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Immunology and Infection

Studiare comunità microbiche doi: 10.3791/53218 Published: January 13, 2016

Abstract

Studiare interazione ospite-patogeno ci permette di comprendere i meccanismi alla base della patogenicità microbica durante l'infezione. La prognosi di accoglienza dipende dal coinvolgimento di una risposta immunitaria adeguata contro l'agente patogeno 1. La risposta immunitaria è complesso e risultati di interazione degli agenti patogeni e diversi tipi cellulari del sistema immunitario o non immuni 2. Studi in vitro non possono caratterizzare queste interazioni e concentrarsi su interazioni delle cellule-patogeno. Inoltre, nelle vie respiratorie 3, in particolare nei pazienti con malattia polmonare cronica suppurativa o nei pazienti in ventilazione meccanica, le comunità polimicrobiche sono presenti e complicano interazione ospite-patogeno. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni 4, spesso isolati da campioni tracheobronchiale, e associato a gravi infezioni, soprattutto nel reparto di terapia intensiva 5. Interazioni microbiche hannostato segnalato tra questi agenti patogeni in vitro, ma l'impatto clinico di queste interazioni non è chiara 6. Per studiare le interazioni tra C. Albicans e P. aeruginosa, un modello murino di C. colonizzazione albicans vie respiratorie, seguita da una P. è stata eseguita infezione polmonare acuta aeruginosa- mediata.

Introduction

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Modelli animali, soprattutto topi, sono stati ampiamente utilizzati per esplorare risposte immunitarie contro gli agenti patogeni. Anche se l'immunità innata e acquisita diversa tra roditori e nell'uomo 7, la facilità di allevamento e lo sviluppo di fori per numerosi geni, i topi fanno un ottimo modello per studiare le risposte immunitarie 8. La risposta immunitaria è complesso e può derivare dalla interazione di un agente patogeno, la flora residente microbica e diversi immunitarie (linfociti, neutrofili, macrofagi) e non immunitarie (cellule epiteliali, cellule endoteliali) tipi cellulari 2. Studi in vitro non consentono l'osservazione queste interazioni complesse e si concentrano principalmente sulle interazioni uniche cellula-patogeno. Mentre modelli animali devono essere usati con cautela e limitate a domande molto specifiche e pertinenti, modelli murini forniscono una buona conoscenza della risposta immunitaria mammifero in vivo e possono riguardare parti di importanti quesiti clinici 7.

6. Mentre ciò che costituisce un "normale" microbioma vie aeree rimane da stabilire, le comunità residenti sono spesso polimicrobiche, e provengono da diverse fonti ecologiche. I pazienti con malattia suppurativa cronica polmonare (fibrosi cistica, bronchectasis) o pazienti in ventilazione meccanica presentano una particolare flora dovuta alla colonizzazione delle vie aeree da parte di microrganismi dell'ambiente acquisite 9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni 5, spesso isolata insieme da campioni tracheobronchiali , e responsabile di una grave infezione opportunistica in questi pazienti, in particolare nel reparto di terapia intensiva (ICU) 4.

L'isolamento di questi microrganismi durante polmonite acuta nei risultati di terapia intensiva in trattamento antimicrobico contro P. aeruginosa blievito ut non sono di solito considerato patogeno in questo sito 5. le interazioni in vitro tra P. aeruginosa e C. albicans sono state ampiamente riportate e ha dimostrato che questi microrganismi possono influenzare la crescita e la sopravvivenza di loro ma studi non avrebbero potuto concludere se la presenza di C. albicans è dannosa o benefica per l'host 10. Modelli di topo sono stati sviluppati per affrontare questa rilevanza di P. aeruginosa e C. albicans in vivo, ma l'interazione tra i microrganismi non era il punto chiave. In effetti, il modello è stato istituito per valutare il coinvolgimento di C. albicans in risposta immunitaria, e il risultato.

Un modello precedente stabilito dalla Roux et al già utilizzato un colonizzazione iniziale con C. albicans seguito da un'infezione polmonare acuta indotta da P. aeruginosa. Usando il loro modello, gli autori hanno trovato un ruolo deleterio di prior C. albicans colonizzazione da 11. Tuttavia Roux et al ha utilizzato un carico elevato di C. albicans nel loro modello con 2 x 10 6 CFU / topo durante 3 giorni consecutivi. Abbiamo stabilito un modello di 4 giorni di C. albicans colonizzazione delle vie aeree, o almeno la persistenza senza danno polmonare, in questo modello C. albicans è stato recuperato fino a 4 giorni dopo una singola instillazione di 10 5 CFU per mouse (Figura 2B) 12,13. Dopo 4 giorni, è stata osservata alcuna evidenza di reclutamento di cellule infiammatorie, la produzione di citochine infiammatorie né danno epiteliale. A 24 - 48 ore, in presenza di C. picco albicans, anche se è stata osservata una risposta immunitaria innata cellulare e citochine, non vi era alcuna evidenza di danno polmonare. Sorprendentemente, i topi così colonizzato con C. albicans 48 ore prima endonasale instillazione di P. aeruginosa era attenuato infezione rispetto ai topi con P. infezione aeruginosa da solo. ioel resto, i topi esposti danno polmonare minore e una diminuzione della carica batterica 12,13.

