Abstract
Studere vert-patogen interaksjon gjør oss i stand til å forstå de underliggende mekanismene for patogenitet under mikrobiell infeksjon. Prognose av vert avhenger av involvering av en tilpasset immunrespons mot en patogen. Immunrespons er kompleks og resultater fra samspillet av patogener og flere immun eller ikke-immune cellulære typer 2. In vitro-studier kan ikke karakterisere disse samhandling og fokus på celle-patogen interaksjoner. Videre, i luftveiene 3, særlig hos pasienter med purulent kronisk lungesykdom eller i mekanisk ventilerte pasienter, polymikrobielle samfunn er til stede og komplisere vert-patogen interaksjoner. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er begge problem patogener 4, ofte isolert fra tracheobronchial prøver, og knyttet til alvorlige infeksjoner, spesielt i intensivavdeling 5. Mikrobielle interaksjoner harrapportert mellom disse patogener in vitro, men den kliniske betydningen av disse interaksjonene er fortsatt uklart 6. For å studere samspillet mellom C. Albicans og P. aeruginosa, en murine modell av C. albicans airways kolonisering, etterfulgt av en P. aeruginosa- mediert akutt lungeinfeksjon ble utført.
Introduction
Dyremodeller, spesielt mus, har vært i utstrakt bruk for å oppdage immunresponser mot patogener. Selv om medfødt og ervervet immunitet variere mellom gnagere og mennesker 7, letthet i avl og utvikling av knockouts for mange gener, lage mus en utmerket modell for å studere immunresponser 8. Immunresponsen er kompleks og resultater fra samspillet av et patogen, bosatt mikrobielle flora og flere immun (lymfocytter, nøytrofile, makrofager) og ikke-immune (epitelceller, endotelceller) cellulære typer 2. In vitro studier tillater ikke observere disse komplekse interaksjoner og hovedsakelig fokusere på unike celle-patogen interaksjoner. Mens dyremodeller må brukes med forsiktighet og begrenset til svært spesifikke og relevante spørsmål, musemodeller gir et godt innblikk i pattedyr immunrespons in vivo og kan ta opp deler av viktige kliniske spørsmål 7.
6. Mens hva som utgjør en "normal" airway mikrobiomer gjenstår å fastslå, bosatt samfunn er ofte en blandingsflora bestående og stammer fra ulike økologiske kilder. Pasienter med purulent kronisk lungesykdom (cystisk fibrose, bronchectasis) eller mekanisk ventilerte pasienter utviser en spesiell flora på grunn av koloniseringen av luftveiene ved miljø ervervet mikroorganismer 9. Pseudomonas aeruginosa og Candida albicans er både problem patogener 5, ofte isolert sammen fra tracheobronchial prøver og ansvarlig for alvorlig opportunistisk infeksjon hos disse pasientene, spesielt i intensivavdeling (ICU) 4.
Isolering av disse mikroorganismene under akutt lungebetennelse hos intensiv resultater i anti-mikrobiell behandling mot P. aeruginosa but gjær er vanligvis ikke ansett patogene på dette nettstedet fem. In vitro interaksjoner mellom P. aeruginosa og C. albicans har vært mye rapportert og viste at disse mikroorganismer kan påvirke vekst og overlevelse av hverandre, men undersøkelser kunne konkludere om tilstedeværelsen av C. albicans er skadelig eller gunstig for verten 10. Musemodeller ble utviklet for å løse dette relevansen av P. aeruginosa og C. albicans in vivo, men samspillet mellom mikroorganismer var ikke det sentrale punkt. Faktisk ble modellen etablert for å vurdere involvering av C. albicans i vertens immunrespons, og utfallet.
En tidligere modell etablert av Roux et al allerede brukt en innledende kolonisering med C. albicans etterfulgt av en akutt lungeinfeksjon indusert av P. aeruginosa. Ved hjelp av deres modell, fant forfatterne en skadelig rolle prior C. albicans Colonization 11. Imidlertid Roux et al anvendes en høy belastning av C. albicans i deres modell med 2 x 10 6 CFU / mus i løpet av 3 dager. Vi har etablert en 4-dagers modell av C. albicans luftveier kolonisering, eller i det minste varighet uten lungeskade, I denne modellen C. albicans ble hentet opp til 4 dager etter en enkel instillering av 10 5 CFU per mus (figur 2B) 12,13. Etter 4 dager ble ingen tegn på inflammatorisk cellerekruttering, inflammatorisk cytokinproduksjon eller epitelskade observert. På 24 - 48 timer, på toppen nærvær av C. albicans, selv om en mobil og cytokin medfødte immunrespons ble observert, var det ingen tegn på lungeskade. Overraskende, mus og dermed kolonisert med C. albicans 48 timer før intranasal innføring av P. aeruginosa hadde svekket infeksjon sammenlignet med mus med P. aeruginosa infeksjon alene. jegndeed, mus viste mindre lungeskade og redusert bakteriemengden 12,13.
