar aguda durante las primeras 72 horas se presenta la figura 3. En este modelo, el colmo de la lesión pulmonar y la respuesta del huésped se produce entre 24 y 36 horas (Figura 3). Así, en nuestro diseño del punto final de las 24 horas fue elegida como una lectura por 3 razones: primero, es fácil de organizar en el laboratorio, en segundo lugar, para evitar la pérdida de los ratones debido a la mortalidad entre 24 y 36 horas, y por último, porque respuesta del huésped fue máxima en este punto de tiempo.

El primer paso de nuestro estudio de interacción es la colonización de la vía aérea con <em> C. albicans. El uso de una instilación de 10 5 UFC por ratón, un modelo de persistencia 4-día se obtiene sin ninguna lesión pulmonar. De hecho, los ratones ganaron peso durante el transcurso de esta fase. El aumento de peso es un indicador útil de la ausencia de lesión en línea con la colonización en oposición a la infección. De hecho, un aumento de la carga inicial (más de 10 6 UFC por ratón) lesión pulmonar inducida (Figura 2C) y una serie de respuesta nociva mucho más allá de cebado, en el que los ratones de casos perdieron peso (Figura 2D). Por el contrario, usando una carga inicial más pequeño (por ejemplo 10 4 UFC por ratón) un modelo de persistencia de las vías respiratorias no se pudo obtener. Por lo tanto, para obtener el cebado observado de la inmunidad del huésped descrito por Mear et al 12, la calibración de la carga fúngica inculcado es crítico para el éxito y el seguimiento de la curva de peso es un control clave.

Se requiere la misma precisión para P. aeruginosa y P. aeruginosa se ​​elimina rápidamente de las vías respiratorias por un host-respuesta apropiada. El uso de un excesivamente alta P. inicial aeruginosa supera las capacidades de defensa del huésped o incluso induce una respuesta inapropiada y derleterious resultante de la carga conduce a la lesión aguda y la muerte masiva de borrar todas las diferencias entre los grupos. El inóculo óptima para inducir lesión aguda depende de la presencia de un sistema funcional de tipo 3-secreción (T3SS) y la producción de exotoxina U, una toxina translocado por el T3SS en el citoplasma de la célula huésped. Estos dos atributos cepa específica tienen que ser considerados en la elección de la carga bacteriana inicial. Cargas bacterianas iniciales se sugieren en este artículo como ejemplos de límites inferior y superior para inducir la lesión pulmonar aguda con T3SS negativo o tensión positiva y cepas productoras de exotoxina U o no (Tabla 1). Cuando se estudiaparticipación de T3SS, cepa tiene que ser cultivadas O / N y revivió con nuevo medio LB 3 h antes de la preparación del inóculo para obtener una actividad óptima de T3SS.

La determinación de la carga bacteriana y fúngica 24 hr después de P. infección pulmonar aeruginosa inducida requiere consideraciones específicas discutidas en esta sección. De hecho, como se muestra, cuando los ratones se infectaron con 5 x 10 6 CFU cepa T3SS-positivo, la carga bacteriana en los pulmones al 24 hr voluntad disminuyó a aproximadamente 1 log (Figura 3C). Diluciones seriadas de las muestras deben ser realizados hasta la dilución 5-log y se sembraron en placas de agar-BCP. En cuanto a C. albicans en los pulmones, a las 72 horas, la carga de hongos se reduce a aproximadamente 2 log y las muestras deben ser chapada en YPD-agar suplementado con amikacina para facilitar la identificación de colonias. Finalmente, la determinación de diseminación bacteriana se puede evaluar cultivando en placa 100 l de muestra de sangre en BCP-agar o en placas 100 l de bazo homogenates en el mismo medio. Los dos métodos ya se han comparado y la cultura bazo parece ser más preciso. De hecho, el bazo es un órgano que "filtros" de sangre entera y puede "concentrarse" y conservar bacterias que difunden en la sangre. Por lo tanto, homogeneizados de bazo reflejan la diseminación bacteriana sistémica durante la infección pulmonar aguda con una sensibilidad superior a la sangre. Las muestras de sangre representan diseminación bacteriana en un momento dado muy específico y pueden no reflejar realmente el fenómeno de la diseminación bacteriana como un todo. Por lo tanto se prefieren las culturas de homogeneizado de bazo.