Diverse ipotesi potrebbe spiegare questo effetto benefico della colonizzazione prima con C. albicans su P. aeruginosa mediata infezione polmonare acuta. In primo luogo, un cross-talk interspecie che coinvolge ogni microrganismi sistemi quorum sensing, il P. basato homoserinelactone- Sistema aeruginosa e la base farnesolo-C. Sistema albicans, sono stati valutati. Second, C. albicans agisce come bersaglio "esca" per P. aeruginosa deviare patogeno da cellule epiteliali polmonari è stata studiata. Entrambe le ipotesi sono state invalidate (dati non pubblicati). La terza ipotesi è quella di un "priming" del sistema immunitario innato da C. albicans responsabile di una successiva risposta innata maggiore contro P. aeruginosa. Quest'ultima ipotesi è stata confermata. Infatti C. colonizzazione albicans ha portato ad un adescamento di immunità innata through IL-22, secreta principalmente dalle cellule linfoidi innate, con conseguente aumento della clearance batterica e riduce il danno polmonare 12.

In conclusione, il padrone di casa è un attore centrale nell'interazione tra microrganismi che modulano la risposta immunitaria innata e che coinvolgono diversi tipi di cellule infiammatorie. Mentre queste interazioni immunitario complessi possono essere sezionato in vitro le ipotesi iniziali possono essere forniti unicamente da appropriati modelli in vivo. Il protocollo che segue fornisce un esempio di studio in vivo del patogeno host-mediata, che può essere adattato per altri microrganismi.

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Protocol

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Il comitato regionale etico regionali per esperimenti su animali ha approvato questo metodo, in accordo con cura nazionale e internazionale degli animali e l'uso di linee di ricerca in fase di sperimentazione.

1. Raccolta dei campioni

  1. Conservazione del campione
    1. Raccogliere tutti i campioni e immediatamente conservare a - 20 ° C o su ghiaccio fino magazzini frigoriferi per evitare il deterioramento. Posizionare fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ghiaccio per migliorare lavaggi bronco-alveolare (BAL) di prestazioni.
  2. Chirurgia
    1. Sterilizzare tutti apparecchi chirurgici in autoclave.
      NOTA: Se possibile, si consiglia di utilizzare due diversi tipi di strumenti per i passaggi addominale e toracica per evitare la contaminazione incrociata. Attrezzature dissezione richiesto è dettagliata in figura 4A

2. I topi, batteriche e lievito Ceppi

  1. Topi Casa in conformità con l'uso locale di animali in reDirettive del comitato di ricerca in un rack ventilato senza superiore a 5 topi per gabbia, con cibo e acqua ad lib, in una struttura alloggiativa livello di biosicurezza 2 a causa dell'uso di livello di biosicurezza 2 microrganismi: P. aeruginosa e C. albicans.
  2. Mantenere i ceppi batterici a -80 ° C in 40% glicerolo medio.
    1. Aggiungere i batteri direttamente dal magazzino congelato in provetta contenente 3 ml di sterile Luria-Bertani brodo usando un ciclo inoculazione 10 ml. Lasciare O / N a 37 ° C con scuotimento orbitale (400 rpm) il giorno prima instillazione.
    2. Batteri Harvest per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min.
    3. Aspirare il surnatante in un appropriato smaltimento dei rifiuti a rischio biologico chiuso. Osservare bianco pellet aderenti al fondo della provetta.
    4. Lavare e di sospendere il pellet con 5 ml di PBS.
    5. Ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3 una seconda volta per eseguire un secondo lavaggio.
    6. Risospendere i batteri pellet con 1 ml di PBSe breve vortex.
    7. Determinare la densità di inoculo con densitometro ottico a 600 nm utilizzando un misuratore di densità ottica. Una densità di 0,9 corrisponde a 10 9 CFU / ml per PAO1, diluire conseguenza.
      NOTA: Questo risultato deve essere ottenuto per ogni ceppo utilizzato determinando la densità di diluizioni successive di un inoculo calibrato.
    8. Verificare l'inoculo per diluizioni logaritmiche seriali e piastra 100 ml di ogni diluizione su agar viola bromocresolo (BCP) piatti e cultura O / N. Somministrare ogni topo intranasale 50 microlitri della soluzione contenente 1 x 10 8 al 2 x10 8 CFU per ml (5 x 10 6 al 1 x10 7 CFU per topo).
  3. Usa C. albicans SC5314 come un ceppo di riferimento. Conservare il ceppo nel 40% medio glicerolo a -80 ° C.
    1. Supplemento Lievito-peptone-destrosio brodo con 0,015% amikacina per evitare la contaminazione batterica e facilitare ulteriormente conteggio.
    2. Aggiungete il lievito utilizzando 10 &# 181; l 'inoculazione del ciclo in preparato YPD-brodo integrato con amikacina O / N a 37 ° C.
    3. Lievito raccolta per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min.
    4. Rimuovere il surnatante in un appropriato smaltimento dei rifiuti bioharzard. Bianco pellet aderente deve osservare nel fondo della provetta.
    5. Lavare e sospendere i batteri pellet con 5 ml di PBS e breve vortex.
    6. Ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3 una seconda volta per eseguire un secondo lavaggio.
    7. Risospendere il pellet con 1 ml di PBS e breve vortex.
    8. Determinare la dimensione dell'inoculo contando su un hematocytometer Mallassez utilizzando un microscopio standard al 40x.
      NOTA: Concentrazione (in CFU / ml) è ottenuto utilizzando la seguente formula: (numero di lievito 5 x 10) / (numero di rettangoli griglia contati sulla hematocytometer Mallassez).
    9. Verifica mediante diluizione logaritmica seriale 10 -5 e 10 -6 confermare che soluzione contiene 2 x 10 6 CFU / ml.
    10. Piatto su piastre di agar YPD integrato con 0,015% amikacina.