Flere hypoteser kan forklare dette gunstig effekt av tidligere kolonisering med C. albicans på P. aeruginosa formidlet akutt lungeinfeksjon. Først en arts cross-talk involverer hver mikroorganismer quorum-sensing systemer, den homoserinelactone baserte P. aeruginosa system og farnesol baserte C. albicans system, ble evaluert. Sekund, C. albicans opptre som en "lokkedue" target for P. aeruginosa avlede patogenet fra lunge epitelceller ble studert. Begge hypoteser ble ugyldiggjort (upubliserte data). Den tredje hypotese var at for en "priming" av medfødte immunsystemet av C. albicans ansvarlig for en forbedret påfølgende medfødt respons mot P. aeruginosa. Denne siste hypotesen ble bekreftet. Faktisk C. albicans kolonisering førte til en grunning av medfødt immunitet igjennomgh IL-22, hovedsakelig utskilt av medfødte lymfoidceller, noe som resulterer i økt bakteriell clearance og redusert lungeskade 12.
I konklusjonen, er det vert en sentral aktør i samspillet mellom mikroorganismer moduler det medfødte immunrespons og involverer ulike betennelsescelletyper. Mens disse komplekse immuninteraksjonene kan dissekert in vitro den innledende hypoteser kan kun gis ved hjelp av passende in vivo-modeller. Den følgende protokollen gir et eksempel på en in vivo studie av vert-mediert patogen interaksjon som kan være tilpasset til andre mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den regionale etiske regional komité for dyreforsøk har godkjent denne metoden, i samsvar med nasjonal og internasjonal dyr omsorg og bruk i prøvings retningslinjer forskning.
1. Prøvetaking
- Eksempel lagring
- Samle alle prøvene og umiddelbart lagres ved - 20 ° C eller på is inntil fryselager for å unngå forringelse. Plasser steril fosfatbufret saltløsning (PBS) på is for å forbedre bronko-alveolar LAVAGES (BAL) ytelse.
- Kirurgi
- Sterilisere all kirurgisk utstyr ved hjelp av en autoklav.
MERK: Hvis det er mulig, anbefales det å bruke to forskjellige sett med instrumenter for buk og thorax tiltak for å unngå krysskontaminering. Kreves disseksjon utstyr er detaljert i figur 4A
- Sterilisere all kirurgisk utstyr ved hjelp av en autoklav.
2. Mus, bakterier og gjærstammer
- Hus mus i samsvar med lokal bruk av dyr i reretningslinjer søk komité i et ventilert stativ uten å overskride 5 mus per bur, med mat og vann ad lib, i et biosikkerhetsnivå 2 boliger anlegget på grunn av bruk av biosikkerhet nivå 2 mikroorganismer: P. aeruginosa og C. albicans.
- Hold bakteriestammer ved -80 ° C i 40% glycerol medium.
- Legg bakterier direkte fra frossent lager inn i kulturrøret som inneholdt 3 ml sterilt Luria-Bertani-medium ved bruk av en 10 ul inokulasjon sløyfe. La O / N ved 37 ° C med kretsende rysting (400 rpm) dagen før instillasjon.
- Høste bakteriene ved sentrifugering ved 2000 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten til et passende lukket biologisk avfallshåndtering. Observere hvite adherent pellet på bunnen av dyrkningsrør.
- Vask og suspendere pellet bruker 5 ml PBS.
- Gjenta trinn 2.2.2 til 2.2.3 en gang til for å utføre en andre vask.
- Resuspender de pelleterte bakteriene ved hjelp av 1 ml PBSog kort virvling.
- Bestem inoculum tetthet ved hjelp av optisk densitometer på 600 nm ved hjelp av en optisk tetthet Meter. En tetthet på 0,9 tilsvarer 10 9 CFU / ml for PAO1, fortynn deretter.
MERK: Dette resultatet må oppnås for hver stamme som brukes ved bestemmelse av densiteten av suksessive fortynninger av en kalibrert inokulum. - Kontroller pode av serie logaritmisk fortynninger og plate 100 mL av hver fortynning på bromkresolpurur agar (BCP) plater og O / N kultur. Administrere hver mus intranasalt 50 ul av oppløsningen inneholdende 1 x 10 8 for å 2 x 10 8 CFU per ml (5 x 10 6 for å 1 x10 7 CFU per mus).
- Bruk C. albicans SC5314 som en referanse belastning. Bevare belastning i 40% glycerol-medium ved -80 ° C.
- Supplere Gjær-Peptone-Druesukker buljong med 0,015% amikacin å unngå bakteriell forurensning og legge til rette for videre teller.
- Legg gjær bruker 10 &# 181; l inokulasjon sløyfe inn forberedt YPD-sjy supplert med amikacin O / N ved 37 ° C.
- Gjær høsting ved sentrifugering ved 2000 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten til et passende bioharzard avfallshåndtering. Hvitt tilhenger pellet bør observeres i bunnen av dyrkningsrør.
- Vask og suspendere de pelleterte bakteriene ved bruk av 5 ml PBS og kort virvling.
- Gjenta trinn 2.2.2 til 2.2.3 en gang til for å utføre en andre vask.
