Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

دراسة المجتمعات الميكروبية doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

دراسة التفاعل المضيف الممرض تمكننا من فهم الآليات الكامنة وراء المرضية خلال العدوى الميكروبية. التكهن المضيف يعتمد على ضلوع الاستجابة المناعية تكييفها ضد الممرض 1. استجابة مناعية معقدة وينتج عن التفاعل بين مسببات الأمراض وعدة أنواع الخلوية المناعية أو غير محصنة 2. وفي الدراسات المختبرية لا يمكن تميز هذه التفاعلات والتركيز على التفاعلات خلية الممرض. وعلاوة على ذلك، في مجرى الهواء وخاصة في المرضى الذين يعانون من مرض الرئة المزمن القيحي أو في المرضى الذين يعانون التهوية الميكانيكية، هي المجتمعات متعدد المكروبات الحالية وتعقد التفاعل المضيف الممرض. الزائفة الزنجارية والمبيضات البيض على حد سواء مشكلة مسببات في كثير من الأحيان معزولة من العينات الرغامية القصبية، و المرتبطة التهابات شديدة، وخاصة في وحدة العناية المركزة 5. التفاعلات الميكروبية لهاتم الإبلاغ بين هذه الجراثيم في المختبر ولكن التأثير الطبي لهذه التفاعلات لا يزال غير واضح 6. لدراسة التفاعلات بين C. البيض وP. الزنجارية، وهذا نموذج الفئران من C. البيض الهوائية الاستعمار، تليها P. تم تنفيذ التهاب في الرئتين الحاد بوساطة aeruginosa-.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

النماذج الحيوانية، وخاصة الفئران، وقد استخدمت على نطاق واسع لاستكشاف الاستجابات المناعية ضد المسببات المرضية. على الرغم من الحصانة الفطرية والمكتسبة تختلف بين القوارض والبشر وسهولة في تربية وتنمية بالضربة القاضية للعديد من الجينات، وجعل الفئران نموذجا ممتازا لدراسة الاستجابات المناعية 8. الاستجابة المناعية معقدة والنتائج من التفاعل بين العوامل المسببة للأمراض، والفلورا الميكروبية والعديد من المناعة (الخلايا الليمفاوية، العدلات، الضامة) وغير المناعية (الخلايا الظهارية، وخلايا بطانة الأوعية الدموية) أنواع الخلوية 2. وفي الدراسات المختبرية لا تسمح مراقبة هذه التفاعلات المعقدة وتركز أساسا على فريدة التفاعلات الخلية من مسببات الأمراض. في حين أن النماذج الحيوانية يجب أن تستخدم بحذر وتقتصر على أسئلة محددة للغاية وذات الصلة، ونماذج الماوس توفر نظرة ثاقبة إلى الاستجابة الثدييات المناعة في الجسم الحي، وقد تتناول أجزاء من الأسئلة السريرية المهمة 7.

"jove_content"> في الشعب الهوائية، والمجتمع الميكروبي معقد ربط عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المختلفة 6. في حين أن ما يشكل "العادي" microbiome الهوائية لا يزال يتعين تحديدها والمجتمعات المقيمة هي متعدد المكروبات في كثير من الأحيان، وتأتي من مصادر بيئية متنوعة. المرضى الذين يعانون من القيحي أمراض الرئة المزمنة (التليف الكيسي، bronchectasis) أو المرضى التهوية الميكانيكية تظهر على النباتات معينة بسبب الاستعمار في الشعب الهوائية بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المكتسبة بيئيا 9. الزائفة الزنجارية والمبيضات البيض على حد سواء مشكلة مسببات الأمراض في كثير من الأحيان معزولة معا من العينات الرغامية القصبية ، ومسؤولة من العدوى الانتهازية شديد في هؤلاء المرضى، وخاصة في وحدة العناية المركزة (ICU) 4.

عزل هذه الكائنات الدقيقة أثناء الالتهاب الرئوي الحاد في نتائج ICU في العلاج المضاد للميكروبات ضد P. الزنجارية بوفي العادة لا تعتبر التحرير الخميرة الممرضة في هذا الموقع 5. في المختبر التفاعلات بين P. الزنجارية وC. تم الإبلاغ على نطاق واسع البيض وأظهرت أن هذه الكائنات الدقيقة يمكن أن تؤثر على نمو وبقاء بعضها البعض ولكن الدراسات لا يمكن أن يستنتج إذا وجود C. البيض هو ضار أو مفيد للمضيف (10). وقد وضعت نماذج الماوس للتصدي لهذا أهمية P. الزنجارية وC. وكان البيض في الجسم الحي، ولكن التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة يست النقطة الرئيسية. في الواقع، تم إنشاء نموذج لتقييم مشاركة C. البيض في الاستجابة المناعية، والنتيجة.

A النموذج السابق الذي أنشأه رو وآخرون تستخدم بالفعل الاستعمار الأولي مع C. يتبع البيض من قبل التهاب في الرئتين الحاد الناجم عن P. الزنجارية. عن طريق نموذجهم، وجد الباحثون دورا الضار لصrior C. البيض الاستعمار 11. ومع ذلك تستخدم رو وآخرون حمولة عالية من C. البيض في نموذجهم مع 2 × 10 6 خلية / الماوس خلال 3 أيام متتالية. أنشأنا نموذجا 4 أيام من C. الاستعمار الهوائية البيض، أو على الأقل استمرار دون وقوع إصابات الرئة، وفي هذا النموذج C. تم استرداد البيض تصل إلى 4 أيام بعد تقطير واحد من 10 5 كفو في الماوس (الشكل 2B) 12،13. بعد 4 أيام، لم يكن هناك أي دليل على تجنيد خلية التهابات، وإنتاج السيتوكينات الالتهابية ولا ضرر الظهارية. في 24 - 48 ساعة، في وجود ذروة C. البيض، على الرغم من ولوحظ استجابة المناعية الفطرية الخلوية وخلوى، لم يكن هناك دليل على إصابة الرئة. والمثير للدهشة، وبالتالي الفئران مع المستعمر، C. البيض 48 ساعة قبل الأنف تقطير من P. قد الزنجارية الموهن العدوى مقارنة مع الفئران مع P. العدوى الزنجارية وحدها. أناndeed، أظهرت الفئران أقل إصابة الرئة وانخفاض عبء البكتيرية 12،13.