3. Airways colonizzazione di C. albicans

NOTA: Dopo adattamento ambientale, i topi sono pesate due volte al giorno.

  1. Sotto cappa, deposito 500 ml di sevoflurano SU UN 4 cm x 4 cm di garza (tecnica open-drop) 14.
    1. Immediatamente collocare la garza sul pavimento di una camera di circa 750 ml di induzione. Porre immediatamente una piattaforma maglia sollevata sopra la garza per evitare il contatto diretto tra l'animale e la garza.
    2. Chiudere coperchio ermetico e aspettare 1-2 minuti per consentire la diffusione di Sevorane nella camera.
    3. Trasferire il mouse dalla gabbia a maglie piattaforma e chiudere il coperchio. Anestesia leggera con la respirazione spontanea conservato dovrebbe essere realizzato in 30-45 secondi.
    4. Monitor per ipotonia osservando perdita del riflesso di raddrizzamento a questo punto il mouse può essere rimosso fRom la scatola e instillato.
  2. Instillazione intranasale (può essere eseguita in 10 secondi da un operatore qualificato).
    1. Tenete il mouse con una sola mano situato sul dorso tenuto in posizione verticale (Figura 4B).
    2. Usando il dito indice, sostenere la testa e usare il pollice per mantenere la mascella chiusa per evitare espettorazione (Figura 4C).
    3. Come descritto al punto 2.3.8, in modo che il preparato C. soluzione albicans contiene 2 x10 6 CFU per ml per un volume di 50 ml instillato.
      NOTA: Il secondo punto critico è il volume infuso. Un volume inferiore a 50 ml potrebbe tradursi in una colonizzazione insufficiente o instillazione disomogeneo di vie aeree, un volume maggiore può indurre annegamento / soffocamento e di morte.
    4. Instillare il mouse intra-nasale avvicinando la pipetta alle narici.
    5. Pipettare una goccia 50 ml formando una bolla contenente la soluzione sulle narici, poi inalato dal spontaneously del mouse respirazione.
    6. Posto del mouse in una zona di recupero (ad esempio, una grande gabbia nuda ben aerato con una lampada di riscaldamento in testa). I topi deve essere monitorato fino a completa risveglio. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e riflesso di raddrizzamento. A questo punto, il mouse può essere restituito a un normale gabbia di alloggiamento.

4. P. aeruginosa indotta acuta polmonare Infezione

NOTA: I topi sono pesati durante i quattro giorni successivi. Normalmente, i topi aumentano di peso durante C. colonizzazione delle vie aeree albicans mediata (Figura 2A).

  1. Preparare la sospensione contenente P. aeruginosa il giorno della instillazione dopo O / N crescita (sezione 2.2).
  2. Anestetizzare brevemente utilizzando inalato Sevoflurane come descritto in precedenza (punto 3.1).
    NOTA: Per eseguire l'infezione polmonare acuto, raccomandato carica batterica sono suggeriti inTabella 1.
  3. Instillare il mouse come descritto in precedenza (punto 3.2), con particolare attenzione al recupero post-instillazione.

