Abstract
Изучение хозяин-патоген взаимодействия позволяет понять основные механизмы патогенности во микробной инфекции. Прогноз хозяина зависит от участия адаптированной иммунного ответа против патогена 1. Иммунный ответ является сложным и результаты от взаимодействия патогенов и несколько иммунных или неиммунных сотовых типов 2. В пробирке исследования не могут характеризовать эти взаимодействия и сосредоточиться на клеточных патогенов взаимодействий. Кроме того, в дыхательных путях 3, особенно у пациентов с гнойным хроническим заболеванием легких или в механически вентилируемых пациентов, Полимикробные общины присутствуют и осложняют хозяин-патоген взаимодействия. Синегнойная палочка и Candida Albicans оба проблема возбудителей 4, часто изолированы от трахеобронхиального образцов, и связан с тяжелыми инфекциями, особенно в реанимации 5. Микробные взаимодействия имеютСообщалось, между этими патогенами в пробирке, но клинические последствия этих взаимодействий остается неясным 6. Для изучения взаимодействия между C. Albicans и P. палочки, на мышиной модели С. Albicans дыхательных путей колонизации, после чего P. aeruginosa- опосредованной острой инфекции легких была выполнена.
Introduction
Модели на животных, особенно мышей, были широко используется для изучения иммунных ответов против патогенных микроорганизмов. Несмотря на то, врожденные и приобретенные иммунитет отличается грызунов и человека 7, легкость в размножении и развитии нокаутом для многочисленных генов, сделать мышам отличную модель для изучения иммунных ответов 8. Иммунный ответ является сложным и в результате взаимодействия патогена, резиденты микробной флоры и несколько иммунные (лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги) и неиммунные (эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки) сотовые типы 2. В пробирке исследования не позволяют наблюдать эти сложные взаимодействия и в основном сосредоточены на уникальных клеток патогенных взаимодействий. В то время как модели на животных должны использоваться с осторожностью и ограничиваться очень специфических и соответствующих вопросов, мышиные модели обеспечивают хорошее представление млекопитающего иммунного ответа в естественных условиях и может обратиться части важных вопросов клинических 7.
6. В то время как то, что является «нормальной» микробиомом дыхательных путей остается определить, резиденты общины часто полимикробной, и происходят из различных экологических источников. Пациенты с гнойным хроническим заболеванием легких (муковисцидоз, bronchectasis) или механически вентилируемых больных отмечается особые флору из-за колонизации дыхательных путей с помощью экологически приобретенных микроорганизмов 9. Синегнойная палочка и Candida Albicans являются проблемой возбудителей 5, часто изолированы вместе с трахеобронхиального образцов и отвечает тяжелой оппортунистической инфекции у таких пациентов, особенно в реанимацию (ICU) 4.
Выделение этих микроорганизмов во время острой пневмонии в ОРИТ результатов в антимикробной обработки против P. б палочкиут дрожжи, как правило, не считается патогенным на этом сайте 5. При взаимодействии между P. пробирке палочки и С. Albicans были широко сообщалось и показали, что эти микроорганизмы могут влиять на рост и выживаемость друг с другом, но исследования не может заключить, если наличие C. Albicans является вредным или полезным для хозяина 10. Мышиные модели были разработаны для решения этой актуальность P. палочки и С. Albicans в естественных условиях, но взаимодействие между микроорганизмами не был ключевой момент. В самом деле, модель была создана, чтобы оценить вовлечение С Albicans в иммунном ответе, и исход.
Предыдущая модель создана Ру и др уже используется первоначальный колонизацию C. Albicans сопровождается острой легочной инфекции, вызванной P. палочки. Используя их модель, авторы обнаружили, пагубное роль рRIOR С. Albicans колонизации 11. Однако Ру др использовали высокую нагрузку С Albicans в их модели с 2 х 10 6 КОЕ / мышь в течение 3 дней подряд. Мы установили 4-дневный модель С Albicans колонизация дыхательных путей, или по крайней мере настойчивости без повреждения легких, в этой модели C. Albicans был получен до 4 дней после однократного закапывания 10 5 КОЕ на мышь (рис 2B) 12,13. После 4 дней, не наблюдалось никаких признаков воспалительного набора клеток, воспалительного цитокина, ни производства эпителиальных повреждений. Через 24 - 48 ч, на пике присутствии C. Albicans, хотя наблюдалось сотовой и цитокинов врожденного иммунного ответа, не было никаких доказательств повреждения легких. Удивительно, мыши, таким образом, колонизировали с С. Albicans 48 час до интраназальная инстилляцию P. палочки были ослаблены инфекции по сравнению с мышами с P. одна палочка инфекции. яndeed мышей выставлены меньшее повреждение легких и снижение бактериальной нагрузки 12,13.