- Resuspender pellet ved hjelp av 1 ml PBS og kort virvling.
- Bestemme størrelsen av inokulum ved å telle på en Mallassez hematocytometer ved hjelp av en standard mikroskop ved 40 gangers forstørrelse.
NB: Konsentrasjon (i CFU / ml) blir oppnådd ved å bruke følgende formel: (antall gjær x 10 5) / (antall telles gitter rektangler på Mallassez hematocytometer). - Kontroller av serie logaritmisk fortynning til 10 -5 og 10 -6 å bekrefte at løsningen inneholder 2 x 10 6 CFU / ml.
- Plate på YPD agar plater supplert med 0,015% amikacin.
3. Airways Colonization av C. albicans
MERK: Etter miljøtilpasning, er mus veid to ganger om dagen.
- Under en avtrekkshette, depositum 500 mL av Sevofluran mot en 4 cm x 4 cm gasbind (open-slipp teknikk) 14.
- Umiddelbart plassere gasbind på gulvet av et ca. 750 ml induksjonskammeret. Umiddelbart plassere en mesh-forhøyning over gasbind for å unngå direkte kontakt mellom dyr og gasbind.
- Lukke lufttett lokk, og vente 1 til 2 minutter for å tillate diffusjon av Sevoflurane i kammeret.
- Overfør musen fra buret til mesh plattform og tett lokk. Lett anestesi med konservert spontan pusting bør oppnås hos 30 til 45 sek.
- Monitor for hypotoni ved å observere tap av stabiliseringsrefleks på hvilket tidspunkt musen kan fjernes fROM boksen og innpodet.
- Intranasal innføring (Kan bli utført i 10 sek av en trenet operatør).
- Hold museenhånds ligger på ryggen holdt oppreist (4B).
- Ved hjelp av pekefingeren, støtte hodet og bruke tommelen til å holde kjeven lukket for å unngå oppspytt (Figur 4C).
- Som beskrevet i trinn 2.3.8, sikre at den tilberedte C. albicans oppløsning inneholder 2 x10 6 CFU per ml for en 50 ul innpodet volum.
MERK: Den andre kritiske punktet er innpodet volum. Et volum lavere enn 50 ul kan resultere i en utilstrekkelig kolonisering eller inhomogene drypping av luftveiene, kan et større volum indusere drukning / kvelning og død. - Innføre musen intranasalt ved nærmer pipetten til neseborene.
- Pipetter en 50 ul dråpe danner en boble som inneholder løsningen på neseborene, deretter inhaleres av spontaneously puste mus.
- Plasser musen i en utvinningsområde (for eksempel en stor godt luftet bart bur med en overhead varmelampe). Mus må overvåkes til fullstendig oppvåkning. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency og rettende refleks. På dette punktet, kan mus bli returnert til en vanlig bolig bur.
4. P. aeruginosa -indusert Akutt lungeinfeksjon
MERK: Mus er veid i løpet av de fire neste dagene. Normalt mus opp i vekt i løpet av C. albicans formidlet airway kolonisering (Figur 2A).
- Klargjør suspensjon som inneholder P. aeruginosa dagen for instillasjon etter O / N vekst (avsnitt 2.2).
- Bedøve kort ved hjelp av inhalert Sevoflurane som beskrevet ovenfor (avsnitt 3.1).
MERK: Hvis du vil utføre akutt lungeinfeksjon, anbefales bakteriemengden er foreslått iTabell 1. - Innføre musen som beskrevet ovenfor (avsnitt 3.2) med særlig vekt på post-instillasjon utvinning.
5. Mål av lungeskade Index
- Forbered en løsning som inneholder FITC-merket albumin. Injisere denne løsningen to timer før dyret dødshjelp.
- Veie 0,2 mg albumin-FITC med nødvendig utstyr.
- Legg 0,2 mg i en ml PBS. I korthet vortex. Hvis det ikke brukes umiddelbart, legger løsningen i folie for å unngå eksponering for lys fra omgivelsene.
- Injiser intra-peritonealt 200 ul av FITC-merket albumin-løsning til hver mus.
- Dødshjelp
- Veie mus for den siste vekten data.
- Avlive et enkelt muse i samsvar med lokal bruk av dyr i forskning komité retningslinjer ved hjelp av en intra-peritoneal injeksjon av en dødelig overdose av pentobarbital: 300 ul 5,47% pentobarbital.
- Fjern musen fra buret og får lethal injeksjon av operatør.
- Etter injeksjon overføre mus alene til en annen merd, skjult fra andre dyr. Observere musen til fravær av bevegelse. Bekreft døden er ved fravær av bevegelse, spesielt åndedrettsbevegelse, manglende puls.
- Utføre kirurgiske innsamling av prøver på døde dyr, derfor uten bedøvelse eller smertestillende midler.
- Kirurgisk prøvetaking: Thoracic scenen.
MERK: For å opprettholde sterile forhold, er all kirurgi utført ved hjelp av sterilt utstyr i et biosikkerhetsnivå 2 miljø.- Anvende etanol til huden. Utfør en midtlinjen snitt i huden fra sternum til midten av magen med saks. Fra midtlinjen incise langs brystkasse på hver side. Brett huden på hver side av brystkassen for å visualbrystkassen.