5. Misura di Lung Injury Index

  1. Preparare una soluzione contenente albumina coniugati con fluoresceina. Iniettare questa soluzione 2 ore prima l'eutanasia degli animali.
    1. Pesare 0,2 mg di albumina-FITC con l'attrezzatura adeguata.
    2. Aggiungere 0,2 mg in 1 ml di PBS. Brevemente vortice. Se non utilizzato immediatamente, mettere la soluzione in stagnola per evitare l'esposizione alla luce ambientale.
    3. Iniettare intra-peritoneally 200 ml di soluzione di albumina coniugati con fluoresceina per ogni mouse.
  2. Eutanasia
    1. Pesare i topi per gli ultimi dati di peso.
    2. L'eutanasia un singolo mouse secondo l'uso locale di animali nelle linee guida del comitato di ricerca che utilizzano una iniezione intraperitoneale di overdose letale di pentobarbital: 300 ml di 5,47% pentobarbital.
    3. Rimuovere il mouse dalla gabbia e riceve liniezione Ethal dall'operatore.
    4. Dopo l'iniezione, trasferire il mouse solo a un'altra gabbia, nascosto da tutti gli altri animali. Osservare il mouse fino assenza di movimento. Confermare la morte è per mancanza di movimento, il movimento particolare delle vie respiratorie, la mancanza di impulsi.
    5. Eseguire la raccolta di campioni chirurgici su animali morti, quindi senza anestesia né analgesici.
  3. Raccolta del campione chirurgica: fase toracica.
    NOTA: Per mantenere condizioni di sterilità, tutta la chirurgia viene eseguita utilizzando materiale sterile in un ambiente di livello di biosicurezza 2.
    1. Applicare etanolo sulla pelle. Eseguire una incisione cutanea mediana da sterno a metà addome con le forbici. Dalla linea mediana incise lungo la gabbia toracica su entrambi i lati. Ripiegare la pelle su entrambi i lati del torace per visualizzare la gabbia toracica.
    2. Eseguire un'incisione verticale della gabbia toracica ai lati salendo verso clavicole per poter reclinare l'intera parete anteriore petto con la poppaum permettendo la visualizzazione perfetta del cuore e dei polmoni (Figura 5A, 5B).
    3. Raccogliere il sangue con una siringa pre-heparined perforando il cuore accanto all'arteria interventricolare. Prelevare un minimo di 500 microlitri di ottenere almeno 100 ml di plasma. Posizionare il campione di sangue su ghiaccio.
    4. Eseguire un'incisione mediana cervicale per visualizzare la trachea (Figura 5B e 5C). Sezionare con cura la fascia intorno alla trachea. Collocare una sutura dietro la trachea (Figura 5C e 5D). Successivamente la sutura sarà chiusa intorno all'ago cannulating per garantire il corretto lavaggio.
    5. Cateterizzarla trachea utilizzando l'ago 20-G modificato gavage (Figura 5D e 4A). Un nodo chirurgico intorno alla trachea cannulato con la sutura precedentemente posizionato.
    6. Per eseguire lavaggi broncoalveolare (BAL), dolcemente e progressivamente iniettare e disegnare 500 ml di PBS ghiacciato nel / dal polmone. Mettere il campione sul ice per evitare lisi cellulare.
    7. Ripetere il passaggio 5.3.6, 3 volte per ottenere un totale di 1.500 campioni microlitri BAL fluido e piscina di lavaggio in un tubo da centrifuga da 2 ml (Figura 5E).
    8. Rimuovere i polmoni dal petto. Collocare un segmento polmonare (dimensione dovrebbe corrispondere alla metà di un polmone o un lobo) in 1,5 ml provetta da centrifuga e memorizzare rapidamente a - 80 ° C.
    9. Posizionare un segmento del polmone in un tubo emolisi pre-pesato contenente PBS per determinare la carica batterica e posizionarlo sul ghiaccio.
  4. Raccolta del campione chirurgica: fase addominale.
    1. Eseguire un'altra incisione sul lato sinistro dell'addome. Osservare la milza attraverso il peritoneo.
    2. Rimuovere la milza e posto in un secondo tubo emolisi contenente 1 ml di PBS e posto sul ghiaccio.
  5. Indice danno polmonare
    NOTA: la membrana alveolo-capillare permeabilità viene valutata misurando coniugati con fluoresceina-albumina perdita dal compartimento vascolare al alveolo-interstVano itial.
    1. Centrifugare campione di sangue e fluido BAL per 10 min a 1500 x g. Raccogliere i surnatanti in nuove provette. Il pellet corrispondono a plasmacellule o BAL assunti e dovrebbero essere immessi sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 100 ml di ogni surnatante del sangue (plasma, giallo) o BAL surnatante in una piastra a 96 pozzetti trasparente (300 pozzi microlitri). Posizionare un foglio sulla piastra, se non utilizzato immediatamente.
    3. Misurare i livelli di fluorescenza nel plasma e sovranatanti BAL utilizzando un lettore a fluorescenza micropiastre (eccitazione, 487 nm, emissione, 520 nm).
    4. Determinare l'indice di danno polmonare calcolando il rapporto di fluorescenza [(BAL surnatante surnatante / sangue) x 100].
  6. Lavaggio broncoalveolare (BAL) conta cellulare differenziale.
    NOTA: utilizzare il pellet cellulare ottenuto dalla centrifugazione di BAL al punto 5.5.1.
    1. Se necessario, utilizzare un tampone di lisi rosso-cellulare. Aggiungere 500 pl di tampone di lisi eritrociti nel tubo da centrifuga contenente il cell pellet. Brevemente vortex e lasciare 10 minuti in ghiaccio. Aggiungere 500 microlitri di PBS per fermare lisi rosso-cellulare.
    2. Celle di raccolta per centrifugazione per 10 min a 1500 x g. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS sterile. Enumerare le cellule su un hematocytometer Mallassez. Utilizzando un emocitometro Conteggio di celle. Concentratevi cellule su un vetrino con un cytospin.
    3. Cellule macchia con kit di colorazione che consenta l'identificazione delle cellule e la conta (macrofagi, linfociti, dei neutrofili).
  7. Polmone carica batterica e la diffusione batterica
    NOTA: Per valutare polmone carica batterica e la diffusione di batteri, i polmoni e la milza sono stati, rispettivamente, raccolto e conservato in provette pre-pesati emolisi contenenti 1 ml di PBS (fase 5.3.9).
    1. Pesare i tubi emolisi contenenti 1 ml di PBS e sia polmonari o milza. Omogeneizzare i campioni con un omogeneizzatore tessuto per ottenere omogenati polmonari e omogenati milza.
    2. Deposita 100 ml di homo tessutogenates in provette contenenti 900 ml di PBS sterile per ottenere diluizioni logaritmiche seriali.
    3. Piastra le ultime due campioni diluiti appropriati (10 -3 e 10 -2) su entrambi BCP-agar per P. aeruginosa o agar YPD-amikacina-integrato per C. albicans polmone e della milza determinazione degli oneri.
    4. Incubare le piastre O / N a 37 ° C. Il giorno seguente, enumerare le colonie su piastre.
    5. Indice il risultato al peso del polmone per ottenere un CFU per grammo di polmone. Dimensioni del campione polmone non sono gli stessi, i risultati sono espressi in CFU per grammo di polmone.
      Formula per l'indice è: [CFU] x [peso del tubo emolisi e polmoni] - [peso del tubo emolisi].

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Representative Results

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Come visto in precedenza durante la descrizione del protocollo, l'esperimento ha bisogno di 5 giorni a completare (Figura 1: esperimento temporale). Un operatore viene sollecitato durante l'intera esecuzione dell'esperimento e può gestire i processi fino ad un massimo di 10 topi. Se sono necessari più animali, sono necessarie due persone in particolare per la raccolta del campione chirurgico. In effetti tutti i campioni devono essere raccolti in meno di 2 ore al fine di evitare un aumento della alveolo-capillare passivo fuoriuscita di albumina marcata con FITC negli ultimi topi.