عدة فرضيات يمكن أن يفسر هذا التأثير المفيد للاستعمار مسبق مع C. البيض على P. الزنجارية بوساطة التهاب في الرئتين الحاد. أولا، وهو عبر الحديث بين الأنواع التي تشمل كل الكائنات الحية الدقيقة أنظمة نصاب الاستشعار، وP. القائم على homoserinelactone نظام الزنجارية وC. القائم على فارنيسول نظام البيض، تم تقييمها. ثانيا، C. وقد درس البيض بوصفها هدفا "شرك" لP. الزنجارية تحويل الممرض من الخلايا الظهارية الرئة. تم إبطال كل من الفرضيات (بيانات غير منشورة). كانت الفرضية الثالثة التي ل"فتيلة" للنظام المناعة الفطرية التي كتبها C. البيض مسؤولة عن تعزيز استجابة فطرية لاحقة ضد P. الزنجارية. وقد أكد هذه الفرضية الأخيرة. في الواقع C. أدى البيض الاستعمار إلى فتيلة الحصانة الفطرية throuغ IL-22، يفرز أساسا من الخلايا اللمفاوية الفطرية، مما أدى إلى زيادة إزالة بكتيريا وخفض إصابة الرئة 12.

في الختام، المضيف هو الفاعل المركزي في التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة تحوير الاستجابة المناعية الفطرية والتي تشمل أنواع مختلفة من الخلايا الالتهابية. في حين أن هذه التفاعلات المناعية المعقدة يمكن تشريح في المختبر الفرضيات الأولية لا يمكن إلا أن تقدمها مناسبة في النماذج الحية. وينص البروتوكول التالية مثال على الدراسة المجراة من بوساطة المضيف تفاعل العوامل المسببة للأمراض التي يمكن تكييفها لالكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد وافقت اللجنة الإقليمية الأخلاق الإقليمية لالتجارب على الحيوانات هذا الأسلوب، وفقا لرعاية الحيوان الوطنية والدولية واستخدامها في المبادئ التوجيهية للبحوث الفحص.

مجموعة 1. عينة

  1. تخزين عينة
    1. جمع كل العينات وعلى الفور تخزين في - 20 ° C أو على الجليد حتى التخزين المجمد لتجنب تدهور. ضع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) على الجليد لتحسين lavages-القصبية السنخية (BAL) الأداء.
  2. العملية الجراحية
    1. تعقيم جميع المعدات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف.
      ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام مجموعتين مختلفتين من أدوات لخطوات البطن والصدر لتجنب التلوث المتبادل. وترد تفاصيل المعدات تشريح المطلوبة في الشكل 4A

2. الفئران، البكتيرية والخميرة سلالات

  1. الفئران منزل في الامتثال مع استخدام المحلي الحيوانات في إعادةالمبادئ التوجيهية لجنة البحث في رفوف التهوية دون تجاوز 5 الفئران في قفص، مع الطعام وعفوي المياه، في منشأة سكنية مستوى السلامة الحيوية 2 بسبب استخدام مستوى السلامة الحيوية 2 الكائنات الحية الدقيقة: P. الزنجارية وC. البيض.
  2. الحفاظ على السلالات البكتيرية في -80 ° C في 40٪ الجلسرين المتوسطة.
    1. إضافة البكتيريا مباشرة من الأسهم المجمدة في أنبوب الثقافة التي تحتوي على 3 مل من معقم لوريا، Bertani مرق باستخدام 10 ميكرولتر التلقيح الحلقة. ترك O / N عند 37 درجة مئوية مع الهز المداري (400 دورة في الدقيقة) قبل يوم واحد تقطير.
    2. البكتيريا الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
    3. نضح طاف إلى التخلص مغلقة المناسب نفايات بيولوجية. مراقبة بيليه ملتصقة الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب الثقافة.
    4. غسل وتعليق بيليه باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.3 للمرة الثانية لإجراء غسيل الثاني.
    6. Resuspend والبكتيريا مكعبات باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيونيوvortexing لوجيزة.
    7. تحديد كثافة اللقاح باستخدام مقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر باستخدام مقياس الكثافة الضوئية. A كثافة 0.9 يناظر 10 9 CFU / مل لPAO1، وتمييع وفقا لذلك.
      ملاحظة: هذه النتيجة لابد من الحصول عليها لكل سلالة يستخدمها تحديد كثافة التخفيفات المتعاقبة لقيحة معايرة.
    8. التحقق من اللقاح عن طريق التخفيفات لوغاريتمي التسلسلية وطبق 100 ميكرولتر من كل تخفيف على bromocresol أجار الأرجواني (BCP) لوحات وO / N الثقافة. إدارة كل فأر الأنف 50 ميكرولتر من محلول يحتوي على 1 × 8-2 أكتوبر X10 8 كفو لكل مل (5 × 06-01 أكتوبر X10 7 CFU في الماوس).
  3. استخدام C. البيض SC5314 كما سلالة المرجعية. الحفاظ على السلالة في 40٪ الجلسرين المتوسطة في -80 ° C.
    1. تكملة-الخميرة ببتون-سكر العنب مرق مع 0.015٪ الأميكاسين لتجنب التلوث الجرثومي وتيسير مواصلة العد.
    2. إضافة الخميرة باستخدام 10 &# 181؛ ل التلقيح حلقة في إعداد YPD-مرق تستكمل مع الأميكاسين O / N عند 37 درجة مئوية.
    3. الخميرة الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة طاف إلى التخلص من النفايات bioharzard المناسب. ينبغي مراعاتها بيليه ملتصقة الأبيض في الجزء السفلي من أنبوب الثقافة.
    5. غسل ووقف البكتيريا مكعبات باستخدام 5 مل من برنامج تلفزيوني وvortexing لوجيزة.
    6. كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.3 للمرة الثانية لإجراء غسيل الثاني.
    7. resuspend الكرية باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني وvortexing لوجيزة.
    8. تحديد حجم اللقاح عن طريق يعول على الكريات Mallassez باستخدام مجهر القياسي في التكبير 40X.
      ملاحظة: التركيز (في كفو / مل) والحصول عليها باستخدام الصيغة التالية: (عدد من الخميرة × 10 5) / (عدد المستطيلات شبكة يعول على الكريات Mallassez).
    9. التحقق من قبل التسلسلي تخفيف وغاريتمي إلى 10 -5 و 10 -6 لتأكيد يحتوي هذا الحل 2 × 10 6 كفو / مل.
    10. لوحة على لوحات YPD أجار تستكمل مع 0.015٪ الأميكاسين.