Несколько гипотез может объяснить это благотворное влияние предварительного колонизации C. Albicans на P. палочки -опосредованной острую инфекцию легких. Во-первых, межвидовая перекрестные помехи с участием микроорганизмов каждый систем кворума зондирования, homoserinelactone основе P. Система палочки и фарнезола основе С. Система Albicans, были оценены. Во-вторых, С. Albicans действуя в качестве "приманки" для цели П. палочки переадресации возбудителя из легких эпителиальных клеток изучали. Обе гипотезы были признаны недействительными (неопубликованные данные). Третья гипотеза, что из "грунтования" врожденной иммунной системы К. Albicans несет ответственности за повышенной последующего врожденной реакции против P. палочки. Этот последний гипотеза была подтверждена. Действительно С. Albicans колонизация привела к грунтования врожденного иммунитета throuGH IL-22, в основном, секретируемый клетками врожденной лимфоидных, что приводит к увеличению бактериальной зазора и снижение повреждения легких 12.
В заключение, хост является центральным актером во взаимодействии микроорганизмов, модулирующих врожденный иммунный ответ и с участием различных воспалительных типов клеток. В то время как эти сложные иммунные взаимодействия могут быть расчленены в пробирке начальные гипотезы могут быть предоставлены только уместно в моделях естественных условиях. Следующий протокол представляет собой пример исследования в естественных условиях принимающей опосредованного патогена взаимодействия, которые могут быть адаптированы к других микроорганизмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
По региональным этика областной комитет для экспериментов на животных одобрил этот метод, в соответствии с национальным и международным ухода за животными и использования в исследовательских принципов исследования.
1. Сбор образцов
- Хранение образцов
- Соберите все образцы и сразу не хранить на - 20 ° C или на льду до тех пор, хранения морозильной чтобы избежать ухудшения. Поместите стерильные фосфатно-солевой буфер (PBS) на льду, чтобы улучшить бронхоальвеолярного лаваж (БАЛ) производительность.
- Хирургия
- Стерилизовать все оборудование, используя хирургическую автоклава.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если это возможно, рекомендуется использовать два различных набора инструментов для брюшной и грудной шагов, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Требуется рассечение оборудование, изображенной на рисунке 4A
- Стерилизовать все оборудование, используя хирургическую автоклава.
2. Мыши, Бактериальные и штаммов дрожжей
- Домовых мышей в соответствии с местным использованием животных в реруководящие принципы поиска комитета в проветриваемом стойке без превышения 5 мышей в клетку, с пищей и водой экспромтом, в уровень биобезопасности 2 жилья объекта в связи с использованием уровня биобезопасности 2 микроорганизмов: P. палочки и С. Albicans.
- Хранить бактериальных штаммов при -80 ° С в 40% глицерине среды.
- Добавить бактерии непосредственно из замороженных исходных в культуральную пробирку, содержащую 3 мл стерильного Лурии-Бертани бульоне с помощью прививки петли 10 мкл. Оставить O / N при 37 ° С с орбитальным встряхивания (400 оборотов в минуту) в день до закапывания.
- Урожай бактерии путем центрифугирования при 2000 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант в соответствующем распоряжении закрытой для биологически опасных отходов. Заметим, белый клейкий осадок на дне пробирку.
- Промыть и приостановить гранул с использованием 5 мл PBS.
- Повторите шаги 2.2.2 2.2.3 второй раз, чтобы выполнить второй стирки.
- Ресуспендируют осаждали с помощью бактерий 1 мл PBSи краткое встряхиванием.
- Определить плотность посева с использованием оптического денситометра при 600 нм, используя измеритель оптической плотности. Плотность 0,9 соответствует 10 9 КОЕ / мл для PAO1, разбавленных соответственно.
Примечание: Этот результат должен быть получен для каждого используемого штамма путем определения плотности последовательных разведений калиброванного инокулята. - Проверьте прививочный по серийному логарифмических разведениях и пластины 100 мкл каждого разведения на Бромкрезоловый фиолетовый агар (BCP) пластин и O / N культуры. Администрирование каждой мыши интраназально 50 мкл раствора, содержащего 1 х 10 8 до 2 × 10 8 КОЕ в мл (5 х 10 6 до 1 × 10 7 КОЕ на мышь).
- Использование С. Albicans SC5314 в качестве опорного напряжения. Экономия напряжение в 40% глицерине среде при -80 ° С.
- Дополнение дрожжей-пептон-декстроза бульон с 0,015% амикацин, чтобы избежать бактериального загрязнения и будет способствовать дальнейшему счет.
- Добавить дрожжи, используя 10-# 181; л прививки петли в подготовленную YPD-бульона с добавлением амикацин O / N при 37 ° С.
- Урожай дрожжи центрифугированием при 2000 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант в соответствующем распоряжении bioharzard отходов. Белый осадок прилипший должны наблюдаться в нижней части пробирку.
- Мытье и приостановить осаждали бактерии с использованием 5 мл PBS и краткое вортексе.
- Повторите шаги 2.2.2 2.2.3 второй раз, чтобы выполнить второй стирки.
- Ресуспендируют гранул с использованием 1 мл PBS и краткое встряхиванием.
- Определить размер инокулята путем подсчета на гематоцитометр Mallassez с помощью стандартного микроскопа при 40-кратном увеличении.
Примечание: Концентрация (в КОЕ / мл) получают, используя следующую формулу: (число дрожжей х 10 5) / (число подсчитанных сетки прямоугольников на гематоцитометр Mallassez). - Проверьте по серийным логарифмической разбавления до 10 -5 и 10 -6 подтвердить, что раствор содержит 2 х 10 6 КОЕ / мл.