Il primo passo è la preparazione di C. albicans inoculo e instillazione intra-nasale per ottenere la colonizzazione delle vie aeree di C. albicans. Un modello 4 giorni-persistenza è ottenuto intranasale instillazione di 5 x 10 5 CFU di C. albicans per mouse (Figura 2B). Durante questi 4 giorni, i topi aumento di peso (Figura 2A) e instillazione di 5x10 5 CFU non induce llesioni ung (Figura 2C). Sebbene C. albicans può persistere fino a 4 giorni in questo modello, carico diminuisce dopo 48 ore. Pertanto, P. infezione polmonare acuta indotta aeruginosa è perfomed a 48 ore di C. la persistenza albicans.

P. aeruginosa PAO1 ceppo è un ceppo di laboratorio in gran parte caratterizzato comprende il fattore di virulenza maggiore, il tipo di sistema a tre secrezione (T3SS), come nel 75% dei polmoni isolati clinici 15. Per motivi di tesi, PAO1 è un ceppo rilevante in modelli animali di infezione polmonare acuta. Danno polmonare è valutata attraverso alveolo-capillare permeabilità misurato da perdita di proteine ​​dal compartimento vascolare nelle vie aeree espressa come indice danno polmonare. Lesione polmonare aumenta con l'inoculo (Figura 3A). Qui riportiamo la cinetica della componente danno polmonare acuto del nostro modello indotta da sforzo PAO1 (5x10 6 CFU / mouse) (Figura 3B-3F) da solo e senza alcunC. albicans- adescamento mediata. A seconda del ceppo e tempo corso del modello, la scelta del primo P. aeruginosa inoculo è discusso nella sezione successiva e viene suggerito nella Tabella 1.

Sono stati utilizzati Cinque topi per gruppo. Indice polmone lesioni (figura 3B), carica batterica nel polmone (Figura 3C), carica batterica nella milza, che riflette la diffusione batterica (Figura 3D), BAL cellularità (Figura 3E) e conta delle cellule differenziale (figura 3F) sono stati determinati ogni 12 hr. Danno polmonare è massima tra le 24 ore e 36 ore dopo l'infezione (Figura 3B). Carica batterica ha mostrato un 1-log CFU / ml diminuire ogni 24 ore (Figura 3C). Diffusione batterica cumulativo valutata da culture omogenato milza aumentata ogni giorno (Figura 3D). Infine, Mentre BAL cellularità nei topi non infetti è composta principalmente (90%) of macrofagi alveolari, in BAL di topi infettati, i neutrofili sono stati ampiamente reclutati e conta cellulare differenziale ha mostrato il 90% e 10% di neutrofili e linfociti (macrofagi figura 3E, 3F).

Figura 1
Figura 1. Cronologia della lesioni polmonari acute modello per esplorare interazione ospite-mediata tra C. albicans e P. aeruginosa.
Rappresentazione grafica di tutta la procedura. Il primo passo è l'adattamento ambientale dei topi della struttura alloggiativa. Il secondo passo è C. albicans mediato colonizzazione delle vie aeree. Infine, il terzo passo è l'infezione polmonare acuto mediata da P. aeruginosa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 2. C. albicans vie aeree colonizzazione.
(A, B) Mouse sono intranasale instillato con 10 5 CFU C. albicans (ceppo SC5314). I topi aumentano di peso durante C. colonizzazione delle vie aeree albicans mediata (A). La colonizzazione delle vie respiratorie può essere prolungata di 3-4 giorni con un solo instillazione iniziale. In uno studio precedente, adescamento di immunità innata avviene tra 24 e 48 ore. (n = 5 per gruppo), le barre di errore rappresentano medie ± SD. (C, D) i topi sono intranasale instillati 5 x 10 5 o 5 x 10 6 CFU di C. albicans. Indice polmone lesioni (C) valutati da alveolare permeabilità barriera capillare in 24 ore. L'aumento di peso (D) espressa come percentuale del peso iniziale (n = 5 per gruppo).Barre di errore rappresentano mezzi ± DS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Modello di lesioni polmonari acute indotte da Pseudomonas aeruginosa.
(A) C57Bl / 6J sono intra-nasale infettato con carichi crescenti di P. aeruginosa (da 1 x 10 6 a 5 x 10 7 CFU per il mouse) (n = 5 per gruppo), barre di errore rappresentano medie ± SD. I topi sono eutanasia a 24 ore. Indice danno polmonare è valutata alveolo-capillare permeabilità barriera che aumenta proporzionalmente con carica batterica. Confronto dell'indice di danno polmonare ottenuto con metodo antico con il polmone omogenati supernatanti (barre nere) e nuovo metodo combinato utilizzando surnatanti di lavaggio broncoalveolare (barra grigias) (BF) i topi sono intra-nasale infettato con 5 x10 6 CFU per mouse. I topi sono eutanasia ogni 12-48 ore per acuti cinetica modello lesioni. Sono valutati anche danni polmonari (B), carica batterica polmonare (C), carica batterica della milza (D), lavaggio broncoalveolare (BAL) cellularità (E) e BAL conta cellulare differenziale (F). (n = 5) per gruppo, le barre di errore rappresentano medie ± SD. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. attrezzature chirurgiche e intranasale instillazione.
(A)   Apparecchi chirurgici costretto a compiere un modello di lesioni acute e lavaggio broncoalveolare. Qui tracheale cannula (20G) e le due 1 ml siringhe sono collegati ad una valvola a 3 vie Luer-lock. Una siringa per iniettare acqua nei polmoni, uno a disegnare il liquido broncoalveolare di nuovo fuori dai polmoni. (B, C)   Posizione del mouse nella mano per eseguire l'instillazione intra-nasale. In questa foto, il pollice sotto la mandibola assicura la bocca chiusa durante l'instillazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Chirurgia e lavaggio broncoalveolare.
Il torace è ampiamente aperta (A), e la gabbia toracica si apre lateralmente per evitare lesioni al cuore (B). Dopo la raccolta di sangue, la zona cervicale è sezionato per mostrare la trachea (C). Filo interdentale è utilizzato comesutura e viene fatto passare dietro la trachea (C, D). La trachea viene cannulata con la cannula 20-G combinato (D) montato sulla siringa e valvola a 3 vie. La trachea deve essere ben fissata attorno alla cannula legando un nodo chirurgico utilizzando la sutura in posizione dietro la trachea. Infine 500 microlitri di PBS sono dolcemente instillato nei polmoni e quindi il BAL viene delicatamente tirato fuori. (E) i polmoni Fluid-instillato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Minimal Burden Instillato Massima Instillato Burden
T3SS- 5 x 10 7 1 x 10 8
T3SS + 5 x 10 6 1 x 10 7
T3SS + exoU + 5 x 10 1 x 10 5