- Utføre en loddrett snitt av brystkasse på hver side som går opp mot clavicles for å kunne hvile på hele fremre brystvegg med akterendenum slik at den perfekte visualisering av hjerte og lunger (figur 5A, 5B).
- Samle blod ved hjelp av en pre-heparined sprøyte ved punktering hjertet ved siden interventricular arterien. Trekke tilbake et minimum av 500 pl for å oppnå minst 100 ul plasma. Plasser blodprøve på is.
- Utføre en midtlinjen cervikalt snitt for å visualisere luftrøret (figur 5B og 5C). Dissekere nøye fascia rundt luftrøret. Plasser en sutur bak luftrøret (figur 5C og 5D). Deretter sutur vil være stengt rundt kanylerør nål for å sikre riktig kylling.
- Kateterisere luftrøret ved hjelp av 20-G modifisert sonde nål (figur 5D og 4A). Knyt en kirurgisk knute rundt kanylert luftrøret med tidligere plassert sutur.
- For å utføre bronchoalveolar LAVAGES (BAL), forsiktig og gradvis injisere og tegne 500 mL av iskald PBS i / fra lungene. Plasser prøven på jegce å unngå cellulær lyse.
- Gjenta trinn 5.3.6, 3 ganger for å oppnå en total på 1500 pl BAL fluid og basseng lavage prøvene inn i en 2 ml sentrifugerør (figur 5E).
- Fjern lungene fra brystet. Plasser en lunge segment (størrelse skal tilsvare halvparten av en lunge eller en lapp) i 1,5 ml sentrifugerør og lagre raskt på - 80 ° C.
- Plasser en lunge segment i en pre-veid hemolyse rør som inneholder PBS å bestemme bakteriemengden og plassere den på is.
- Kirurgisk prøvetaking: abdominal scenen.
- Utfør et annet snitt på venstre side av magen. Observere milten gjennom bukhinnen.
- Fjern milten og legg inn en andre hemolyse tube inneholder 1 ml PBS og legg på is.
- Lungeskade index
MERK: Alveolar-kapillær membranpermeabilitet vurderes ved å måle FITC-merket-albumin lekkasje fra det vaskulære rommet til alveolar-placedhaveren rommet.- Sentrifuger blodprøve og BAL fluid i 10 minutter ved 1500 x g. Samle supernatants til nye sentrifugerør. Pelletene tilsvarer rekruttert plasma eller BAL-celler og bør plasseres på is.
- Tilsett 100 ul av hver supernatant blod (plasma, gul) eller BAL supernatanten til en 96-brønns transparent plate (300 ul brønner). Plasser en folie på plate hvis den ikke brukes umiddelbart.
- Måle fluorescens nivåer i plasma og BAL Supernatantene ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (eksitasjon, 487 nm, emisjon, 520 nm).
- Bestem lungeskade indeksen ved beregning av fluorescens ratio [(BAL supernatant / blod supernatant) x 100].
- Bronchoalveolar lavage (BAL) differensial legemer.
MERK: Bruk cellepellet hentet fra sentrifugering av BAL væske i trinn 5.5.1.- Du kan eventuelt bruke rød-cellelyse buffer. Legg 500 mL av rød cellelyseringsbuffer til sentrifugerøret som inneholder den cell pellet. I korthet vortex og la 10 min på is. Legg 500 mL PBS å stoppe rød-cellelyse.
- Høste cellene ved sentrifugering i 10 min ved 1500 x g. Fjern supernatant og suspen cellepelleten i 1 ml sterilt PBS. Nummerere celler på en Mallassez hematocytometer. Ved hjelp av en hemacytometer til Count Cells. Konsentrer celler på et lysbilde med en cytospin.
- Flekke celler ved hjelp av farge kit slik at cellen identifisering og telling (makrofager, lymfocytter, nøytrofile granulocytter).
- Lunge bakteriemengden og bakteriespredning
MERK: For å vurdere lunge bakteriemengden og bakteriespredning, lunger og milt ble henholdsvis samlet inn og lagret i pre-veid hemolyse rør som inneholder 1 ml PBS (trinn 5.3.9).- Veie hemolyse rør som inneholder 1 ml PBS og enten lunge eller milt. Homogen prøvene med en vevshomogenisator å oppnå lungehomogenater og milt homogenater.
- Deponere 100 ul vev homogenates til sentrifugerør som inneholdt 900 mikroliter sterilt PBS for å oppnå serielle fortynninger logaritmiske.
- Plate de to siste aktuelle fortynnede prøver (10 -3 og 10 -2) på enten BCP-agar for P. aeruginosa eller YPD-amikacin-supplert agar for C. albicans lunge og milt byrde besluttsomhet.
- Inkuber platene O / N ved 37 ° C. Dagen etter, nummerere koloniene på tallerkener.
- Index resultatet til lunge vekt for å få en CFU per gram lunge. Lungeutvalgsstørrelsene er ikke det samme, resultatene skal uttrykkes i CFU per gram lunge.