- Табличка на YPD чашках с агаром с добавлением 0,015% амикацина.
3. Airways Колонизация C. Albicans
Примечание: После адаптации к окружающей среде, мышей взвешивали два раза в день.
- Под вытяжным шкафом, депозитные 500 мкл севофлурана на 4 см х 4 см марли (техника открытым падение) 14.
- Сразу же место марлю на полу приблизительно 750 мл индукции камеры. Сразу же место платформу сетки-приподняты над марлю, чтобы избежать прямого контакта между животным и марли.
- Закрыть крышкой и герметичный ждать от 1 до 2 мин, чтобы позволить распространение севофлурана в камере.
- Перевести мышь из клетки, чтобы сетка платформы и закрывают крышкой. Свет анестезия с консервативной спонтанного дыхания должно быть достигнуто в 30 до 45 сек.
- Монитор для гипотонии, наблюдая потерю рефлекса, при котором точка мышь может быть удалена ерум коробку и привил.
- Интраназально закапывания (может быть выполнена через 10 секунд обученным оператором).
- Держите мышь одной рукой расположен на спине в вертикальном положении (рис 4В).
- Использование указательный палец, поддерживать голову и использовать большой палец, чтобы держать челюсть закрыт, чтобы избежать мокротой (рис 4C).
- Как описано на шаге 2.3.8, убедитесь, что готова С. Решение Albicans содержит 2 x10 6 КОЕ на мл для 50 мкл привили громкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: вторая критическая точка является Закапывать объем. Объем ниже 50 мкл может привести к недостаточному или неоднородному колонизации закапывания дыхательных путей, больший объем может вызвать удушье тонущую / и смерть. - Привить мыши интраназально, приближаясь к пипетки в ноздри.
- Внесите капли 50 мкл, образующий пузырь, содержащий решение о ноздри, затем вдыхается spontaneouslу дыхание мыши.
- Место мыши в области восстановления (например, большой хорошо газированные голые клетка с ВЛ отопления лампы). Мыши не должно контролироваться до полного пробуждения. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не восстановил достаточную для поддержания сознания грудины лежачее положение и восстановить нужный рефлекс. В этот момент, мышь может быть возвращен в нормальное корпуса клетке.
4. П. палочки -индуцированных Острая инфекция легких
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши взвешивают в течение следующих четырех дней. Обычно, мыши набирать вес во время C. Albicans опосредованной колонизация дыхательных путей (2А).
- Подготовка суспензии, содержащей Р. палочки в день инстилляции после вывода / N роста (раздел 2.2).
- Кратко Обезболить использованием вдыхании севофлурана, как описано выше (раздел 3.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения острую инфекцию легких, рекомендуется бактериальной нагрузки предложены вТаблица 1. - Привить мыши, как описано выше (раздел 3.2) с особым вниманием к восстановлению после закапывания.
5. Мера легких Индекс травматизма
- Приготовьте раствор, содержащий FITC-меченого альбумина. Внедрить это решение 2 ч до эвтаназии животных.
- Взвесьте 0,2 мг альбумина-FITC с соответствующим оборудованием.
- Добавить 0,2 мг в 1 мл PBS. Кратко вихрь. Если сразу не используется, поместите решение в фольге, чтобы избежать воздействия окружающего света.
- Вводят внутрибрюшинно 200 мкл FITC-меченного раствора альбумина в каждой мыши.
- Эвтаназия
- Взвесьте мышей для последним данным веса.
- Эвтаназии один курсор в соответствии с местным использования животных в научных принципов комитета с использованием одного внутрибрюшинную инъекции смертельной передозировки в пентобарбитала: 300 мкл 5,47% фенобарбитала.
- Удалить мышь из клетки и получает лethal инъекции оператором.
- После инъекции, передавать мышь в одиночку другой клетке, скрытой от других животных. Наблюдайте мышь, пока отсутствие движения. Подтвердите смерть отсутствием движения, в частности, дыхательных движений, отсутствием пульса.
- Выполните хирургического коллекцию образцов на мертвых животных, поэтому без анестетиков, ни анальгетиков.
- Хирургическое сбор образцов: Грудной этап.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильных условий, все операция проводится с использованием стерильного оборудования в среде уровень биобезопасности 2.- Применение этанола на кожу. Выполните разрез по средней линии грудины кожу от середины живота к ножницами. От средней линии надрезать вдоль грудной клетки с обеих сторон. Отогните кожу с обеих сторон грудной клетки визуализировать грудную клетку.
- Выполнение вертикальный разрез грудной клетки по обе стороны идет вверх в сторону ключицы, чтобы иметь возможность откидываться всю стену передней стенке грудной клетки с кормыгм позволяет идеальный визуализации сердца и легких (рис 5а, 5b).
- Собирают кровь с использованием предварительно шприц heparined путем прокалывания сердце рядом с межжелудочковой артерии. Вывод минимум 500 мкл до получения по меньшей мере 100 мкл плазмы. Поместите образец крови на льду.
- Выполните средней линии шейки разрез для визуализации трахеи (рис 5B и 5C). Осторожно рассекают фасцию вокруг трахеи. Поставьте шва позади трахеи (рис 5C и 5D). Впоследствии шов будет закрыт вокруг иглы cannulating, чтобы обеспечить надлежащее промывание.