Tabella 1. P. aeruginosa inoculi Utilizzato in Acute Lung modelli di infezione.
Le concentrazioni ottimali intranasale suggerite di inoculi per indurre lesioni polmonari acute secondo ceppi.

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I modelli animali, in particolare i mammiferi, sono utili per chiarire i meccanismi complessi di interazione ospite-patogeno nei campi di immunità. Naturalmente, la necessità di informazioni ottenibili solo dai modelli animali devono essere essenziale; altrimenti, l'uso di animali deve essere sostituito da modelli in vitro. Questo modello animale illustra l'intuizione che può essere fornita solo da un modello animale in quanto l'interazione tra gli agenti patogeni è mediata da una risposta host multi-componente. I topi attualmente utilizzati per studiare questa interazione ospite-patogeno sono i giovani adulti di età compresa tra 6 a 10 settimane, con una risposta immunitaria maturo e inalterata. Quando concentrandosi sulla risposta immunitaria innata, sfondo C57Bl6 / J topi sono preferiti. Per evitare un effetto di sesso e ciclo ormonale (soprattutto estrogeni) sulla risposta immunitaria, maschi sono quindi la scelta migliore. Per raggiungere la significatività statistica, gruppi devono avere almeno 5 individui alla fine dell'esperimento, ma come suggerito da tutti sperimen animalilinee guida zione, il numero di animali utilizzati dovrebbero essere ridotti e raffinato allo stretto necessario.

Trasporto dal selezionatore fornire gli animali al centro di ricerca induce lo stress nei topi. La conseguenza è un aumento della secrezione di citochine infiammatorie che possono alterare gli esperimenti successivi come la nostra. Inoltre, un nuovo ambiente e nuovi "compagni di gabbia" contribuiscono allo stress. Di conseguenza, i topi devono essere acclimatati per almeno sette giorni prima a studiare nel loro nuovo ambiente abitazioni. Questo ambiente custodia deve essere controllato, fornendo cibo standard e acqua a volontà, un ciclo giorno / notte, e adeguata l'umidità e la temperatura stabile.

Sia la colonizzazione del polmone e modelli di infezione polmonare richiedono pratica e destrezza. Instillazione può essere eseguita intra-nasale o intra-tracheally. Quest'ultimo è più difficile e richiede maggiore esperienza attraverso la formazione a causa di un elevato rischio di arresto cardiaco anossico. Infatti, il procedure richiede di intubare con successo un topo in meno di 15 secondi e quindi richiesti anestesia più profondi. La nostra scelta di instillazione intra-nasale è più facile da eseguire in quanto la via di somministrazione è accessibile, anestesia richiede meno rischiosa leggero ed è quindi più riproducibile.

Boutoille et al già descritto il nostro modello di danno polmonare acuto, in particolare la valutazione del danno polmonare attraverso la misurazione alveolo-capillare permeabilità barriera utilizzando albumina coniugati con fluoresceina 16. Per ridurre il numero di topi per esperimento, questo metodo è stato adattato ed accoppiato con lavaggio broncoalveolare (BAL). Negli studi di Boutoille et al, abbiamo utilizzato il confronto tra la fluorescenza di albumina marcata con FITC nei sopranatanti omogenati di polmone ei surnatanti sangue 17.

Per eseguire completamente questo confronto, sono necessari anche i livelli di emoglobina e livelli di ematocrito. Questo metodo è stato adattato per permesso fumarew l'analisi contemporanea di risposta dell'ospite dedicando un polmone di omogeneizzazione e valutazione del danno polmonare e l'altro per il lavaggio e lo studio della risposta dell'ospite. Infatti, BAL può essere utilizzato per valutare i livelli di citochine, proteine ​​e secrezione di reclutamento di cellule. Il nostro adattamento fornisce maggiori risultati da un esperimento animale singolo, riducendo i costi e il numero di topi, in particolare quando si utilizzano topi knock-out 17 come raccomandato dalle linee guida di sperimentazione animale. Inoltre, una parte del polmone viene mantenuta a -80 ° C per eseguire l'estrazione di RNA totale e la reazione a catena della polimerasi quantitativa o analisi istologica. Confronto tra il metodo precedente e il nuovo metodo adattato accoppiato con BAL mostra risultati comparabili (Figura 3A) per valutare index danno polmonare.