3. الخطوط الجوية الاستعمار التي كتبها C. البيض

ملاحظة: بعد التكيف البيئي، يتم وزن الفئران مرتين في اليوم.

  1. تحت غطاء الدخان، إيداع 500 ميكرولتر من سيفوفلوران على 4 سم × 4 سم الشاش (تقنية مفتوحة انخفاض) 14.
    1. المكان على الفور الشاش على الأرض من الغرفة حوالي 750 مل الاستقراء. المكان على الفور منصة التي أثيرت شبكة فوق الشاش لتجنب الاتصال المباشر بين الحيوان والشاش.
    2. إغلاق غطاء محكم والانتظار 1-2 دقائق للسماح للنشر سيفوفلوران في الغرفة.
    3. نقل الماوس من القفص لشبكة منصة وغطاء وثيق. وينبغي أن يتحقق التخدير الخفيف مع الحفاظ التنفس التلقائي في 30-45 ثانية.
    4. رصد لنقص التوتر من خلال مراقبة فقدان المنعكس التقويمي وعند هذه النقطة الماوس يمكن إزالتها وROM مربع وتغرس.
  2. تقطير داخل الأنف (يمكن أن يؤديها في 10 ثانية من قبل مشغل المدربين).
    1. عقد الماوس بيد واحدة تقع على ظهرها مرفوعة (الشكل 4B).
    2. باستخدام السبابة، ودعم الرأس واستخدام الإبهام للحفاظ على الفك مغلقة لتجنب نخامة (الشكل 4C).
    3. كما هو موضح في الخطوة 2.3.8، تأكد من أن استعداد C. حل البيض يحتوي على 2 X10 6 كفو لكل مل ل50 ميكرولتر تغرس الحجم.
      ملاحظة: النقطة الحاسمة الثانية هي حجم تبث الشعور. وحدة تخزين أقل من 50 ميكرولتر يمكن أن يؤدي إلى الاستعمار كافية أو تقطير غير متجانس من مجرى الهواء، وهو أكبر حجم يمكن أن تسبب الغرق / الاختناق والموت.
    4. غرس الماوس داخل أنفيا التي تقترب من ماصة إلى الخياشيم.
    5. ماصة انخفاضا بنسبة 50 ميكرولتر تشكيل فقاعة تحتوي على الحل على الخياشيم، استنشاقه في وقت لاحق من قبل spontaneouslذ التنفس الماوس.
    6. مكان الماوس في منطقة الانتعاش (على سبيل المثال، قفص عارية كبير الغازية بشكل جيد مع مصباح التدفئة النفقات العامة). يجب مراقبة الفئران حتى الصحوة كاملة. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية والمنعكس التقويمي. في هذه المرحلة، ويمكن إرجاع الماوس لقفص السكن العادي.

4. P. الزنجارية يسببها العدوى الحادة الرئة

يتم وزن الفئران خلال الأيام الأربعة التالية: ملاحظة. عادة، الفئران اكتساب الوزن خلال C. الاستعمار الهوائية البيض بوساطة (الشكل 2A).

  1. إعداد تعليق يحتوي P. الزنجارية اليوم من تقطير بعد O / N النمو (القسم 2.2).
  2. تخدير لفترة وجيزة باستخدام استنشاق سيفوفلوران كما هو موضح أعلاه (القسم 3.1).
    ملاحظة: لإجراء إصابة الرئة الحادة، وأوصى عبء البكتيرية واقترح فيالجدول 1.
  3. غرس الماوس كما هو موضح أعلاه (القسم 3.2) مع إيلاء اهتمام خاص إلى الانتعاش بعد تقطير.