- Катетер трахеи с использованием 20-G иглу через зонд модифицированный (рис 5D и 4А). Свяжите хирургического узел вокруг канюлированного трахеи с ранее размещенных шва.
- Для выполнения Бронхоальвеолярный промываний (БАЛ), мягко и постепенно вводить и привлечь 500 мкл ледяной PBS в / из легких. Поместите образец на ICE, чтобы избежать сотовой лизис.
- Повторите шаг 5.3.6, 3 раза, чтобы получить в общей сложности 1500 мкл БАЛ и бассейн промывание образцов в 2 мл пробирку для центрифугирования (рис 5E).
- Удалить легкие из груди. Поместите сегмент легких (размер должен соответствовать половине одного легкого или доли) в 1,5 мл центрифужную пробирку и быстро хранить в - 80 ° С.
- Поместите сегмент легких в предварительно взвешенную гемолиз пробирку, содержащую PBS, чтобы определить бактериальную нагрузку и поместить его на льду.
- Хирургическое сбор образцов: в животе этап.
- Выполните еще один разрез на левой стороне живота. Соблюдайте селезенки через брюшину.
- Удалить селезенки и поместите во второй гемолиз пробирку, содержащую 1 мл PBS и место на льду.
- Легких индекс травмы
Примечание: альвеолярно-капиллярной проницаемости мембраны оценивают измерением FITC-меченого альбумина утечки из сосудов отсека альвеолярного-interstвоначальным отсека.- Центрифуга образец крови и БАЛ в течение 10 мин при 1500 х г в. Сбор супернатанты в новые центрифужные пробирки. Гранулы соответствуют набранных плазмы или БАЛ клетки и должны быть размещены на льду.
- Добавить 100 мкл каждого супернатанта плазмы крови (, желтый) или BAL супернатанта к 96-луночный прозрачной пластины (300 мкл) скважин. Поставьте фольгу на плите, если он не используется сразу.
- Измерьте уровень флуоресценции в плазме и БАЛ супернатантами помощью флуоресценции планшетного (возбуждение, 487 нм; излучения, 520 нм).
- Определить индекс повреждения легких путем расчета коэффициента флуоресценции в [(БАЛ надосадочную супернатант / в крови) х 100].
- Бронхоальвеолярный промывание (БАЛ) Количество различных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте осадок клеток, полученных из центрифугирования БАЛ на этапе 5.5.1.- Если необходимо, используйте красно-клеток буфер лизиса. Добавить 500 мкл эритроцитов лизирующего буфера в центрифужную пробирку, содержащую CELл Осадок. Кратко вихря и оставить на 10 мин на льду. Добавить 500 мкл PBS, чтобы остановить красно-лизис клеток.
- Урожай клетки центрифугированием в течение 10 мин при 1500 х г в. Удалить супернатант и приостановить осадок клеток в 1 мл стерильной PBS. Перечислять клеток на гематоцитометр Mallassez. Использование гемацитометра графу ячейки. Концентрат клеток на слайде с цитоспиновых.
- Пятно клетки, используя окраску комплект, позволяющий идентифицировать клеток и количество (макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы).
- Легких бактериальной бремя и бактериальной распространение
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки легких бактериальной нагрузки и бактериальной распространение, легкие и селезенка были соответственно собирали и хранили в предварительно взвешенный гемолиз пробирки, содержащие 1 мл PBS (шаг 5.3.9).- Взвесьте гемолиз пробирки, содержащие 1 мл PBS, и либо легких или селезенки. Однородный образцы с тканевом гомогенизаторе, чтобы получить гомогенатов легких и селезенки гомогенатов.
- Депозит 100 мкл ткани гомоgenates в центрифужные пробирки, содержащие 900 мкл стерильной PBS на получение серийных разведений. логарифмические
- Пластина два последних соответствующие разбавленных образцов (10 -3 и 10 -2) на любой BCP-агар для P. палочки или YPD-амикацин-дополняется агар для C. Albicans легких и определение бремя селезенки.
- Инкубируйте пластин O / N при 37 ° С. На следующий день, перечислить колонии на пластинах.
- Индекс результатом весу легких, чтобы получить КОЕ на грамм легких. Размеры выборки легких не то же самое, результаты должны быть выражены в КОЕ на грамм легких.
Формула для индекса: [КОЕ] [х вес гемолиз трубки и легких] - [вес гемолиз трубки].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как видно ранее при описании протокола, эксперимент должен 5 дней, чтобы завершить (Рисунок 1: Эксперимент сроки). Один оператор запросил в течение всего проведении эксперимента и может обрабатывать процессы до максимум 10 мышей. Если больше животных требуется два человека необходимы, особенно для хирургического сбора проб. Действительно, все образцы должны быть собраны в рамках 2 часов, чтобы избежать повышенного пассивный альвеолярно-капиллярной утечки FITC-меченого альбумина в последние мышей.