Índice de lesión de pulmón es una evaluación sensible de la lesión pulmonar resultante de la infección y / o respuesta del huésped apropiado y el efecto de la terapéutica potenciales en estos componentes. Además, este modelo o en viv permite la recogida de varias muestras diferentes para estudiar la respuesta de acogida. De pulmón se puede utilizar para la extracción y análisis de ARNde la transcripción génica. Las muestras de pulmón también se pueden colocar en paraformaldehído (PFA) para nuevas observaciones histológicas. Fluido BAL se puede utilizar para la evaluación de la secreción de proteínas tales como citoquinas inflamatorias. Finalmente, como se discutió anteriormente el protocolo puede ser adaptado para proporcionar muestras para análisis de citometría de flujo.

Por último, este protocolo puede ser adaptado para modelizar C. microbios albicans- interacción involucrados en la neumonía asociada a la ventilación tales como Staphylococcus aureus 18 o enterobacterias. Otra adaptación podría ser la colonización de las vías respiratorias utilizando bacterias en lugar de C. albicans para modelizar la interacción bacteriana en la enfermedad pulmonar supurativa crónica como bronquiectasias. Con este fin, los ratones inmunodeprimidos tienen que ser utilizados, debido a la eliminación de bacterias en ratones competente inmunológico no permite una colonización de la vía aérea persistente.

Para la instilación, la posición de la mano que sostiene el animal es critica. Como ya se ha subrayado en el apartado anterior, cuando infundir por vía intranasal el ratón, el operador deberá garantizar que la boca está perfectamente cerrado para evitar la expectoración de la solución. El pulgar soporta la mandíbula y mantiene la boca cerrada durante todo el procedimiento de instilación (Figura 4B). Luego, con la otra mano, la pipeta se deposita en una fosa nasal (Figura 4C) y la solución progresiva y suavemente inculcado sin aire para evitar la formación de burbujas. Obviamente, la instilación se debe realizar en un armario 2-bioseguridad de nivel.

Recogida de muestras requiere una formación quirúrgica de pequeños animales certifed del operador. En cada paso, las muestras deben ser colocados en hielo para evitar la lisis celular y preservar las proteínas de la desnaturalización. Instrumentos quirúrgicos básicos son necesarios (Figura 4A). Ellos deben ser esterilizados en autoclave antes de su uso. Se recomienda que los diferentes conjuntos de instrumentos quirúrgicos se utilizan para abdominal y pasos quirúrgicos torácicos, evitando la contaminación cruzada de muestras de pulmón. Los diferentes pasos críticos de la disección quirúrgica se presentan (Figura 5A-5E). Posición del ratón es crítica; el animal debe ser inmovilizado plana sobre su espalda cabeza opuesto al operador y recta. El etanol se debe utilizar para liberalmente de preparación antes de la primera incisión para evitar la propagación de pelo en las muestras y la contaminación bacteriana potencial de la piel. La piel es bien vascularizado y debe ser retraído con cuidado para evitar la hemorragia (Figura 5A).

Entonces la caja torácica se reclina después de una incisión lateral de tórax en la que la caja torácica se debe mantener constantemente en las garras pinzas para evitar lesiones en el corazón y los pulmones durante la incisión. Pulmones y corazón están expuestos (Figura 5B). Pulmón infectado aparece blanquecina (Figura 5B). La disección de la zona cervical expone la tráquea y una sutura es el cocheefully colocado detrás de la tráquea superior (Figura 5C). Canulación de la tráquea se debe realizar con precaución. No utilice una cánula de gran tamaño (tamaño máximo es de 20 G). Una pequeña incisión anterior de la tráquea membranosa entre dos anillos cartilaginosos permite la inserción de la cánula. Cuando la cánula se observa por transparencia a través de la tráquea por encima de la carina (Figura 5D), la sutura está fuertemente atado alrededor de la tráquea asegurándola alrededor de la cánula (Figura 5E). La cánula está conectada a una válvula de cierre Luer macho de 3 vías con 2 jeringas conectados a los puertos hembra. Una jeringa contiene helado de PBS para lavado broncoalveolar; el otro es vacío a retroceder el líquido de BAL. Estas jeringas deben ser chaged entre los grupos.

En conclusión, el cebado antes de la modelo de lesión pulmonar aguda es un modelo relevante y de gran alcance para explorar en las interacciones huésped-mediada in vivo entre los patógenos. El uso de animales es lalimitación principal y debe ser cuidadosamente sopesado contra la información se puede obtener in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

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References

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El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias
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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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