5. قياس مؤشر إصابة الرئة

  1. تحضير محلول يحتوي على الألبومين FITC المسمى. حقن هذا الحل 2 ساعة قبل القتل الرحيم للحيوانات.
    1. تزن 0.2 ملغ من الألبومين FITC مع المعدات المناسبة.
    2. إضافة 0.2 ملغ في 1 مل PBS. لفترة وجيزة الدوامة. إذا لم يتم استخدامها فورا، ووضع الحل في احباط لتجنب التعرض للضوء المحيط.
    3. حقن داخل peritoneally 200 ميكرولتر من FITC المسمى حل الألبومين إلى كل فأر.
  2. قتل رحيم
    1. وزن الفئران للبيانات الوزن الماضي.
    2. الموت ببطء ماوس واحدة وفقا للاستخدام المحلي الحيوانات في المبادئ التوجيهية لجنة البحوث باستخدام أحد الحقن داخل الصفاق من جرعة زائدة قاتلة من بنتوباربيتال: 300 ميكرولتر من 5.47٪ بنتوباربيتال.
    3. إزالة الماوس من القفص ويتلقى لحقن إيثال من قبل المشغل.
    4. بعد الحقن، نقل الماوس وحدها إلى قفص آخر، كانت مخبأة من أي حيوانات أخرى. مراقبة الماوس حتى غياب الحركة. تأكيد الوفاة التي كتبها غياب حركة، حركة التنفس بشكل خاص، عدم وجود النبض.
    5. أداء جمع العينات الجراحية على الحيوانات الميتة، وبالتالي دون التخدير ولا المسكنات.
  3. الجراحية جمع العينات: المرحلة الصدر.
    ملاحظة: للحفاظ على ظروف معقمة، يتم تنفيذ كل عملية جراحية باستخدام معدات معقمة في بيئة مستوى السلامة الحيوية 2.
    1. تطبيق الإيثانول على الجلد. إجراء شق الجلد خط الوسط من القص إلى منتصف البطن مع مقص. من شق خط الوسط على طول القفص الصدري على أي من الجانبين. طي الظهر الجلد على جانبي القفص الصدري لتصور القفص الصدري.
    2. إجراء شق عمودي من القفص الصدري على جانبي الصعود نحو الترقوة من أجل أن تكون قادرة على اتكأ كامل جدار الصدر الأمامي مع المؤخرةأم السماح التصور المثالي من القلب والرئتين (الشكل 5A، 5B).
    3. جمع الدم باستخدام حقنة قبل heparined التي كتبها ثقب القلب بجانب الشريان البطينين. سحب ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الحصول على ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من البلازما. ضع عينة من الدم على الجليد.
    4. إجراء شق عنق الرحم خط الوسط لتصور القصبة الهوائية (الشكل 5B و5C). تشريح بعناية لفافة حول القصبة الهوائية. وضع خياطة وراء القصبة الهوائية (الشكل 5C و5D). وفي وقت لاحق سيتم إغلاق خياطة حول الإبرة cannulating لضمان غسيل مناسب.
    5. يقثطر القصبة الهوائية باستخدام 20-G تعديل إبرة التغذية الأنبوبية (الشكل 5D و4A). ربط عقدة الجراحية حول القصبة الهوائية مقنى مع خياطة وضعت سابقا.
    6. لأداء lavages القصبات (BAL)، برفق وتدريجيا حقن ورسم 500 ميكرولتر من PBS الجليد الباردة إلى / من الرئة. ضع العينة على طم لتجنب تحلل الخلوية.
    7. كرر الخطوة 5.3.6، و 3 مرات للحصول على ما مجموعه 1500 ميكرولتر BAL السائل وحوض غسيل عينات إلى 2 مل أنبوب الطرد المركزي (الشكل 5E).
    8. إزالة الرئتين من الصدر. ضع شريحة الرئة (حجم يجب أن تتوافق مع نصف رئة واحدة أو الفص) إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وتخزينها بسرعة في - 80 ° C.
    9. ضع شريحة الرئة في أنبوب انحلال الدم وزنه قبل تحتوي على برنامج تلفزيوني لتحديد عبء البكتيرية ووضعه على الجليد.
  4. الجراحية جمع العينات: المرحلة البطن.
    1. أداء شق آخر على الجانب الأيسر من البطن. مراقبة الطحال من خلال الغشاء البريتوني.
    2. إزالة الطحال ووضعها في أنبوب انحلال الدم الثاني يحتوي على 1 مل PBS ومكان على الجليد.
  5. مؤشر إصابة الرئة
    ملاحظة: يتم تقييم السنخية-الشعرية نفاذية الغشاء عن طريق قياس FITC المسمى الألبومين تسرب من المقصورة الوعائية إلى السنخية-إينتيرستمقصورة itial.
    1. عينة من الدم الطرد المركزي والسوائل BAL لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. جمع supernatants في أنابيب الطرد المركزي الجديدة. الكريات تتوافق مع البلازما أو BAL خلايا تجنيد ويجب أن توضع على الجليد.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من كل طاف الدم (البلازما، أصفر) أو BAL طاف لوحة 96-جيدا شفافة (300 بئر ميكرولتر). وضع رقائق على لوحة اذا لم تستخدم على الفور.
    3. قياس مستويات مضان في البلازما وsupernatants بال باستخدام قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية (الإثارة، 487 نانومتر؛ الانبعاثات، 520 نانومتر).
    4. تحديد مؤشر إصابة الرئة عن طريق حساب نسبة مضان [(BAL طاف طاف / الدم) × 100].
  6. الشعبى غسيل (BAL) عدد خلايا التفاضلية.
    ملاحظة: استخدم بيليه الخلية التي تم الحصول عليها من الطرد المركزي من السوائل BAL في خطوة 5.5.1.
    1. إذا لزم الأمر، استخدام الخلايا الحمراء تحلل العازلة. إضافة 500 ميكرولتر من الخلايا الحمراء تحلل العازلة في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على سلل بيليه. دوامة لفترة وجيزة وتترك مدة 10 دقيقة على الجليد. إضافة 500 ميكرولتر PBS لوقف تحلل الخلايا الحمراء.
    2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. إزالة طاف ووقف بيليه خلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تعداد الخلايا على الكريات Mallassez. باستخدام عدادة الكريات إلى عدد الخلايا. تركيز الخلايا على شريحة مع cytospin.
    3. خلايا وصمة عار باستخدام عدة تلوين السماح تحديد الخلية وعدد (الضامة، الخلايا الليمفاوية، العدلات).
  7. الرئة عبء البكتيرية ونشر البكتيرية
    ملاحظة: لتقييم الرئة عبء البكتيرية ونشر البكتيرية والرئتين والطحال تم جمعها على التوالي وتخزينها في أنابيب انحلال الدم وزنه قبل يحتوي على 1 مل من برنامج تلفزيوني (الخطوة 5.3.9).
    1. تزن أنابيب انحلال الدم التي تحتوي على 1 مل PBS وإما الرئة أو الطحال. تجانس العينات مع الخالط الأنسجة للحصول على الخليط الرئة والطحال الخليط.
    2. إيداع 100 ميكرولتر من وطي الأنسجةgenates في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة للحصول على التخفيفات لوغاريتمي التسلسلية.
    3. لوحة اثنين من مشاركة عينات المخفف المناسب (10 -3 و 10 -2) على أي BCP أجار لP. الزنجارية أو أجار YPD-الأميكاسين تستكمل لC. البيض الرئة وتحديد عبء الطحال.
    4. احتضان لوحات O / N عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، تعداد المستعمرات على لوحات.
    5. مؤشر النتيجة لوزن الرئة للحصول على كفو في كل غرام من الرئة. أحجام العينات الرئة ليست هي نفسها، ينبغي التعبير عن النتائج في كفو في كل غرام من الرئة.
      صيغة للمؤشر هي: [كفو] س [وزن أنبوب انحلال الدم والرئة] - [وزن أنبوب انحلال الدم].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كما رأينا سابقا خلال وصف البروتوكول، تحتاج التجربة 5 أيام لاستكمال (الشكل 1: الجدول الزمني التجربة). والتمست مشغل واحد خلال الفترة السابقة كاملة من التجربة ويمكن التعامل مع العمليات تصل إلى حد أقصى قدره 10 الفئران. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الحيوانات، وهناك حاجة إلى شخصين بشكل خاص لجمع العينات الجراحية. في الواقع جميع العينات يجب جمعها في أقل من 2 ساعة لتجنب زيادة تسرب السنخية الشعرية السلبي من الألبومين FITC المسمى في الفئران الماضية.