Formel for indeksen er: [CFU] x [vekten av hemolyse tube og lunge] - [vekten av hemolyse tube].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som det fremgår tidligere i beskrivelsen protokollen, må forsøket 5 dag å fullføre (Figur 1: eksperiment tidslinjen). En operatør er ønsket under hele løp av eksperimentet, og kan håndtere prosessene opp til et maksimum på 10 mus. Dersom flere dyr er nødvendig, er to personer nødvendig spesielt for kirurgisk prøvetaking. Faktisk alle prøver samles på under 2 timer for å unngå økt passiv alveolar-kapillær lekkasje av FITC-merket albumin i de siste mus.
Det første trinnet er utarbeidelsen av C. albicans inokulum og intra-nasal inndrypping for å oppnå luftveiene kolonisering av C. albicans. En 4-dagers varighet modell blir oppnådd ved intranasal instillasjon av 5 x 10 5 CFU av C. albicans per mus (figur 2B). I løpet av disse 4 dagene, mus opp i vekt (Figur 2A) og drypping av 5x10 5 CFU ikke induserer lung skade (Figur 2C). Selv C. albicans kan vedvare opp til 4 dager i denne modellen, belastningen avtar etter 48 timer. Derfor P. aeruginosa indusert akutt lungeinfeksjon er perfomed i 48 timer av C. albicans utholdenhet.
P. aeruginosa-stamme PAO1 er et stort sett karakterisert laboratorie påkjenning som omfatter hoved virulensfaktor, type tre-sekresjon system (T3SS), som i 75% av kliniske isolater 15 lunge. For teser grunner er PAO1 en aktuell belastning i dyremodeller av akutt lungeinfeksjon. Lungeskade vurderes gjennom alveolo-capillar permeabilitet målt ved proteinlekkasje fra det vaskulære rommet inn i luftveiene uttrykt som lungeskade indeksen. Lungeskade øker med inokulum (figur 3A). Her kan vi rapportere kinetikken for den akutte lungeskade komponent i vår modell indusert av PAO1 stamme (5x10 6 CFU / mus) (figur 3B-3F) alene uten forutgåendeC. albicans- mediert grunning. Avhengig av belastning og tidsforløpet av modellen, valg av første P. aeruginosa inokulum er omtalt i neste avsnitt og er antydet i tabell 1.
Fem mus per gruppe ble brukt. Lungeskadeindeks (figur 3B), bakteriemengden i lungene (figur 3C), bakteriebelastning i milten, som gjenspeiler bakteriespredning (figur 3D), BAL cellularitet (figur 3E) og differensial celletelling (figur 3F) ble bestemt hver 12 hr. Lungeskade var maksimal mellom 24 timer og 36 timer etter infeksjon (Figur 3B). Bakteriemengden viste en 1-log CFU / ml redusere hver 24 time (Figur 3C). Kumulativ bakteriespredning vurderes av milt homogenatet kulturene økte hver dag (figur 3D). Til slutt, mens BAL cellularitet i uinfiserte mus består hovedsakelig (90%) of alveolære makrofager, i BAL fra infiserte mus ble nøytrofile allment rekruttert og differensialcelletall viste 90% nøytrofile og 10% makrofager og lymfocytter (Figur 3E, 3F).
Figur 1. Tidslinje av akutt lungeskade Modell i Explore Host-mediert Interaksjon mellom C. albicans og P. aeruginosa.
Grafisk representasjon av hele prosessen. Det første trinnet er miljøtilpasning av mus huset anlegget. Det andre trinnet er C. albicans mediert airway kolonisering. Endelig er den tredje trinn den akutte lungeinfeksjon formidles av P. aeruginosa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. C. albicans airway Colonization.
(A, B) Mus intranasalt innpodet med 10 5 CFU C. albicans (stamme SC5314). Mus opp i vekt i løpet av C. albicans -mediert airway kolonisering (A). Kolonisering av luftveiene kan forlenges til 3-4 dager med bare en innledende instillasjon. I en tidligere studie, tar grunning av medfødt immunitet sted mellom 24 og 48 timer. (n = 5 per gruppe), feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD. (C, D) musene intranasalt innpodet 5 x 10 5 eller 5 x 10 6 CFU av C. albicans. Lungeskade indeks (C) vurdert av alveolar kapillær barriere permeabilitet på 24 timer. Vektøkning (D) uttrykt som prosent av den opprinnelige vekt (n = 5 pr gruppe).Feilfelt representerer betyr ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Modell av akutt lungeskade indusert av P aeruginosa.