Nello studio di Mear et al, usando le stesse procedure, citofluorimetro analisi è stata effettuata su cellule BAL ottenute mediante centrifugazione del liquido BAL. Un similenalyses sono stati eseguiti su cellule polmonari totale dai polmoni 12. In questo caso, la valutazione danno polmonare con albumina marcata con FITC non può essere eseguita contemporaneamente, a causa di artefatti indotti da FITC (stesso canale di proteina fluorescente verde). Pertanto, se è richiesta la citometria a flusso, gli esperimenti devono essere pianificate di conseguenza.

I tempi di eutanasia è critica. Un decorso del modello di infezione polmonare acuto rispetto al primo 72 hr è presentato Figura 3. In questo modello, l'apice del danno polmonare e risposta dell'ospite avviene tra 24 e 36 ore (Figura 3). Così, nel nostro disegno del punto finale 24 ore è stato scelto come un visualizzatore per 3 motivi: in primo luogo, è facile organizzare in laboratorio, secondo, per evitare perdite di topi causa di mortalità tra 24 e 36 ore, e, infine, perché risposta dell'ospite era massima a questo punto di tempo.

Il primo passo del nostro studio di interazione è la colonizzazione delle vie aeree con <em> C. albicans. Utilizzando un instillazione di 10 5 CFU per topo, un modello di persistenza 4 giorni viene ottenuto senza alcun danno polmonare. In realtà, i topi sono aumentati di peso nel corso del tempo questa fase. L'aumento di peso è un indicatore utile della assenza di lesioni in linea con la colonizzazione in contrapposizione alle infezioni. Infatti, un aumento del carico iniziale (over 10 6 CFU per topo) danno polmonare indotta (Figura 2C) e un deleterio host-risposta ben oltre priming, nel qual caso topi hanno perso peso (Figura 2D). Al contrario, con un carico iniziale più piccola (ad esempio 10 4 CFU per topo) un modello di persistenza vie aeree non poteva essere ottenuto. Così, per ottenere l'innesco osservata dell'immunità ospitante descritto da Mear et al 12, la calibrazione della carica fungina instillato è fondamentale per il successo e monitorare la curva del peso è un controllo chiave.

È richiesta la stessa precisione per P. aeruginosa e P. aeruginosa viene rapidamente eliminato dalle vie aeree da un adeguato host-risposta. L'utilizzo di un troppo alto iniziale P. aeruginosa supera le capacità di difesa ospite o addirittura induce una risposta inappropriata e derleterious conseguente carico porta alla massiccia danno acuto e la morte cancellando tutti differenze tra i gruppi. L'inoculo ottimale per indurre lesione acuta dipende dalla presenza di un tipo-3 sistema funzionale secrezione (T3SS) e la produzione di esotossina U, una tossina traslocato dal T3SS nel citoplasma della cellula ospite. Questi due attributi specifici del ceppo devono essere considerati nella scelta della carica batterica iniziale. Oneri batteriche iniziali sono suggerite in questo articolo come esempi di limiti inferiori e superiori per indurre lesioni polmonari acute con T3SS negativo o ceppo positivo, e ceppi produttori di esotossina U o meno (Tabella 1). Quando si studiacoinvolgimento di T3SS, sforzo deve essere coltivato O / N e riproposta con nuovo mezzo LB 3 ore prima della preparazione dell'inoculo per ottenere attività ottimale di T3SS.

La determinazione della carica batterica e fungina 24 ore dopo P. infezione polmonare indotta aeruginosa richiede considerazioni specifiche descritte in questa sezione. Infatti, come illustrato, quando i topi sono infettati con il 5 x ceppo 10 6 CFU T3SS-positivo, carica batterica nei polmoni a 24 ore volontà diminuito di circa 1 log (Figura 3C). Diluizioni seriali dei campioni devono essere effettuate fino a diluizione 5-log e placcato su piastre di agar-BCP. Per quanto riguarda C. albicans nei polmoni, a 72 ore, carica fungina è scesa a circa il 2 log e campioni devono essere placcati in YPD-agar integrato con amikacina per facilitare l'identificazione delle colonie. Infine, la determinazione di diffusione batterica può essere valutata placcatura 100 l di campione di sangue su BCP-agar o placcatura 100 ml di spleen homogenati sullo stesso mezzo. I due metodi sono stati già stati confrontati e la cultura della milza sembra essere più precisi. In effetti, la milza è un organo che "filtri" di sangue intero e può "concentrato" e conservare i batteri dopo aver diffuso sul sangue. Così, omogenati milza riflettono la diffusione sistemica batterica durante l'infezione polmonare acuto con una sensibilità superiore a quella del sangue. I campioni di sangue rappresentano diffusione batterica in un dato tempo molto specifico e possono non riflettere veramente il fenomeno della diffusione batterica nel suo complesso. Pertanto culture omogenato milza sono preferiti.

Indice danno polmonare è una valutazione sensibile del danno polmonare dovuta a infezione e / o risposta dell'ospite inappropriata e l'effetto di eventuali terapie per dette componenti. Inoltre, questo viv o modello permette la raccolta di diversi campioni diversi per studiare risposta dell'ospite. Polmone può essere utilizzato per l'estrazione dell'RNA e analisidella trascrizione genica. Campioni polmonari possono anche essere inseriti in paraformaldeide (PFA) per ulteriori osservazioni istologiche. BAL può essere utilizzata per la valutazione della secrezione di proteine ​​come le citochine infiammatorie. Infine, come discusso in precedenza il protocollo può essere adattato per fornire campioni per analisi citofluorimetrica.