الخطوة الأولى هي إعداد C. البيض اللقاح وتقطير داخل الأنف للحصول على الاستعمار الهوائية التي كتبها C. البيض. يتم الحصول على نموذج 4 أيام استمرار كتبها الأنف تقطير 5 × 10 5 كفو من C. البيض في الماوس (الشكل 2B). خلال هذه الأيام 4، الفئران اكتساب الوزن (الشكل 2A) وتقطير من 5X10 5 كفو لا يسبب لإصابة اونج (الشكل 2C). على الرغم من C. البيض قد تستمر حتى 4 أيام في هذا النموذج، ويقلل الحمل بعد 48 ساعة. لذلك، P. وperfomed التهاب في الرئتين الحاد الزنجارية يسببها في 48 ساعة من C. البيض المثابرة.

P. سلالة الزنجارية PAO1 هو سلالة المختبر تتسم إلى حد كبير يتألف من عامل الفوعة كبير، نوع نظام ثلاث إفراز (T3SS)، كما هو الحال في 75٪ من الرئة السريرية يعزل 15. لأسباب الأطروحات، PAO1 هو سلالة ذات الصلة في نماذج حيوانية من التهاب في الرئتين الحاد. يتم تقييم إصابة الرئة من خلال الحويصلى-capillar نفاذية تقاس تسرب البروتين من مقصورة الأوعية الدموية في مجرى الهواء التعبير عن مؤشر إصابة الرئة. الرئة يزيد الإصابة مع اللقاح (الشكل 3A). نحن هنا تقرير حركية المكون إصابة الرئة الحاد في نموذجنا الناجمة عن سلالة PAO1 (5X10 6 CFU / الماوس) (الشكل 3B-3F) وحده دون موافقة مسبقةC. albicans- فتيلة بوساطة. اعتمادا على سلالة والوقت بطبيعة الحال من طراز، واختيار P. الأولي ويناقش الزنجارية اللقاح في المقطع التالي ويقترح في الجدول 1.

استخدمت خمسة فئران لكل مجموعة. تم تحديد مؤشر الرئة الإصابة (الشكل 3B)، وعبء بكتيرية في الرئة (الشكل 3C)، وعبء البكتيريا في الطحال، مما يعكس نشر البكتيري (الشكل 3D)، BAL الخلوية (الشكل 3E) وعدد خلايا التفاضلية (الشكل 3F) كل 12 ساعة. وكانت إصابة الرئة القصوى بين 24 ساعة و 36 ساعة بعد الإصابة (الشكل 3B). أظهر عبء البكتيرية 1-تسجيل كفو / مل خفض كل 24 ساعة (الشكل 3C). نشر البكتيري التراكمي المقررة من قبل الثقافات جناسة الطحال زاد كل يوم (الشكل 3D). وأخيرا، في حين نال الخلوية في الفئران غير المصابة وتتكون بشكل رئيسي (90٪) سالضامة السنخية واو، في BAL من الفئران المصابة، تم تجنيد العدلات على نطاق واسع وأظهر عدد خلايا التفاضلية 90٪ العدلات و 10٪ الضامة والخلايا اللمفية (الشكل 3E، 3F).

الشكل 1
الشكل 1. الجدول الزمني للإصابة الرئة الحادة نموذج لاستكشاف التفاعل بوساطة المضيف بين C. البيض وP. الزنجارية.
التمثيل البياني للالإجراء بأكمله. الخطوة الأولى هي التكيف البيئي من الفئران في منشأة سكنية. الخطوة الثانية هي C. البيض بوساطة الاستعمار مجرى الهواء. وأخيرا، فإن الخطوة الثالثة هي عدوى الرئة الحاد بوساطة P. الزنجارية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


الشكل 2. C. البيض الهوائية الاستعمار.
(A، B) الفئران غرست الأنف مع 10 5 كفو C. البيض (سلالة SC5314). الفئران اكتساب الوزن خلال C. الاستعمار الهوائية البيض بوساطة (A). استعمار مجرى الهواء يمكن أن تطول لمدة 3-4 أيام مع واحد فقط تقطير الأولي. وفي دراسة سابقة، فتيلة الحصانة الفطرية يحدث بين 24 و 48 ساعة. (ن = 5 لكل مجموعة)، تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. غرست (C، D) الفئران الأنف 5 × 10 5 أو 5 × 10 6 كفو من C. البيض. مؤشر الرئة إصابة (C) المقررة من قبل السنخية نفاذية جدار الشعيرات الدموية في 24 ساعة. زيادة الوزن (D) أعرب كنسبة مئوية من الوزن الأولي (ن = 5 لكل مجموعة).تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نموذج الحادة إصابة الرئة الناجمة عن P الزنجارية.
وداخل أنفيا المصابة (A) C57BL / 6J الفئران مع الأحمال المتزايدة للP. الزنجارية (من 1 × 06 حتي 05 أكتوبر × 10 7 CFU في الماوس) (ن = 5 لكل مجموعة)، تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. يصرح باستخدامها الفئران في 24 ساعة. يتم تقييم مؤشر إصابة الرئة السنخية-الشعرية نفاذية الحاجز الذي يزيد بشكل متناسب مع العبء البكتيرية. مقارنة الرقم القياسي لإصابة الرئة التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة القديمة مع الرئة الخليط supernatants (أشرطة سوداء) والجديد جنبا إلى جنب، طريقة استخدام supernatants غسل القصبات (شريط رماديمصابون ق) (BF) الفئران داخل أنفيا مع 5 X10 6 كفو في الماوس. يصرح باستخدامها الفئران كل 12-48 ساعة لحركية نموذج الإصابة الحادة. ويتم تقييم أيضا إصابة الرئة (B)، عبء بكتيرية في الرئة (C)، وعبء البكتيرية الطحال (D)، غسل القصبات (BAL) الخلوية (E) وBAL عدد خلايا التفاضلية (F). (ن = 5) لكل مجموعة، تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. المعدات الجراحية والطريق الأنفي تقطير.
(A)   المعدات الجراحية المطلوبة لأداء نموذج الإصابة الحادة وغسل القصبات. هنا قنية القصبة الهوائية (20ترتبط G) واثنين من 1 مل المحاقن إلى لور قفل صمام 3-الطريقة. واحد حقنة لحقن الماء في الرئتين، واحدة لرسم السائل القصبات مرة أخرى للخروج من الرئتين. (B، C)   موقف الماوس في اليد لأداء تقطير داخل الأنف. في هذه الصورة، الإبهام تحت الفك يضمن الفم المغلق خلال تقطير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. الجراحة والغسل النزلة السنخ.
يتم فتح الصدر على نطاق واسع (A)، ويتم فتح القفص الصدري أفقيا لتجنب الإصابة إلى القلب (B). وبعد جمع الدم، يتم تشريح منطقة عنق الرحم لفضح القصبة الهوائية (C). يستخدم خيط تنظيف الأسنان باعتبارهايتم تمرير الخيط وراء القصبة الهوائية (C، D). ثم يتم مقنى القصبة الهوائية مع قنية 20-G مجتمعة (D) التي شنت على حقنة وصمام 3-الطريقة. وينبغي تأمين القصبة الهوائية بإحكام حول قنية عن طريق ربط عقدة الجراحية باستخدام الخيط في مكان وراء القصبة الهوائية. وأخيرا 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتغرس بلطف في الرئتين ومن ثم يتم رسم BAL برفق. (E)، غرست السائل الرئتين. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