(A) C57Bl / 6J mus intranasalt infisert med økende masse P. aeruginosa (fra 1 x 6 til 5 oktober x 10 7 CFU per mus) (n = 5 per gruppe), feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD. Musene avlives ved 24 timer. Lungeskade indeksen er vurdert av alveolar-kapillær barriere permeabilitet som øker proporsjonalt med bakteriell byrde. Sammenligning av lungeskade indeksen innhentet ved hjelp av gamle metoden med lungehomogenater Supernatantene (svarte søyler) og ny kombinert-metoden bruker bronchoalveolar lavage Supernatantene (grå bars) (BF) mus intranasalt infisert med 5 x10 6 CFU per mus. Mus avlives hver 12. til 48 timer til akutte skader modellkinetikk. Lungeskade (B), lunge bakteriemengden (C), milt bakteriemengden (D), bronchoalveolar lavage (BAL) cellularity (E) og BAL differensial legemer (F) er også vurdert. (n = 5) per gruppe, feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. kirurgisk utstyr og intranasal innføring.
(A) Nødvendig kirurgisk utstyr for å utføre akutte skader modell og bronchoalveolar kylling. Her Trakeal kanyle (20G), og to 1 ml sprøyter er forbundet med en Luer-lock tre-veis ventil. En sprøyte til å injisere vann inn i lungene, en for å trekke den bronkoalveolare væsken tilbake ut fra lungene. (B, C) Posisjonen til musen i hånden for å utføre intra-nasal drypping. I dette bildet, tommelen under kjeven sikrer en lukket munnen under drypping. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Kirurgi og Broncho-alveolar Lavage.
Brystet er allment åpnet (A), og brystkassen åpnes sideveis for å unngå skade på hjertet (B). Etter blodprøvetaking blir livmorhalsen området dissekert for å eksponere trakea (C). Tanntråd blir brukt som ensutur og føres bak luftrøret (C, D). Luftrøret blir deretter kanylert med 20-G kanyle kombinert (D) som er montert på sprøyten og tre-veis ventil. Luftrøret skal være godt sikret rundt kanylen ved å knytte en kirurgisk knute ved hjelp av suturen på plass bak luftrøret. Endelig 500 ul av PBS er forsiktig innpodet i lungene og deretter BAL blir forsiktig trukket ut. (E) Fluid-innpodet lungene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Minimal innpodet Burden | Maximal innpodet Burden | |
| T3SS- | 5 x 10 7 | 1 x 10 8 |
| T3SS + | 5 x 10 6 | 1 x 10 7 |
| T3SS + exoU + | 5 x 10 | 1 x 10 5 | |
Tabell 1. P. aeruginosa Inokula Brukes i akutt lungeinfeksjon Models.
Foreslåtte optimale intranasale konsentrasjoner av inokula for å indusere akutt lungeskade i henhold til stammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller, spesielt pattedyr, er nyttige for å klargjøre kompliserte mekanismer for vert-patogen interaksjon innen immunitet. Selvfølgelig, behovet for informasjon oppnåelig bare fra dyremodeller må være avgjørende; ellers må bruke dyr erstattes av in vitro-modeller. Denne dyremodell illustrerer den innsikt som bare kan leveres av en dyremodell fordi interaksjonen mellom patogener er mediert av en flerkomponentvertsrespons. Mus i dag brukes til å studere dette host-patogen interaksjoner er unge voksne i alderen 6 til 10 uker med en moden og uendret immunrespons. Ved å fokusere på det medfødte immunrespons, er C57BL6 / J bakgrunns mus foretrukket. For å unngå en effekt av sex og hormonelle syklus (spesielt østrogen) på immunrespons, hannene er derfor det beste valget. For å oppnå statistisk signifikans, må gruppene har minst 5 individer ved slutten av eksperimentet, men som foreslått av alle dyre experimenretningslinjer teringstilbud, bør antallet dyr som brukes reduseres og raffinert til et strengt minimum.
Transport fra oppdretter å gi dyrene til forskning anlegget induserer stress i mus. Konsekvensen av dette er en øket sekresjon av inflammatoriske cytokiner som kan endre følgende eksperimenter som vår. Videre et nytt miljø og nye "bur kamerater" bidra til stress. Derfor må mus bli akklimatisert i minst sju dager før for å studere i sitt nye bomiljø. Denne boligen har å bli kontrollert, og gir standard mat og vann ad-lib, en dag / natt syklus, og hensiktsmessig stabil luftfuktighet og temperatur.
Både lunge kolonisering og lungeinfeksjon modeller krever praksis og fingerferdighet. Drypping kan utføres intranasalt eller intra-trakealt. Det sistnevnte er vanskeligere og krever større ekspertise gjennom trening på grunn av en høy risiko for anoksisk hjertestans. Ja, procedure krever å kunne intubere en mus på mindre enn 15 sek, og derfor kreves dypere anestesi. Vårt valg av intra-nasal inndrypping er enklere å utføre, siden den tilførselsvei er tilgjengelig, krever mindre risikabelt lettere anestesi og er derfor mer reproduserbar.
Boutoille et al allerede beskrevet vår akutt lungeskade modell, særlig vurderingen av lungeskade gjennom å måle alveolær-kapillær barriere permeabilitet bruker FITC-merket albumin 16. For å redusere antall mus per forsøk ble denne metoden tilpasset og kombinert med bronkoalveolær lavage (BAL). I studier av Boutoille et al, brukte vi sammenligningen mellom fluorescens av FITC-merket albumin i lungehomogenat Supernatantene og blod Supernatantene 17.