Первым шагом является подготовка С. Albicans посевной и внутри носа закапывания, чтобы получить колонизации дыхательных путей К. Albicans. Модель 4 дня-настойчивость получается интраназального закапывания 5 х 10 5 КОЕ С. Albicans на мышь (Фигура 2В). Во время этих 4 дней, мышей набирать вес (рис 2А) и инстилляции 5x10 5 КОЕ не вызывает лУн травмы (рис 2С). Хотя C. Albicans может сохраняться до 4 дней в этой модели, нагрузка уменьшается после 48 часов. Таким образом, П. палочки -индуцированных острая инфекция легких проведенными в 48 часов С. Albicans настойчивость.
П. штамм палочки PAO1 является в значительной степени характеризуется лабораторного штамма, содержащего основной фактор вирулентности, тип три системы секреции (T3SS), а в 75% клинических изолятов легких 15. Для диссертаций причинам, PAO1 является актуальным штамм на животных моделях острого воспаления легких. Травмы легких оценивается с помощью альвеоло-капиллярной проницаемости, измеренной утечки белка из сосудистого отделения в дыхательные пути выражается в виде индекса повреждения легких. Повреждение легких увеличивается с посевной (рис. 3А) Здесь мы сообщаем кинетики острого повреждения легких компонент нашей модели, вызванного штаммом PAO1 (5x10 6 КОЕ / мышь) (рис 3B-3F) в одиночку без предварительногоС albicans- опосредованное грунтовки. В зависимости от штамма и времени, конечно модели, выбора начальной P. палочки посевной обсуждается в следующем разделе, и предложил в таблице 1.
Были использованы п ть мышей на группу. Индекс легких травм (3В), бактериальный нагрузка в легких (рис 3C), бактериальный нагрузка в селезенке, отражая бактериальной распространение (рис 3D), БАЛ клетками (рис 3E) и счета различных клеток (рис 3F) были определены каждые 12 ч. Травмы легких было максимальным в период с 24 часов и 36 часа после заражения (рис 3B). Бактериальный бремя показал 1-авторизуйтесь КОЕ / мл снизить каждые 24 ч (рис 3C). Накопительное бактериальной распространение оценивается селезенки гомогенатов культур увеличилась каждый день (рис 3D). Наконец, хотя BAL клеточности в неинфицированных мышей в основном состоит (90%) оF альвеолярные макрофаги, в БАЛ зараженных мышей, нейтрофилов были широко работу и количество различных клеток показали 90% нейтрофилов и 10% лимфоцитов и макрофагов (рис 3E, 3F).
Рисунок 1. Хронология острого повреждения легких модели для изучения хост-опосредованной взаимодействия между С. Albicans и П. палочки.
Графическое представление всей процедуры. Первым шагом является экологическая адаптация мышей корпус объект. Второй шаг С. Albicans опосредованной колонизации дыхательных путей. Наконец, третий шаг является острая инфекция легких опосредуется P. палочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. С. Albicans дыхательных путей Колонизация.
(А, В) Мышей интраназально закапывают 10 5 КОЕ С. Albicans (штамм SC5314). Мыши набирать вес во время C. Albicans опосредованной колонизация дыхательных путей (А). Колонизация дыхательных путей может быть продлен до 3-4 дней только с одним начальным инстилляции. В предыдущем исследовании, грунтовки врожденного иммунитета происходит между 24 и 48 ч. (п = 5 в группе), планки погрешностей представляют средние ± SD. (C, D) мышей интраназально закапывают 5 × 10 5 или 5 × 10 6 КОЕ С. Albicans. Индекс легких травм (С) оценивали по альвеолярного капиллярного барьера проницаемости в 24 ч. Увеличение веса (D) выражали в процентах от первоначального веса (N = 5 на группу).Усы представляют средства ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Модель острого повреждения легких, индуцированный Р палочки.
(А) C57BL / 6J мышей интраназально инфицированных с увеличением нагрузки P. палочки (от 1 х 10 6 до 5 · 10 7 КОЕ на мышь) (п = 5 в группе), планки погрешностей представляют средние ± SD. Мышей умерщвляли через 24 часа. Легких индекс травмы оценивается альвеолярно-капиллярной проницаемости барьера, что увеличивает пропорционально бактериальной нагрузки. Сравнение индекса повреждения легких получены при использовании старого метода с легких гомогенатах супернатантов (черные полосы) и нового комбинированного метода с использованием БАЛ супернатантами (серый барс) (БФ) мышей интраназально инфицированных с 5 x10 6 КОЕ на мышь. Мышей умерщвляли каждые 12 ч в 48 острых модели травмы кинетики. Повреждение легких (Б), легких бактериальной бремя (С), селезенка бактериальная нагрузка (D), БАЛ (БАЛ) клеточность (Е) и БАЛ количество различных клеток (F), также оцениваются. (п = 5) в группе, об ошибках бары представляют ± SD средства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Хирургическое оборудование и интраназально закапывания.
(А) Хирургическое оборудование, необходимое для выполнения острый модель травмы и бронхоальвеолярного лаважа. Вот трахеи канюли (20Г) и два 1 мл шприцы подключены к Луера 3-ходовым клапаном. Один шприц для закачки воды в легких, один, чтобы привлечь бронхоальвеолярный жидкость обратно из легких. (B, C) Положение мыши в руке, чтобы выполнить внутри носа закапывания. На этом фото, большой палец под челюстью обеспечивает замкнутый рот во время закапывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Хирургическое и бронхо-альвеолярной лаважа.