Infine, questo protocollo può essere adattato a modellizzare C. albicans- interazione microbi coinvolti in polmonite associata a ventilazione come Staphylococcus aureus 18 Enterobacteriae. Un altro adattamento potrebbe essere colonizzazione vie aeree utilizzando batteri al posto di C. albicans di modellizzare l'interazione batterica nella malattia polmonare cronica suppurativa come bronchiectasie. A tal fine, devono essere utilizzati topi immunocompromessi, perché la clearance batterica in immunitario topi competente non permette una colonizzazione delle vie aeree persistente.

Per instillazione, la posizione della mano che impugna l'animale è critici. Come già sottolineato nel paragrafo precedente, quando instillare intra-nasale con il mouse, l'operatore deve assicurare che la bocca è perfettamente chiuso per evitare espettorazione della soluzione. Il pollice supporta la mascella e mantiene la bocca chiusa durante l'intera procedura di instillazione (Figura 4B). Poi, con l'altra mano, la pipetta viene depositato su una narice (Figura 4C) e la soluzione progressivamente e dolcemente instillato senza aria per evitare la formazione di bolle. Ovviamente, instillazione deve essere eseguita in un livello mobile 2-biosicurezza.

Raccolta dei campioni richiede Certifed piccolo animale formazione chirurgica dell'operatore. Ad ogni passo, i campioni devono essere immessi sul ghiaccio per evitare la lisi cellulare e preservare le proteine ​​da denaturazione. Strumenti chirurgici di base sono necessari (figura 4A). Essi devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Si raccomanda che i diversi set di strumenti chirurgici utilizzati per abdominal e fasi chirurgiche toraciche, evitando la contaminazione incrociata dei campioni polmonari. Le diverse fasi critiche di dissezione chirurgica sono presentati (Figure 5A-5E). Posizione del mouse è critica; l'animale deve essere immobilizzato appartamento sulla sua schiena testa di fronte da parte dell'operatore e dritto. Etanolo deve essere usato liberamente per prep prima della prima incisione per evitare la diffusione di capelli in campioni e potenziale contaminazione batterica dalla pelle. La pelle è ben vascolarizzato e deve essere ritirato con attenzione per evitare il sanguinamento (Figura 5A).

Poi la gabbia toracica è reclinato seguendo una toracotomia laterale durante il quale la gabbia toracica deve essere costantemente mantenuto nella morsa pinzette per evitare danni al cuore e polmoni durante l'incisione. Polmone e cuore sono esposte (Figura 5B). Appaiono polmone non infetti biancastro (Figura 5B). Dissezione della zona cervicale espone la trachea e una sutura è autoefully posto dietro la trachea superiore (Figura 5C). Cannulating la trachea deve essere effettuata con cautela. Non usare una cannula di grandi dimensioni (dimensione massima è di 20 G). Una piccola incisione anteriore della trachea membranoso tra due anelli cartilaginei permette l'inserimento della cannula. Quando la cannula viene osservato per trasparenza attraverso la trachea sopra della carena (Figura 5D), la sutura è strettamente legato intorno alla trachea fissandolo intorno alla cannula (Figura 5E). La cannula è collegata a una valvola maschio Luer-lock 3 vie con 2 siringhe collegate alle porte femminili. Una siringa contiene ghiacciata PBS per lavaggio broncoalveolare; l'altro è vuoto a tirarsi indietro BAL. Queste siringhe devono essere chaged tra i gruppi.

In conclusione, prima di adescamento modello danno polmonare acuto è un modello rilevante e potente da scoprire interazioni ospite-mediata vivo tra gli agenti patogeni. L'uso di animali è illimite principale e deve essere attentamente valutato rispetto le informazioni ottenibili in vitro.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevorane, Sevoflurane Abott 05458-02 250 ml plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940 Berthold Technologies reference in first column no comment
Bromo-cresol purple agar Biomerieux 43021 20x per unit
Pentobarbital sodique 5.47% CEVA 6742145 100 ml plastic bottle
2-headed valve  Distrimed 92831 no comment
Sterile inoculation loop 10 µl Dutscher 10175 x1,000 conditioning
Insuline syringes 1 ml Dutscher 30003 per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 ml Dutscher 64300 no comment
Ultrospec 10  General Electric life sciences 80-2116-30 no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm  Gosselin W1773X per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life technologies 10010023 packaged in 500 ml
amikacin 1 g Mylan 62516778 per 10 
Heparin 10,000 UI in 2 ml Pan pharma 9128701 10x per unit
RAL 555 coloration kit RAL Diagnostics 361550 3 flacons of 100 mL
1.5 ml microcentrifuge tube Sarstedt 55.526.006 x 1000
Transparent 300 µl 96-well plate Sarstedt 82 1581500 no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth Sigma 95763 in powder
FITC-albumin Sigma A9771 in powder
Luria Bertani Broth Sigma L3022 in powder
25-gauge needle Terumo or unisharp A231 x 100 conditioning
Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 no comment

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Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways
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Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).More

Faure, E., Bortolotti, P., Kipnis, E., Faure, K., Guery, B. Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways. J. Vis. Exp. (107), e53218, doi:10.3791/53218 (2016).

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