Å fullt utføre denne sammenligningen, er hemoglobinnivå og hematokritnivåer også nødvendig. Denne metoden ble tilpasset i Allow samtidig analyse av vertsrespons ved å vie en lunge til homogenisering og vurdering av lungeskade og den andre til utskylling og studier av vertsrespons. Faktisk kan BAL fluid benyttes til å vurdere cytokinnivåer, proteinsekresjon og cellerekruttering. Våre tilpasning gir flere resultater fra en enkelt dyreforsøk, redusere kostnadene og det nødvendige antall av mus, spesielt når man bruker knock-out mus 17 som anbefalt i føringer dyreforsøk. Videre er en del av lungen ble holdt ved -80 ° C for å gjennomføre total RNA ekstraksjon og kvantitativ polymerasekjedereaksjon eller histologisk analyse. Sammenligning mellom den tidligere fremgangsmåten og den nye fremgangsmåten er tilpasset kombinert med BAL viser sammenlignbare resultater (figur 3A) for å vurdere lungeskade indeks.
I studiet av Mear et al, ved hjelp av de samme prosedyrene, flowcytometer analyse ble utført på BAL celler oppnådd ved sentrifugering av BAL væske. Ligner ennalyses ble utført på total lungeceller fra lungene 12. I dette tilfellet kan lungeskade vurdering med FITC-merket albumin ikke kan utføres samtidig, på grunn av gjenstander indusert av FITC (samme kanal enn grønn fluorescens protein). Derfor, hvis strømningscytometri er nødvendig, eksperimenter må planlegges deretter.
Tidspunktet for aktiv dødshjelp er kritisk. En tidsforløpet av den akutte lungeinfeksjon modell over de første 72 timer er vist Figur 3. I denne modellen, er høyden av lungeskade og vert reaksjon skjer mellom 24 og 36 timer (figur 3). Derfor, i vår konstruksjon 24-timers sluttpunkt ble valgt som en avlesning for 3 årsaker: for det første er det lett å arrangere i laboratoriet, andre, for å unngå tap av mus som følge av dødelighet mellom 24 og 36 timer, og til slutt, fordi vertsrespons var maksimal på dette tidspunkt.
Det første trinnet i vår samhandling studien er koloniseringen av luftveiene med <em> C. albicans. Ved hjelp av en drypping av 10 5 CFU per mus, er en 4-dagers utholdenhet modellen fås uten lungeskade. Faktisk mus fikk vekt over tidsforløpet for denne fasen. Vektøkning er en nyttig indikator for fravær av skade på linje med kolonisering i motsetning til infeksjon. Faktisk, en øket initial belastning (over 10 6 CFU per mus) indusert lungeskade (figur 2C), og en skadelig vert-reaksjon langt utover priming, i hvilket tilfelle mus gått ned i vekt (figur 2D). Tvert imot, ved hjelp av en mindre innledende belastning (for eksempel 10 4 CFU per mus) en luftveier persistens modell ikke kunne oppnås. Derfor, for å oppnå den observerte grunning av vertsimmunitet beskrevet av Mear et al 12, er kalibrering av tildryppes sopp byrde avgjørende for suksess og overvåking av vekten kurven er en viktig kontroll.
Den samme nøyaktighet som kreves for P. aeruginosa P. aeruginosa er raskt fjernet fra luftveiene ved en passende vert-reaksjon. Ved hjelp av en altfor høy første P. aeruginosa overgår kapasiteten til vertens forsvar eller induserer en upassende og derleterious respons som resulterer i lasten fører til massive akutt skade og død slette alle forskjeller mellom gruppene. Den optimale inokulum for å indusere akutt skade avhenger av tilstedeværelsen av en funksjonell type-3 sekresjon system (T3SS) og produksjon av eksotoksin U, et toksin translocated ved T3SS i vertscellens cytoplasma. Disse to stammespesifikke egenskaper må tas i betraktning ved valg av den opprinnelige bakteriemengden. Initial bakterielle byrder er foreslått i denne artikkel som eksempler på nedre og øvre grenser for å indusere akutt lungeskade med T3SS-negativ eller positiv belastning, og stammer som produserer U eksotoksin eller ikke (tabell 1). Når man studererinvolvering av T3SS, har stammen dyrkes O / N og gjenopplivet med nytt LB-medium 3 timer før fremstillingen av podestoff for å oppnå optimal aktivitet av T3SS.