Грудь широко открыл (А), и грудная клетка открыта в поперечном направлении, чтобы избежать травм в сердце (B). После сбора крови, шейки площадь расчленена, чтобы разоблачить трахеи (C). Зубная нить используется какшовный и передается за трахеи (C, D). Трахея затем канюлю с 20-G канюли в сочетании (D), установленный на шприц и 3-ходовым клапаном. Трахея должны быть плотно закреплены вокруг канюли, связывая хирургическое узел, используя шов в месте позади трахеи. Наконец в 500 мкл ФБС мягко привили в легких, а затем БАЛ осторожно вытягивается. (E) Fluid-привил легкие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Минимальная Закапывать Бремя | Максимальный Закапывать Бремя | |
| T3SS- | 5 х 10 7 | 1 х 10 8 |
| T3SS + | 5 х 10 6 | 1 х 10 7 |
| T3SS + exoU + | 5 х 10 | 1 х 10 5 | |
Таблица 1. С. палочки Инокуляты при острых легочных инфекции Модели.
Предлагаемые оптимальные концентрации интраназальные посевного, чтобы вызвать острое повреждение легких в соответствии с штаммов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Животных моделей, в частности, млекопитающие, являются полезными для выяснения сложных механизмов хозяин-патоген взаимодействия в области иммунитета. Конечно, потребность в информации, получаемой только из животных моделей должны быть существенными; в противном случае, использование животных должны быть заменены моделями в пробирке. Эта модель животных иллюстрирует понимание того, что может быть обеспечено только путем животной модели, так как взаимодействие между патогенов опосредуется многокомпонентной реакции хозяина. Мыши в настоящее время используются для изучения этого хозяин-патоген взаимодействия являются молодые люди в возрасте от 6 до 10 недель с зрелой и неизменном иммунного ответа. При фокусировке на врожденного иммунного ответа, являются предпочтительными C57BL6 / J мышей фона. Чтобы избежать эффекта пола и гормонального цикла (особенно эстрогенов) на иммунный ответ, самцы, поэтому лучшим выбором. Для достижения статистической значимости, группы должны иметь по крайней мере 5 человек в конце эксперимента, но как это было предложено всех эксперименталь животныхруководящие принципы тации, количество животных, используемых должны быть сокращены и изысканный к минимуму.
Транспорт из заводчика, предоставляющей животных в научно-исследовательский центр вызывает напряжение у мышей. Следствием этого является увеличение секреции воспалительных цитокинов, которые могут изменить последующие эксперименты, такие, как наша. Кроме того, новая среда и новый "клетка товарищей" способствуют появлению стресса. Следовательно, мыши должны быть акклиматизации в течение, по крайней мере за семь дней до их изучения в новой жилой среды. Это жилье среда должна быть под контролем, обеспечивая стандартный пищи и воды экспромты, день / ночь цикла и соответствующий стабильную влажность и температуру.
Оба колонизации легких и легких моделей инфекции требует практики и сноровки. Внушение может быть выполнена интраназально или внутри трахеально. Последнее более сложно и требует большего опыта посредством обучения в связи с высоким риском бескислородной сердца. В самом деле, прocedure требует, чтобы успешно интубировать мыши в менее чем 15 сек, и поэтому требуется более глубоких анестезии. Наш выбор интраназального закапывания легче выполнить, поскольку путь введения доступен, менее рискованным требующих легче анестезии и, следовательно, более воспроизводимым.
Boutoille др уже описано наше острое модель повреждения легких, в частности, оценку повреждения легких путем измерения альвеолярно-капиллярной проницаемости барьера, используя FITC-меченого альбумина 16. Чтобы уменьшить количество мышей на эксперимент, этот метод был адаптирован и в сочетании с бронхоальвеолярного лаважа (BAL). В исследованиях Boutoille др, мы использовали сравнение между флуоресценции FITC-меченого альбумина в легких гомогенатов супернатантов и супернатантах крови 17.
Чтобы полностью выполнить это сравнение, уровни гемоглобина и гематокрита уровни также необходимы. Этот метод был адаптирован к АЛЛОW сопутствующей анализа ответа хозяина путем выделения одно легкое гомогенизации и оценки повреждения легких, а другой промывания и изучения ответа хозяина. Действительно, БАЛ могут быть использованы для оценки уровней цитокинов секрецию белка и набор клеток. Наша адаптация предоставляет больше результатов от одного эксперимента животных, снижение стоимости и необходимого количества мышей, особенно при использовании нокаут-мышей 17, как рекомендовано в руководящих принципах экспериментов на животных. Кроме того, часть легких выдерживают при -80 ° С для выполнения общей экстракции РНК и количественный полимеразной цепной реакции или гистологический анализ обработанных. Сравнение между предыдущим методом и новым методом адаптированного сочетании с BAL показывает сравнимые результаты (Фигура 3А) для оценки индекса повреждения легких.
При исследовании Меар др использованием тех же процедур, проточный цитометр анализ проводили на клетках, полученных BAL центрифугированием БАЛ. Похожиеnalyses проводились на общих легочных клеток из легких 12. В этом случае оценка легких травм с FITC-меченый альбумин не может быть выполнена параллельно, в результате артефактов, вызванных FITC (тот же канал, чем зеленого флуоресцентного белка). Поэтому, если требуется проточной цитометрии, эксперименты должны быть запланированы соответственно.
Время эвтаназии является критическим. Время, конечно острой инфекции легких модели по сравнению с первой 72 ч представлен на рисунке 3. В этой модели, вершина повреждения легких и ответ хозяина происходит между 24 и 36 ч (рис 3). Таким образом, по нашему конструкции 24 ч оконечная был выбран в качестве отсчета по 3 причинам: во-первых, легко организовать в лаборатории, во-вторых, чтобы избежать потери мышей из-за гибели от 24 до 36 ч и, наконец, потому что ответ хозяин был максимальным в этот момент времени.
Первым шагом нашего исследования взаимодействия является колонизация дыхательных путей с <EM> С. Albicans. Использование инстилляции 10 5 КОЕ на мышь, 4-дневный модель настойчивость получается без повреждения легких. В самом деле, мыши набрали вес за время ходе этой фазы. Увеличение веса является полезным показателем отсутствия травмы в соответствии с колонизации, в отличие от инфекции. Действительно, увеличение начальной нагрузки (более 10 КОЕ в 6 мыши), индуцированное повреждение легких (рис 2С) и вредным хост-ответ далеко за пределы грунтовки, в этом случае мышей похудела (рис 2D). Напротив, с использованием меньшего начальной загрузки (например, 10 4 КОЕ на мышь) А. сохранение модель дыхательных путей не могут быть получены. Таким образом, чтобы получить наблюдаемую примирование иммунитета хозяина, описанной Меар др 12, калибровка привила грибковой бремени решающее значение для успеха и мониторинга кривую веса является ключевым контроль.
То же самое требуется высокая точность для Р. палочки и Р. палочки быстро очищается из дыхательных путей с помощью соответствующего хост-ответ. Использование чрезмерно высокую начальную P. палочки превосходит возможности защиты хозяина или даже вызывает неадекватную реакцию и derleterious в результате нагрузки приводит к массовому острой травмы и смерти Удаление всех различий между группами. Оптимальное инокулята, чтобы вызвать острое повреждение зависит от присутствия функционального типа 3 системы секреции (T3SS) и производства экзотоксина U, токсин транслокации в T3SS в клетку-хозяина цитоплазме. Эти два атрибута штамм-специфические должны быть рассмотрены при выборе начальной бактериальной нагрузки. Первоначальные бактериальные тяготы предложил в этой статье в качестве примеров нижних и верхних пределов, чтобы вызвать острое повреждение легких с T3SS-отрицательных или положительных деформации, и штаммы, продуцирующие экзотоксина U или нет (таблица 1). При изученииУчастие T3SS, штамм должен быть выращен O / N и возродил с новым LB среды 3 ч перед приготовлением инокулята для получения оптимального активность T3SS.
Определение бактериальных и грибковых бремя 24 часов после P. палочки индуцированного инфекцией легких требует конкретных соображения, рассмотренные в этом разделе. Действительно, как показано, когда мышей инфицированы 5 х 10 6 КОЕ T3SS-положительного бактериального штамма, нагрузки в легких на 24 ч воли снизилась примерно до 1 журнал (Рис 3C). Серийные разведения образцов должны быть выполнены до разбавления 5-журнала и высевали на ППГ-чашках с агаром. Относительно С Albicans в легких, в 72 ч, грибковые нагрузка уменьшается примерно до 2 бревна и образцы должны быть высевали на агар YPD-дополненной амикацин для облегчения идентификации колоний. Наконец, определение бактериального распространения могут быть оценены путем посева 100 мкл образца крови на ППГ-агар или путем посева 100 мкл селезенки чomogenates на той же среде. Эти два метода были уже сравнивают и селезенки культура, кажется, чтобы быть более точным. Действительно, селезенка является органом, который "фильтры" весь в крови и может "сосредоточиться" и сохранить бактерий, которые распространены на крови. Таким образом, селезенки гомогенаты отражают системную бактериальную распространение во время острой легочной инфекции с высокой чувствительностью, чем крови. Образцы крови представляют бактериальной распространение в очень специфической данный момент времени и не может действительно отражают явление бактериальной распространения в целом. Поэтому предпочтительными являются селезенки культуры гомогената.
Индекс легких травм является чувствительным оценка повреждения легких в результате инфекции и / или ненадлежащего ответа хозяина и эффект потенциальных терапевтических на этих компонентов. Кроме того, это в Львов о модели позволяет собирать несколько различных образцов для изучения реакции хозяина. Легких могут быть использованы для экстракции и анализа РНКтранскрипции гена. Образцов легких также могут быть размещены в параформальдегида (PFA) с целью дальнейшего гистологического наблюдений. БАЛ могут быть использованы для оценки секреции белка, таких как воспалительные цитокины. Наконец, как говорилось выше протоколом могут быть адаптированы, чтобы обеспечить образцы для проточной цитометрии.
Наконец, этот протокол может быть адаптирован к modelize C. Взаимодействие albicans- микробы вовлечены в вентилятор-ассоциированной пневмонии, такие как золотистый стафилококк 18 или Enterobacteriae. Другой адаптации может быть колонизации дыхательных путей, а не с использованием бактерий С. Albicans в modelize бактериальной взаимодействие в хронического гнойного заболевания легких, такие как бронхоэктазы. Для этого, с ослабленным иммунитетом мышей, которые будут использоваться, потому что бактериальная очистка в иммунной компетентным мышей не позволяют постоянное колонизации дыхательных путей.
Для закапывания, положение руки, держащей животного крикTical. Как уже подчеркивалось в предыдущем разделе, когда интраназально воспитание мышь, оператор должен убедиться, что во рту прекрасно закрыты, чтобы избежать отхождение решения. Большой палец поддерживает подбородок и поддерживает закрытым ртом в течение всей процедуры инстилляции (фиг.4В). Затем, с другой стороны, пипетки наносят на ноздрю (фиг.4С) и раствор постепенно и осторожно закапывают без воздуха, чтобы предотвратить образование пузырьков. Очевидно, что закапывание должна быть выполнена в уровне кабинета 2-биобезопасности.
Сбор образцов требует certifed малого животных хирургическое обучение оператора. На каждом этапе, образцы должны быть помещены на лед, чтобы избежать лизиса клеток и сохранить белки от денатурации. Основные хирургические инструменты необходимы (рис 4а). Они должны быть стерилизуют автоклавированием перед использованием. Рекомендуется, чтобы различные наборы хирургического инструмента быть использованы для abdominaл и грудной хирургических шаги, избегая перекрестного загрязнения образцов легких. Различные критические шаги хирургического вскрытия представлены (рис 5A-5E). Положение мыши является критическим; животное должно быть обездвижен квартира на он вернулся глава противоположной от оператора и прямо. Этанол следует обильно используется для подготовительной перед первым разрезом, чтобы избежать распространения волос в образцах и потенциального бактериального загрязнения с кожи. Кожа хорошо развитую сосудистую сеть и должен быть втянут осторожно, чтобы избежать кровотечения (рис 5А).
Затем грудная клетка является возлежал после боковой грудной разрез, в течение которого грудная клетка должна быть постоянно поддерживается в тисках пинцет, чтобы избежать травм в сердце и легких во время разреза. Легких и сердца подвергаются (5В). Неинфицированные легких появляются беловатые (рис 5B). Рассечение шейки области выставляет трахеи и шов автомобильefully размещены позади верхней трахеи (5С). Cannulating трахеи должны быть выполнены с осторожностью. Не используйте негабаритных канюли (максимальный размер составляет 20 г). Небольшой разрез передней из мембранные трахеи между двумя хрящевые кольца позволяет вставлять канюли. Когда канюля наблюдали прозрачности через над килем (рис 5D) трахеи, шов тесно связаны вокруг трахеи, обеспечивающего его вокруг канюли (рис 5E). Канюли соединен с 3-ходовым клапаном мужского Луера с 2 шприца, подключенных к портам женщин. Один шприц содержит ледяной PBS для бронхоальвеолярного лаважа; другой пустой отступать БАЛ. Эти шприцы должны быть chaged между группами.
В заключение, грунтовки до острого повреждения легких модели является актуальным и мощная модель для изучения в естественных условиях принимающих опосредованного взаимодействия между патогенами. Использование животных являетсяОсновным ограничением и должны быть тщательно взвешены с информацией, получаемой в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sevorane, Sevoflurane | Abott | 05458-02 | 250 ml plastic bottle |
| Fluorescence Reader Mithras LB940 | Berthold Technologies | reference in first column | no comment |
| Bromo-cresol purple agar | Biomerieux | 43021 | 20x per unit |
| Pentobarbital sodique 5.47% | CEVA | 6742145 | 100 ml plastic bottle |
| 2-headed valve | Distrimed | 92831 | no comment |
| Sterile inoculation loop 10 µl | Dutscher | 10175 | x1,000 conditioning |
| Insuline syringes 1 ml | Dutscher | 30003 | per 100 conditioning |
| 2 positions Culture tube 8 ml | Dutscher | 64300 | no comment |
| Ultrospec 10 | General Electric life sciences | 80-2116-30 | no comment |
| Hemolysis tubes 13 x 75 mm | Gosselin | W1773X | per 100 |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life technologies | 10010023 | packaged in 500 ml |
| amikacin 1 g | Mylan | 62516778 | per 10 |
| Heparin 10,000 UI in 2 ml | Pan pharma | 9128701 | 10x per unit |
| RAL 555 coloration kit | RAL Diagnostics | 361550 | 3 flacons of 100 mL |
| 1.5 ml microcentrifuge tube | Sarstedt | 55.526.006 | x 1000 |
| Transparent 300 µl 96-well plate | Sarstedt | 82 1581500 | no comment |
| Yest-peptone-Dextrose Broth | Sigma | 95763 | in powder |
| FITC-albumin | Sigma | A9771 | in powder |
| Luria Bertani Broth | Sigma | L3022 | in powder |
| 25-gauge needle | Terumo or unisharp | A231 | x 100 conditioning |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | no comment |
References
- Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
- Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
- Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
- Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
- Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
- Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
- Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
- Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
- Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
- Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
- Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
- Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
- Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