عبء تغرس الحد الأدنى القصوى مغروس عبء
T3SS- 5 × 10 7 1 × 10 8
T3SS + 5 × 10 6 1 × 10 7
T3SS + exoU + 5 × 10 1 × 10 5

الجدول 1. P. الزنجارية قائح المستخدمة في الرئة الحاد العدوى نماذج.
تركيزات الأنف المثلى المقترحة قائح للحث على إصابة الرئة الحادة وفقا لسلالات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

النماذج الحيوانية، وخاصة الثدييات، هي مفيدة لتوضيح الآليات المعقدة للتفاعل المضيف الممرض في مجالات الحصانة. بطبيعة الحال، فإن الحاجة إلى المعلومات التي يمكن الحصول عليها فقط من النماذج الحيوانية يجب أن تكون ضرورية. خلاف ذلك، لا بد من استبدال استخدام الحيوانات عن طريق نماذج في المختبر. يوضح هذا النموذج الحيواني البصيرة التي لا يمكن إلا أن تقدمها نموذج حيواني لأن بوساطة التفاعل بين مسببات الأمراض عن طريق استجابة المضيف متعددة العناصر. الفئران المستخدمة حاليا لدراسة هذا التفاعل المضيف الممرض هم من البالغين الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 6-10 أسابيع مع استجابة مناعية ناضجة ودون تغيير. عندما تركز على الاستجابة المناعية الفطرية، ويفضل C57Bl6 / J الفئران الخلفية. لتجنب تأثير الجنس ودورة الهرمونية (خاصة هرمون الاستروجين) على الاستجابة المناعية، وبالتالي الذكور هي الخيار الأفضل. لتحقيق دلالة إحصائية، يجب أن يكون مجموعة 5 أشخاص على الأقل في نهاية التجربة، ولكن كما اقترح من قبل جميع التجربه الحيوانالمبادئ التوجيهية الكساء، ينبغي خفض عدد الحيوانات المستخدمة وصقلها إلى أدنى حد ممكن.

النقل من مربي الحيوانات لتوفير مرفق البحوث يدفع التوتر في الفئران. والنتيجة هي زيادة إفراز السيتوكينات الالتهابية التي يمكن أن تغير التجارب اللاحقة مثل بلدنا. وعلاوة على ذلك، بيئة جديدة والجديد "زملائه في قفص" تساهم في التوتر. ونتيجة لذلك، لا بد من تأقلم الفئران لمدة سبعة أيام على الأقل قبل دراسة في البيئة السكنية الجديدة. تحتوي هذه البيئة السكنية التي تخضع للرقابة، وتوفير الغذاء القياسية والمياه الإعلانية ليب، دورة اليوم / ليلة، والرطوبة المناسبة مستقرة ودرجة الحرارة.

كلا استعمار الرئة ونماذج التهاب في الرئتين تتطلب الممارسة والمهارة. تقطير يمكن أن يؤديها داخل أنفيا أو داخل tracheally. هذا الأخير هو أكثر صعوبة ويتطلب المزيد من الخبرة من خلال التدريب بسبب ارتفاع مخاطر السكتة القلبية عوز الأكسجين. في الواقع، والعلاقات العامةيتطلب ocedure لتدخله بنجاح الماوس في أقل من 15 ثانية والتخدير أعمق بالتالي المطلوبة. خيارنا من تقطير داخل الأنف هو أسهل لأداء منذ طريقة التعاطي يمكن الوصول إليه، أقل خطورة تتطلب التخدير أخف وزنا وبالتالي أكثر استنساخه.

Boutoille آخرون سبق وصفها لدينا الحاد نموذج إصابة الرئة، وخاصة تقييم إصابة الرئة من خلال قياس-السنخية الشعرية نفاذية حاجز باستخدام الألبومين FITC المسمى 16. للحد من عدد من الفئران في التجربة، وقد تم تكييف هذه الطريقة ويقترن غسل القصبات (BAL). في دراسات Boutoille وآخرون، استخدمنا المقارنة بين مضان الألبومين FITC المسمى في supernatants جناسة الرئة والدم supernatants 17.