Bestemmelsen av bakterie- og soppbelastning 24 timer etter P. aeruginosa indusert lungeinfeksjon krever spesielle hensyn er diskutert i denne delen. Faktisk, som vist, når musene er infisert med 5 x 10 CFU T3SS 6-positive stamme, bakteriemengden i lungene i 24 timer vil reduseres til omtrent en log (figur 3C). Serielle fortynninger av prøvene må utføres opp til 5-log fortynning og platet på BCP-agarplater. Angå C. albicans i lungene, i 72 timer, blir sopp belastning reduseres til omtrent 2 log og prøvene må til å bli belagt på YPD-agar supplert med amikacin for å lette identifikasjon koloni. Endelig kan bestemmelse av bakteriespredning bli vurdert ved utsåing av 100 pl blodprøve på BCP-agar eller ved utsåing av 100 ul av milt homogenates på samme medium. De to metoder ble allerede blitt sammenliknet og milt kultur synes å være mer nøyaktig. Faktisk er milten et organ som "filtre" fullblod og kan "konsentrere" og spare bakterier å ha formidlet på blodet. Således ble milt homogenater reflektere systemisk bakteriespredning under akutt lungeinfeksjon med en høyere sensitivitet enn blod. Blodprøver representerer bakteriespredning ved en meget bestemt gitt tidspunkt og kan ikke virkelig gjenspeiler fenomenet bakteriespredning som en helhet. Derfor milt homogenatet kulturer er foretrukket.
Lungeskade indeksen er en sensitiv vurdering av lungeskade som følge av infeksjon og / eller upassende vertsrespons og effekten av potensielle legemiddel på disse komponentene. I tillegg gir denne in viv o modell innsamling av flere forskjellige prøver for å studere vertsrespons. Lunge kan brukes for RNA-ekstraksjon og analyseav gentranskripsjon. Lungeprøver kan også bli plassert i paraformaldehyd (PFA) til ytterligere histologiske observasjoner. BAL fluid kan benyttes for vurdering av protein sekresjon, slik som inflammatoriske cytokiner. Til slutt, som diskutert ovenfor protokollen kan tilpasses for å tilveiebringe prøver for strømningscytometri-analyse.
Endelig kan denne protokollen tilpasses modelize C. albicans- mikrober interaksjon involvert i respiratorassosiert pneumoni som Staphylococcus aureus 18 eller Enterobacteriae. En annen tilpasning kan være luftveis kolonisering ved hjelp av bakterier i stedet for C. albicans til modelize bakteriell interaksjon purulent kronisk lungesykdom slik som bronkiektasi. For dette formål er immunkompromitterte mus har til å bli brukt, fordi bakterielle klaring i immunkompetente mus som ikke tillater en vedvarende luftveis kolonisering.
For instillasjon, er cri posisjonen av hånden som holder dyrettiske. Som allerede understreket i forrige avsnitt, når intranasalt instilling musen, må operatøren sikre at munnen er helt lukket for å unngå oppspytt av løsningen. Tommelen støtter kjeve og holder munnen lukket under hele prosedyren instillasjon (figur 4B). Deretter, med den annen side blir pipetten avsettes på et nesebor (figur 4C) og oppløsningen gradvis og forsiktig dryppet uten luft for å hindre blæredannelse. Åpenbart må drypping utføres i et nivå 2-biosikkerhet skap.
Innsamling av prøver krever certifed små dyr kirurgisk opplæring av operatøren. På hvert trinn, må prøvene plassert på is for å unngå cellelyse og bevare proteiner fra denaturering. Basiske kirurgiske instrumenter er nødvendig (figur 4A). De må steriliseres ved autoklavering før bruk. Det anbefales at forskjellige kirurgiske instrument sett brukes for abdominal og thorax kirurgiske trinn, unngå krysskontaminering av lungeprøver. De ulike kritiske trinn av kirurgisk disseksjon presenteres (Figur 5A-5E). Posisjonen til musen er kritisk; dyret skal immobilisert flatt på ryggen hodet motsatt fra operatøren og rett. Etanol bør liberalt benyttes for å prep før den første innsnitt for å unngå spredning av hår i prøvene, og potensialet bakteriell kontaminasjon fra huden. Skin er godt vaskularisert og må trekkes tilbake nøye for å unngå blødning (figur 5A).
Deretter brystkasse er tilbakelent etter en lateral bryst snitt der brystkasse bør være konstant opprettholdes i pinsett grep for å unngå skade på hjerte og lunger under snittet. Lunge og hjerte er utsatt (Figur 5B). Infisert lunge vises hvitaktig (Figur 5B). Disseksjon av nakkeområdet utsetter luftrøret og en sutur er bilefully plassert bak øvre luftrøret (figur 5C). Kanylerør luftrøret må utføres med forsiktighet. Ikke bruk en overdimensjonert kanyle (maksimal størrelse er 20 G). En liten fremre snitt av membranseptum luftrøret mellom to bruskringene tillater innføring av kanylen. Når kanylen er observert av åpenhet gjennom luftrøret over carina (figur 5D), er suturen tett knyttet rundt luftrøret feste det rundt kanylen (figur 5E). Kanylen er koblet til en 3-veis hann Luer-låseventil med 2 sprøyter koblet til de kvinnelige portene. En sprøyte inneholder iskald PBS for bronchoalveolar kylling; den andre er tom for å trekke tilbake den BAL fluid. Disse sprøytene skal chaged mellom gruppene.
I konklusjonen, grunning før akutt lungeskade modellen er en relevant og kraftig modell for å utforske in vivo verts-mediert interaksjoner mellom patogener. Bruken av dyr erviktigste begrensning og bør vurderes nøye mot informasjoner in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
- Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