القيام على الوجه الأكمل هذه المقارنة، ويلزم أيضا مستويات الهيموجلوبين والهيماتوكريت المستويات. وقد تم تكييف هذا الأسلوب لألوث تحليل يصاحب ذلك من استجابة المضيف عن طريق تخصيص رئة واحدة إلى التجانس وتقييم إصابة الرئة والآخر لغسل ودراسة استجابة المضيف. في الواقع، السائل BAL يمكن استخدامها لتقييم مستويات خلوى، إفراز البروتين وتجنيد خلية. يوفر التكيف لدينا المزيد من النتائج من تجربة حيوان واحد، وتقليل التكلفة والعدد المطلوب من الفئران، وخاصة عند استخدام خروج المغلوب الفئران 17 على النحو الموصى به في المبادئ التوجيهية التجارب على الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يتم الاحتفاظ جزء من الرئة في -80 ° C لأداء الكلي استخراج الحمض النووي الريبي والكمي تفاعل البلمرة المتسلسل أو تحليل نسيجية. مقارنة بين الطريقة السابقة وطريقة تكيف جديد إلى جانب BAL تظهر نتائج مماثلة (الشكل 3A) لتقييم مؤشر إصابة الرئة.

في دراسة مير وآخرون، وذلك باستخدام نفس الإجراءات، وتدفق الكريات تحليل أجريت على الخلايا BAL تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي من السوائل BAL. مماثلةأجريت nalyses على مجموع الخلايا الرئوية من الرئتين 12. في هذه الحالة، وتقييم إصابة الرئة مع الألبومين FITC المسمى لا يمكن أن يؤديها بصورة متزامنة، بسبب القطع الأثرية التي تحدثها FITC (نفس القناة من البروتين مخضر). لذلك، إذا كنت بحاجة التدفق الخلوي، يجب التخطيط التجارب وفقا لذلك.

توقيت القتل الرحيم أمر بالغ الأهمية. ويرد مدار الساعة من نموذج عدوى الرئة الحاد على مدى ساعة 72 الأولى الشكل (3). وفي هذا النموذج، وذروة من إصابة الرئة واستجابة المضيف تحدث ما بين 24 و 36 ساعة (الشكل 3). وهكذا، في لدينا تصميم تم اختيار 24 ساعة نقطة النهاية كما قراءات لمدة 3 أسباب: أولا، فمن السهل أن تنظم في المختبر، والثانية، لتجنب فقدان الفئران بسبب الوفاة بين 24 و 36 ساعة، وأخيرا، لكان رد المضيف القصوى في هذه المرحلة الزمنية.

الخطوة الأولى لدراسة التفاعل لدينا هو استعمار مجرى الهواء مع <م> C. البيض. باستخدام تقطير من 10 5 كفو في الماوس، يتم الحصول على نموذج استمرار 4 أيام دون أي إصابة الرئة. في الواقع، اكتسبت وزن الفئران على مدار الساعة لهذه المرحلة. زيادة الوزن هي مؤشر مفيد لعدم وجود إصابات في خط مع الاستعمار بدلا من العدوى. في الواقع، وزيادة الحمل الأولي (أكثر من 10 6 كفو في الماوس) إصابة الرئة الناجم عن (الشكل 2C) واستجابة المضيف الضارة إلى ما هو أبعد فتيلة، والتي فقدت الفئران حالة الوزن (الشكل 2D). على العكس من ذلك، وذلك باستخدام الحمل الأولي أصغر (على سبيل المثال 10 4 CFU في الماوس) لا يمكن الحصول على نموذج استمرار مجرى الهواء. وهكذا، للحصول على فتيلة الملحوظ الحصانة المضيفة التي وصفها مير وآخرون 12 والمعايرة من عبء الفطرية تغرس أمر بالغ الأهمية لنجاح ورصد منحنى الوزن هو مفتاح السيطرة.

مطلوب بنفس الدقة لP. الزنجارية وP. تم مسح الزنجارية بسرعة من الشعب الهوائية من قبل المضيف الاستجابة المناسبة. باستخدام الأولي P. عالية أكثر من اللازم الزنجارية يفوق قدرات دفاع المضيف أو حتى يدفع استجابة غير مناسبة وderleterious مما أدى إلى تحميل يؤدي إلى الإصابة الحادة ضخمة والموت محو كل الخلافات بين المجموعات. قيحة الأمثل للحث على إصابة حادة يعتمد على وجود نوع 3 نظام وظيفي إفراز (T3SS) وإنتاج ذيفان خارجي U، السم translocated من قبل T3SS في سيتوبلازم الخلية المضيفة. هذه الصفات سلالة محددة لهما أن ينظر في اختيار من عبء البكتيرية الأولي. واقترح أعباء البكتيرية الأولية في هذه المقالة كأمثلة على الحدود الدنيا والعليا للحث على إصابة الرئة الحادة مع T3SS سلبية أو سلالة إيجابي، والسلالات المنتجة للذيفان خارجي U أم لا (الجدول 1). عند دراسةمشاركة T3SS، سلالة لابد نمت O / N وأحيت مع متوسط ​​LB الجديد 3 ساعات قبل إعداد اللقاح للحصول على النشاط الأمثل للT3SS.

تحديد عبء البكتيريا والفطريات 24 ساعة بعد P. يتطلب التهاب في الرئتين الزنجارية يسببها اعتبارات محددة مناقشتها في هذا القسم. في الواقع، كما هو مبين، عندما تصاب الفئران مع 5 × 10 6 سلالة كفو T3SS إيجابية، وعبء بكتيرية في الرئة في 24 ساعة إرادة انخفضت إلى حوالي 1 سجل (الشكل 3C). يجب إجراء التخفيفات المسلسل من عينات حتى سجل 5 تخفيف ومطلي على لوحات BCP آجار. وفيما يتعلق C. البيض في الرئتين، في 72 ساعة، وانخفض العبء الفطرية إلى حوالي 2 سجل ويجب عينات لمطلي على YPD أجار تستكمل مع الأميكاسين لتسهيل التعرف مستعمرة. وأخيرا، تقرير نشر البكتيري يمكن تقييمها من قبل الطلاء 100 ميكرولتر من عينة الدم على BCP أجار أو الطلاء 100 ميكرولتر من الطحال حomogenates في نفس المتوسطة. وقد تم بالفعل مقارنة الطريقتين ويبدو ثقافة الطحال أن تكون أكثر دقة. في الواقع، والطحال هو العضو الذي "الفلاتر" الدم كله وربما "التركيز" والحفاظ على البكتيريا بعد أن نشر على الدم. وهكذا، الخليط الطحال تعكس نشر البكتيري النظامية خلال عدوى في الرئة الحاد مع حساسية أعلى من الدم. عينات الدم تمثل نشر البكتيري في وقت معين محدد جدا وربما لا تعكس حقا ظاهرة نشر البكتيرية ككل. لذلك يفضل الثقافات جناسة الطحال.

مؤشر إصابة الرئة هو تقييم حساسية إصابة الرئة الناجمة عن العدوى و / أو غير لائقة استجابة المضيف وتأثير العلاجات المحتملة على هذه المكونات. بالإضافة إلى ذلك، هذا في فيف س النموذج يسمح جمع عدة عينات مختلفة لدراسة استجابة المضيف. الرئة يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليلمن النسخ الجيني. يمكن أيضا أن توضع عينات الرئة إلى امتصاص العرق (PFA) لمزيد من الملاحظات النسيجية. السائل BAL يمكن استخدامها لتقييم إفراز البروتين مثل السيتوكينات الالتهابية. وأخيرا، كما نوقش أعلاه البروتوكول يمكن تكييفها لتقديم عينات للتحليل التدفق الخلوي.

أخيرا، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لmodelize C. الميكروبات albicans- تفاعل المشاركين في الالتهاب الرئوي المرتبط التنفس الصناعي مثل المكورات العنقودية الذهبية 18 أو Enterobacteriae. التكيف أخرى يمكن أن تكون الاستعمار مجرى الهواء باستخدام البكتيريا بدلا من C. البيض لmodelize التفاعل البكتيري في أمراض الرئة القيحي المزمن مثل توسع القصبات. وتحقيقا لهذه الغاية، على أن تستخدم الفئران المناعة، لإزالة بكتيريا في الفئران المختصة المناعي لا يسمح الاستعمار الهوائية الثابتة.

للتقطير، والموقف من ناحية عقد هذا الحيوان هو CRItical. كما أكدت بالفعل في القسم السابق، عندما غرس داخل أنفيا الماوس، يجب على المشغل ضمان أنه يتم إغلاق الفم تماما لتجنب نخامة من الحل. الإبهام يدعم الفك ويحافظ على الفم مغلقا أثناء إجراء تقطير بأكمله (الشكل 4B). ثم، مع جهة أخرى، وتودع ماصة على الأنف (الشكل 4C) والحل تدريجيا وبلطف تغرس دون الهواء لمنع تشكيل فقاعة. من الواضح، يجب إجراء تقطير في مستوى وزاري 2 في مجال السلامة الأحيائية.

جمع العينات يتطلب الحيوانات الصغيرة التدريب الجراحي certifed من المشغل. في كل خطوة، يجب أن توضع العينات في الثلج لتجنب تحلل الخلايا والحفاظ على البروتينات من تمسخ. يرجى ملء الأدوات الجراحية الأساسية (الشكل 4A). يجب عليهم أن تعقيمها بواسطة التعقيم قبل الاستخدام. فمن المستحسن أن مختلف مجموعات أداة جراحية استخدامها لabdominaلتر والخطوات الجراحية الصدرية، وتجنب التلوث المتبادل للعينات الرئة. وتعرض الخطوات الحاسمة مختلفة من تشريح جراحي (الشكل 5A-5E). موقف الماوس أمر بالغ الأهمية. يجب أن يجمد الحيوان شقة على انها الظهر رئيس العكس من مشغل ومباشرة. الإيثانول وينبغي أن تستخدم بحرية لالإعدادية قبل شق الأول لتجنب انتشار الشعر في عينات والتلوث الجرثومي المحتملين من الجلد. الجلد هو أوعية دموية بشكل جيد ويجب أن تراجع بعناية لتجنب النزيف (الشكل 5A).

ثم يتم متكأ القفص الصدري بعد شق الصدر الجانبي خلالها القفص الصدري ينبغي الحفاظ باستمرار في قبضة ملاقط لتجنب الإصابة إلى القلب والرئتين خلال شق. تتعرض الرئة والقلب (الشكل 5B). الرئة غير المصابة تظهر بيضاء (الشكل 5B). تشريح للمنطقة عنق الرحم يفضح القصبة الهوائية وخياطة هي سيارةوضعت efully خلف القصبة الهوائية العليا (الشكل 5C). Cannulating القصبة الهوائية يجب أن يؤديها مع الحذر. لا تستخدم قنية ذات الحجم الكبير (الحد الأقصى لحجم 20 G). A شق صغير الأمامي من القصبة الهوائية membraneous بين حلقتين الغضروفية يسمح إدخال قنية. عندما لوحظ قنية بالشفافية من خلال القصبة الهوائية فوق كارينا (الشكل 5D)، ويرتبط الخيط بإحكام حول القصبة الهوائية تأمين حولها قنية (الشكل 5E). يتم توصيل قنية إلى 3 في اتجاه الذكور صمام لور قفل مع 2 الحقن متصلة الموانئ الإناث. يحتوي على واحد حقنة الجليد الباردة PBS لغسل القصبات. والآخر هو فارغ لسحب السائل BAL. يجب chaged هذه الحقن بين المجموعات.

في الختام، فتيلة قبل الحاد نموذج إصابة الرئة هو نموذج ذات الصلة وقوية لاستكشاف التفاعلات في الجسم الحي بوساطة المضيفة بين مسببات الأمراض. استخدام الحيوانات هوالقيد الرئيسي، وينبغي أن يكون وزنه بعناية ضد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1, (1), 17-24 (2003).
  2. Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. (2012).
  3. Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160, (4), 258-266 (2012).
  4. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296, (5576), 2229-2232 (2002).
  5. Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37, (3), 1164-1166 (2009).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8, (1), 15-25 (2010).
  7. Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4, (2), 148-157 (2011).
  8. Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. (2013).
  9. Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369, (22), 2126-2136 (2013).
  10. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8, (5), 340-349 (2010).
  11. Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37, (3), 1062-1067 (2009).
  12. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82, (1), 306-315 (2013).
  13. Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. 1-33 (2009).
  14. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53, (3), 299-302 (2012).
  15. Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406, (6799), 959-964 (2000).
  16. Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35, (4), 263-271 (2009).
  17. Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189, (7), 799-811 (2014).
  18. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8, (5), 340-349 (2010).
دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter