Summary
Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt.
Abstract
Kreislauf-Erkrankungen ist eine häufige Todesursache in den Vereinigten Staaten. Hier präsentieren wir eine Methode, um den Beitrag der Strömungsdynamik in Richtung Kreislauf-Erkrankungen Erkrankungen zu untersuchen. Ungesunde Arterien oft mit Wandversteifung, Narbenbildung oder partielle Stenose, die alle betreffen können Fluiddurchflußraten, und die Größe der pulsierenden Fluss oder Pulsatilitätsindex vorhanden. Replikation von verschiedenen Strömungsbedingungen ist das Ergebnis der Abstimmung eines Strömungsdruckdämpfungskammer stromab einer Blutpumpe. Einführen von Luft in einem geschlossenen Strömungssystem ermöglicht ein kompressibles Medium auf pulsatile Druck von der Pumpe zu absorbieren und daher variieren die Pulsatilitätsindex. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach wiedergegeben werden, mit hoch steuerbaren Eingabe und leicht messbare Ergebnisse. Einige Einschränkungen sind Erholung der komplexen physiologischen Pulswellenform, die nur durch das System angenähert wird. Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten werden durch den Blutfluss thr betroffenOugh die Arterie. Die dynamische Komponente des Blutflusses durch das Herzminutenvolumen und Arterienwand Übereinstimmung bestimmt. Gefäßzelle mechanisch-Transduktion der Strömungsdynamik kann Zytokinfreisetzung und Übersprechen zwischen Zelltypen innerhalb der Arterie auslösen. Co-Kultur von Gefäßzellen ist ein genaueres Bild reflektierenden Zell-Zell-Wechselwirkung an die Blutgefäßwand und Gefäßreaktion zur mechanischen Anzeige. Beitrag der Strömungsdynamik, einschließlich der Zelle als Antwort auf die dynamischen und mittlere (oder stationären) Strömungskomponenten, ist daher eine wichtige Metrik zu bestimmen Krankheitspathologie und die Wirksamkeit der Behandlung. Durch die Einführung eines in vitro Cokulturmodell und Druckdämpfung stromabwärts von Blutpumpe, die simulierte Herzleistung erzeugt, können verschiedene arterielle Erkrankung Pathologien untersucht werden.
Introduction
Morbiditätsraten für Herzkreislauferkrankungen sind die größten in Amerika, mit von ungesunden Gefäß viele resultieren. Gesunde Arterien bestehen aus elastischem Gewebe, mit weichen Lumenoberfläche mit einem Endothelzellen (EG) Monoschicht beschichtet. Arteriellen Blutfluss kann als eine oszillierende Wellenfunktion mit positiven mittleren Strömungsgeschwindigkeit modelliert werden. Die Pulsatilitätsindex (PI) ist der Quotient aus Schwingungs Betrag und mittlere Fließ (PI = (Max. - Min.) / Mittelwert), 1 und wurde in vitro mit variabler Gefäßelastizität modelliert 2 Arterielle Elastizität ist bei der Lagerung der Strömung wichtig. Energie von Herzkontraktionen, Dilatation unter den systolischen Druck, und spielt eine bedeutende Rolle bei der Modulation des Blutflusses PI. Weil das Herz für ein konsistentes, pulsatile, Volumenstrom erhöht arterielle Expansionsquerschnittsfläche, die Verbesserung Strömungsstabilität durch die Verringerung der Strömungsgeschwindigkeit, Schubspannung und PI. Häufig ungesunde Arterien geht auf Elastizitätoder die Einhaltung und zeigt Versteifungs von vaskulären Umbau, Narbengewebe oder Verkalkung 3, 4. Zusätzlich können andere vaskuläre Erkrankungen, wie neointimale Hyperplasie (NIH), 5 Aneurysma und Hypertonie 6 und vaskuläre Fibrose 4, Gefäßdurchmesser zu verengen. Allerdings sind die bisherigen medikamentösen Behandlung und Geräte Behandlung von Gefäßerkrankungen vernachlässigen oft die Bedeutung der Gefßwand Compliance oder Blutströmungsdynamik in vaskulären Erkrankung, die häufig durch Veränderungen der Gefäß Morphologie und Eigenschaften kompliziert. Weder Ballon-Angioplastie oder Stenting beantworten Sie die Komplikation der Wandelastizität 7. Daher fließt in vitro Modellierung von Blut von arteriellen Erkrankungen und Behandlungen resultiert, ist bei der Untersuchung von Krankheitspathologien und künftige Wirksamkeit der Behandlung wichtig. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Replikation von physiologischen und pathologischen Blutfluss zur Zellantwort in Gefäßerkrankungen pathol bestimmengien. Fluidstrom bewirkt Scherspannung an der Gefßwand, die ein wichtiges mechanisches Signal in Gefäß Gesundheit ist, die alle Zellen innerhalb des Gefäßsystems. Mehrere mechanische Sensoren an das vaskuläre Endothel zur Fluidscher identifiziert wurden, einschließlich der letzten Untersuchungen für endotheliale mechanosensing 8 gezeigten primären Zilien. Endotheliale Zell-Aktivität und Morphologie von Strömungsgeschwindigkeit, Richtung und Pulsatilität betroffen. Zusätzlich kann der glatten Muskelzellen (SMC) Migration durch mechano-Signale mit niedriger Strömungsgeschwindigkeit durch Interstitialflüssigkeit 9 beeinflusst werden, und kann auch durch die parakrine Signalisierung von Endothelzellen durch ihre Reaktion zu fließen und mechano-Transduktion von Flusssignalen via Zytokin freizugeben 10. Die "Dosis" Abhängigkeit der mittleren Scher, PI, und parakrine Signalisierung kann auch voneinander abhängig zu sein. Zu diesem Zweck wird die Bestimmung des Gefäßzellantwort auf Fluidscherungskupplung mit unterschiedlichen "Dosieren" in Monolayer-Kulturoder Co-Kultur in vitro konnten mechanistische Einblicke in die vaskuläre Remodeling und zur Verbesserung der Erkrankung und Behandlung Vorhersage. Das Flusssystem in diesem Experiment verwendet besteht aus einer Blutpumpe, einem vorgeschalteten Strömungsdämpfungsluftbehälter, einem nachgeschalteten Durchflussmesser nur während der Versuchsaufbau, einem nachgeschalteten Zellkultur, Parallelplatten-Durchflusskammer und Medienspeicher verwendet. Kontrolle der Gefäßdurchflussgrößen wie meine Durchfluss, Schläge pro Minute und PI kann durch Steuerung der Strömungsrate, Impulsfrequenz, und die Einführung der Druckdämpfung erreicht werden. Pulsierenden Blutpumpen sind mit variablen Hub Hubraum, bei kontrollierter Hubfrequenz, die sich direkt auf Volumenstrom und Impulsfrequenz bedeutet. Einführung einer Luftbehälter innerhalb des Strömungskreislaufs ermöglicht Druck Dämpfung reduziert Strömungsoszillation Größenordnung. Medium ist ein inkompressibles Fluid, während Luft in der Dämpfungskammer komprimierbar ist, so dass Überdruck von der Strömungswellen seindurch Luftkompression absorbiert. Die Luft um Medien-Verhältnis ermöglicht eine Kontrolle darüber, wie viel Dämpfung auftritt. Ein kundenspezifisches Zellkultur Durchflußkammer 75 mm Länge und 50 mm Breite wurde aus Acryl hergestellt. Strom tritt durch die Einlassöffnung und expandiert durch den Ansaugkrümmer, eine konsistente Strömung über die Gesamtheit der Strömungskammer. Ähnliche Fluss und Strukturen sind in Kammerausgang vorhanden. Zellen werden auf funktionalisierten Objektträger ausgesät und anschließend in die Strömungskammer angebracht ist. Dies ermöglicht eine große Populationen, einfach nach dem Studium abgerufen. Co-Kultur-Experimente kann eine poröse Polycarbonatmembran zu verwenden, um Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen den Kulturen zu beseitigen und ermöglicht Zytokin / Flussverkehr. Dieses System wurde zuvor verwendet, um hohe Strömungs PI und seine Wirkung auf die endotheliale Monolayer-Kultur und EC / SMC Kokultur 1, 10 zu modellieren, um die Zellreaktion zu pathologisch hohen PI Krankheit zu untersuchen. Durch die verwendet werden, um diese Strömungs con Musterprotokoll beschreibtBedingungen, hoffen wir, andere bei der Bestimmung Flusssignal Beitrag zur Antwortzelle zu unterstützen.
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Protocol
1. Silanisierung und Biomolekül Funktionalisierung von Slide oder Polycarbonatmembran
Hinweis: Viele der Chemikalien und Lösungen innerhalb dieses Protokolls haben hohe Verdunstungsraten (Ethanol (EtOH), Aceton, etc.). Weitere Schritte zur Folge haben lange Inkubationszeiten für niedrige Verdampfungsraten. Paraffinfilm wird empfohlen, um Behälter zu versiegeln. Achtung: Viele der Chemikalien (einschließlich: Schwefelsäure, Aceton, (3-Aminopropyl) triethoxysilan, Glutaraldehyd, EtOH) als gefährlich oder flüchtig. Wenden Sicherheitsdatenblatt (MSDS) der einzelnen Materialien für die ordnungsgemäße Lagerung, Handhabung und Entsorgung vor dem Gebrauch.
- Legen Sie neue Objektträger Abmessungen 75 mm x 50 mm von 1 mm, in sauberen, Glasobjektträger Färbeschale ohne Rücksicht auf Orientierung, die Gewährleistung der vollen Immersion. Verwenden Sie Container für Schritte 1,1-1,12.
Hinweis: Für die Co-Kultur, sind Polycarbonat (PC) Membran mit 0,4 um Porengröße, der Größe von 75 mm × 50 mm geschnitten, für alle nachfolgenden steps für PC Funktionalisierung und EC Aussaat. - Tauchen Folie in Schwefelsäure (20%), O / N.
Achtung: Konsultieren MSDS für Schwefelsäure vor dem Gebrauch. - Indem in entionisiertem Wasser (DI) für 5 min, dreimal eingetaucht, Ändern DI jedes Mal waschen Folie.
- Einzutauchen Folie in Aceton für 30 min.
Achtung: Konsultieren MSDS für Aceton vor der Verwendung. - Einzutauchen Schieber in 6% (3-Aminopropyl) triethoxysilan / Aceton-Lösung, O / N.
Achtung: Konsultieren MSDS für (3-Aminopropyl) triethoxysilan und Aceton vor der Verwendung. - Einzutauchen Folie in Aceton 5 min, dreimal Wechsel Aceton jedesmal.
Achtung: Konsultieren MSDS für Aceton vor der Verwendung. - Durch in DI für 5 min dreimal Eintauchen, Ändern DI jedes Mal waschen Folie.
- Tauchen Folie in 1,5% Glutaraldehyd / DI-Lösung für 60 min.
Achtung: Konsultieren MSDS für Glutaraldehyd vor der Verwendung. - Durch in DI für 5 Minuten, zweimal eingetaucht, Ändern DI jedes Mal waschen Folie.
- Den Objektträgers in 70% Ethanol (EtOH) für 30 Minuten in sterilen Laminarströmungshaube.
- Entfernen EtOH und lassen verbleibende Rückstand verdampft. Tauchen Sie Folien in sterilem DI und Drain, um die Folien rehydrieren.
Hinweis: Die Objektträger oder PC-Membran kann in Glasobjekthalter bis zu einer Woche versiegelt und bei 4 ° C gelagert. Bei der Verwendung für die Zellkultur, wiederholen Sie die Schritte 1.10 und 1.11. - Entfernen Sie die Folie von der Objektträgerhalter und legen Sie sie in einen 100 mm mal 100 mm quadratischen Petrischale in der Sterilbank.
Anmerkung: Dieser Behälter wird für alle verbleibenden Schritte verwendet werden.- Bereiten Schlitten oder PC für die endotheliale Zellaussaat zur Monokultur-Experiment.
- Beschichten das funktionalisierte Folie oder PC (Schritt 1.11) mit 1 ml Fibronektin-Lösung (25 ug / ml), auf der einen Seite für den ungefähren Bereich an Zellkulturkammer ausgesetzt.
- Dias oder PC Inkubieren in sterilen Brutschrank bei 37 ° C für 1-2 h eingestellt.
- Nach der Inkubation, saugen Sie den verbleibenden Lösung unter Verwendung eines glass Aspirator Pipette mit einem Vakuum verbunden.
Hinweis: Die Objektträger können nun zur weiteren Verwendung gelagert O / N werden bei 4 ° C.
- Folgen 1.12.2 Schritte nur zur Herstellung von EG / SMC Co-Kultur. Bereiten Sie und Samen glatten Muskelzellen (SMC) Kultur für Co-Kultur-Experiment.
- Ort Silikondichtung auf der Oberseite des Schiebers (Schritt 1.11), mit den Abmessungen von 75 mm × 50 mm Außendurchmesser, Innendurchmesser von 50 mm bis 30 mm, einer Dicke von 0,5 mm und Perforationen, die mit Durchflusskammer-Vakuum auszurichten.
- Bereiten Sie 1 ml SMC in 10% FBS / DMEM Suspension. Neutralisieren 1 ml Lösung von 2 mg / ml Kollagen Typ-I mit 7% NaHCO 3 und 0,1 M NaOH-Lösung auf pH-Wert von 7,4 und mit SMC-Suspension mit der endgültigen Zelldichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu mischen.
- Verteilt SMC Lösung innerhalb Dichtung und inkubieren Objektträger bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min.
- Nach der Inkubation, bedecken die Objektträger mit 25 ml 0,1% fötalem Rinderserum (FBS) in Dulbeccos Modified vermischtEagle-Medium (DMEM) 72 h.
- Bereiten Schlitten oder PC für die endotheliale Zellaussaat zur Monokultur-Experiment.
- Kultur Endothelzellen (ECs) auf Glasobjektträger / Polycarbonat-Membran.
- Samen 1 ml ECs in 10% FBS / DMEM mit Anfangskonzentration von 6,0 x 10 5 Zellen / ml, auf Fibronectin Oberflächen der Glasträger oder Polycarbonatmembran.
- Inkubieren Zellen im Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und 10% FBS für 120 min.
- Deckgläser enthaltenden Zellen mit zusätzlichen 10% FBS / DMEM, und in Inkubator 37 ° C, 5% CO & sub2; O / N bis 70% -80% konfluent.
2. Bestimmung der Fluidviskosität und Volumendurchfluss
Hinweis: Rotierende Viskosimeter sind empfindliche Geräte, und das Viskosimeter Bedienungsanleitung sollte vor der Kalibrierung, Nullstellen, oder die Durchführung von Messungen herangezogen werden.
- Bestimmen Sie gewünschte Fluidscher (τ) aus der Literatur des Experiments die gezielte Gefäßsystem.
- Measure 1% FBS / DMEM-Viskosität (μ) mit einem Rotationsviskosimeter.
- Bestimmen Sie benötigten Volumenstrom (Q) von Poiseuille-Gleichung:
.
wobei τ = Fluidscherungs, μ = Viskosität, Q = vol. Durchfluss, w = Kammerbreite und h = Kammerhöhe). - Pumpenaggregat zur Durchflussmenge in Schritt 2.3 abgeleitet, und verwenden Sie für alle folgenden Schritte.
. 3. Bestimmung der Pulsatilitätsindex
Hinweis: Alle Verbindungsanschlüsse innerhalb des Systems sollte mit geeigneter Größe Lock-Ring-zu-Widerhaken oder weiblichen Luer-to-Widerhaken-Verbindungen angeschlossen werden. Verbindungs PVC-Schlauch kann dann auf Schlauchtüllen verbunden werden, und die Schaltung vervollständigt.
- Schließen Strömungskreislauf, wie in Abbildung 2, mit Dämpfungskammer (Abbildung 3) und Ultraschall-Durchflussmesser in der richtigen Flussrichtung.
Hinweis: Ultraschall-Durchflussmesser ist ein empfindliches Gerät, undDie Bedienungsanleitung sollte vor der Verwendung konsultiert werden. - Füllen Strömungskreislauf und das Reservoir mit DI-Wasser, indem sichergestellt wird, Reservoirauslass Rohr (zur Pumpe) in Speichervolumen eingetaucht. Visualisieren Flusswellenform mit einem Durchflussmesser.
- Öffnen Sie das Entlüftungsventil an der Dämpfungskammer Fluid / Luft-Volumenverhältnis zu ändern. Schließen Entlüftungsventil an verschiedenen Flüssigkeitsstand Abständen und berechnen Pulsatilitätsindex (PI = (V max - V Min) / V Mittelwert) unter Verwendung von Flusswellenformspitze (V max), Mulde (V min) und bedeutet (V Mittelwert). PI-Werten in Notebook.
- Mark resultierenden Flüssigkeitsstand und PI auf dem Dämpfungsraum mit einem Filz gekippt, permanent Tintenfeder für die zukünftige Verwendung. Bestimmen Sie die gewünschte PI Ebenen aus der Pathologie Literatur 11.
- Silikon-Schlauch Formation- Optionale, erweiterte Verfahren zur Steuerung Pulsatilität
- Mischen Sie das Silikon-Elastomer Basis und Härter in verschiedenen Verhältnissen (zB ein base-to-Vernetzer-Verhältnis von 10: 1 bis 36: 1.) für unterschiedliche Ziel Elastizitätsmoduli, wie zuvor dargestellt 2
- Herzustellen Silikonschläuche durch wiederholte Tauch Härtungsprozess, kurzes Eintauchen Stahlkanüle (14 g) in Silikon Prepolymermischung mit einem vorbestimmten Basis-Vernetzer-Verhältnis.
- Platzieren des Präpolymeren beschichteten Kanüle in einem Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden eingestellt, um die Polymerbeschichtung auf der Kanüle zu heilen, Umschalten der Richtung in der Mitte des Aushärtungsprozesses.
- Wiederholen Sie den Tauchverfahren mit der gleichen Siliconelastomermischung und legen Sie wieder in den Ofen für weitere 4 Stunden, die in ~ 0,3 mm dicken Rohren führt.
- Entfernen Sie die ultradünnen Silikonschlauch von der Edelstahlkanüle.
- Schließen Rohre zu fließen Kreis statt Dämpfungskammer und Test PI für jeden, wie in 3.3.
4. Pumpe Sterilisation
- Eintauchen der Strömungskammer (2), PVC-Schläuche und Dichtungen in 10% Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Waschen mit sterilem DI vor Schritt 4.
- Legen Sie die Blutpumpe auf einem Ersatz Inkubator Regal.
Anmerkung: Incubator Regalen sollten aus rostfreiem Stahl bestehen, und in der Lage, das Gewicht des gesamten Strömungskreislauf zu unterstützen. - Füllen des Strömungskreislaufs und der Behälter mit 10% H 2 O 2 durch Sicherstellung Reservoir Auslaßrohr (Pumpe) ist in Speichervolumen eingetaucht. Zirkulieren H 2 O 2 durch Pumpen durch Kreis für 20 Minuten in der Sterilbank mit UV-Licht auf.
- Aspirieren Sie die gesamte H 2 O 2 aus Schlauch und mit sterilem PBS durch Pumpen durch Strömungskreislauf.
5. Durchflusskammeranordnung
Hinweis: Die Durchflusskammer besteht aus einem Acryl, maßgeschneiderte Platte mit Vakuumöffnungen und Eintritts- und Austrittsströmungsöffnungen (siehe Abbildung 2). Kammeranordnung besteht aus der Platzierung der Flusskammer und Dichtungen auf der Oberseite des Kultur Dias, properly ausgerichtet ist, und wird nachfolgend beschrieben.
- Warm up 1% FBS / DMEM in einem 37 ° C Wasserbad und bereiten Flusskammer.
- Nehmen EG Rutsche von Medien (aus Schritt 1.13) und Ort Dichtung oben mit Zellseite nach oben.
- (Optional) Nehmen Sie PC-Membran von Medien (aus Schritt 1.13) und Ort Dichtung oben mit Zellseite nach oben. Zeigen Co-Kultur-Objektträger mit gesäten SMC (Schritt 1.12.2) unter PC-Membran.
- Ausrichten Vakuumkanal der Strömungskammer mit den Löchern in der Dichtung (Figur 2).
- Bringen Vakuumröhre, um Vakuumanschlüsse (Abbildung 2) zu gewährleisten, keine Medien Lecks Vakuum.
- Platz Polycarbonatfolie unterhalb Glasobjektträger und Klemmströmungskammeranordnung mit Federklemmen, eine auf jeder Seite der Flusskammer (2 und 5).
- Platz Strömungssystem im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2, und füllen Kreis mit Medien durch Pumpen aus gefüllten Vorratsbehälter bei niedrigen Pulsatilität.Halten Sie diese Fluss für 4 Stunden zur Vorkonditionierung Zellen.
- Passen Flüssigkeitsvolumen im Dämpfungsraum um deutliche PI-Ebene, und Kultur für die gewünschte Zeit ein.
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Representative Results
Wartung der Strömungsverhältnisse ist angewiesen auf korrekte Montage des Strömungskreislauf (Abbildung 1). Schlauchdurchmesser ist ein wichtiges Auswahl in Montage, mit größeren Durchmessern Reduktionsströmungswiderstand und anschließende Druckabfall vor und nach der Kulturkammer. Um vorgesehenen Druck und Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten, montieren Sie das System mit Durchflussmesser vor dem Experiment mit bestimmt Schläuche. Ausrichtung der Kulturkammer Vakuumkanal (Abbildung 2), mit Perforationen auf Silikondichtung (nicht abgebildet), unterhält versiegeln innerhalb des Strömungskreislauf. Zur Abdichtung zu gewährleisten, können Federklemmen verwendet werden, um zusätzlichen Druck auf die Dichtung anzuwenden. Glasobjektträger sollten von Polycarbonatfolie geschützt werden, geschnitten, um Kammerbereich (Abbildung 6) passen. Denn der Strömungsgeschwindigkeit kann zusätzlich zu Komplikationen bei der Aufrechterhaltung Dichtungen beitragen können Medien durch den Zusatz von Dextran verändert werden, um Medien-Viskosität erhöhen. Durch erhöhte viscoskeit, kann Fluid Scherung bei niedriger Geschwindigkeit aufrechterhalten werden. Systemantwort und Integrität in der Mitte des Experiments einfach durch Beobachten Füllstände und Fluid Farbe innerhalb der Dämpfungskammer und dem Reservoir (3) überprüft werden. Der Flüssigkeitsstand sollte einen konstanten Wert zu halten. Initial Flüssigkeitsstand sollte auf beiden Behälter und Dämpfungskammer für Checkup Vergleich gekennzeichnet. Einstellungen können durch die Zugabe von Medium bei dem Experiment Initiations zuzulassen oder Eintritt von Luft zur Dämpfungskammer durchgeführt werden. 4 stellt eine repräsentative Aufzeichnung der Strömungsgeschwindigkeit. Phenol Rotfärbung sollte im Verlauf des Experiments zu verringern. Bei Beendigung des Versuchs sollte Medien gestattet, aus dem Kreislauf zu entleeren und bei -80 ° C Gefrierschrank für zukünftige Messung oder zur Verwendung gelagert. Medien können für die Metabolit-Gehalt analysiert werden oder Zytokine, oder verwendet werden, um parakrine Signalisierung an Zellreaktionen zu überwachen, indem sie für die Zellkulture. Die Zellen können unter Phasenkontrastmikroskopie für die Morphologie und die Konfluenz (Abbildung 5) abgebildet werden. Spindel Morphologie in ECs nach HPF über 24 Stunden (Figur 7) beobachtet.
Abbildung 1. Flussschaltschema. Der Durchflussmesser innerhalb des Systems bezeichnet wird verwendet, um Pulsatilitätsindex Ebenen durch die Dämpfungskammer gesetzt zu messen. Flusswellenform sollte bestimmt Verbindungsrohrdurchmesser gemessen, um sicherzustellen, Systemdruck bleibt physiologischen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Durchfluss chamber Design und Messungen. Outer-Kanal wird zur Vakuum verbunden. Mittelbild zeigt Klemm der Kammer. Bild rechts zeigt Dichtungsdesign. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Durchflussdämpfungskammer. Flussdämpfungskammer schema anzeigt beabsichtigten Strömungsrichtung und Anschluss. Entlüftungsventil geöffnet wird, Auslassventil geschlossen ist, und Fluid füllt die Kammer auf die gewünschte PI Ebene. Beim Öffnen des Auslassventils und Schließen der Luftablassventil, Strömungs Lebensläufe und Flüssigkeitsspiegel in der Kammer hält Ebenen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 4. Probenflusswellen mit verschiedenen Pulsatilitätsindizes. Hohe Pulsatility Flow (links) und Low Pulsatility Flow (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Co-Kultur Fließschema. Co-Kultur zeigt pulsatile Strömung über Endothelzellen, mit glatten Muskelzellen in Kollagengel. Zytokin-Freisetzung aus den Zellen kann durch den porösen Polycarbonatmembran durchqueren. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Endothelial Zellmorphologie Änderungen mit Durchflussbedingungen. Confluent Endothelzellkultur auf funktionalisierte Polycarbonat-Membran. Dargestellt sind vor Strom (links) und nach Durchfluss (rechts). Strom wird unter unterschiedlichen Bedingungen, statische (kein Geschwindigkeit), steady (konstante Geschwindigkeit), High-Impuls (High Pulsatilität) gezeigt. Die Zellen werden mit 2% Kristallviolett gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Glatten MuskulaturZellproteinexpression verändert sich mit Durchflussbedingungen. Glatten Muskelzellen Expression von α-smooth muscle actin (SMA) und Myosin schwere Kette (SM-MHC) unter unterschiedlichen Bedingungen, statische (kein Geschwindigkeit), stetigen Fluss (konstante Geschwindigkeit) und hohen Puls. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Wiedergabe pulsatile Strömung in vitro und können instrument erste Schritt bei der Bestimmung Beitrag der Strömungsverhältnisse um Krankheiten Pathologien. Frühere Studien unter Verwendung dieses Protokolls haben festgestellt, Strömungsverhältnisse tragen zu Gefäßentzündungsreaktion. 1, 10 Darüber hinaus dieses Protokoll ist für erfahrene Labors vorgesehen. Als solche weder eingehend Fluidmechanik und auch biochemischen Analyse wird hier beschrieben. Für fortgeschrittene Fluiddynamik, 1 und fortgeschrittene Techniken finden Sie in der Literatur 2 Kritisch in die Kultivierung von Zellen unter Fluidscher über längere Zeiträume sind:. 1) Aufrechterhaltung eines abgedichteten Strömungskreislauf, mit Ausnahme der Vorratsbehälter, und 2) zu verhindern Verunreinigung während des Experiments. Abdichten des Strömungskreislauf ist wesentlich für die Erhaltung Medienvolumen und korrekte PI Ebenen, mit Einführung der unbeabsichtigten Luft beeinflussen gewünschten Strömungsparameter. Zusätzliche Luft in das System pFluss artially behindern innerhalb des Stroms, stören Strömungspfad und zur Verbesserung der Einhaltung des Gesamtsystems. Während Volumenströme aufrechterhalten werden würde, verringerte Querschnittsfläche von dieser teilweise Verstopfung würde lokalisierten Anstieg der Geschwindigkeit und Oberflächenfehler führen. Beide Strömungsgeschwindigkeit Variation und Oberflächendiskontinuitäten würde dazu beitragen, fließen Destabilisierung und möglicherweise Turbulenzen. Schließlich wäre eine eingeschlossene Luft in die unter Druck stehende Strömungssystem nach einem komprimierbaren Dämpfung des Strömungs handeln, wodurch der PI von seinem gewünschten Niveau ab. Da der Strömungskreislauf eine konstante Lautstärke, eingeschlossene Luft auch Austreten von Medien, die Auswirkungen Zellen nachteilig beeinflussen kann dazu führen, zunehmende Metabolitenkonzentration über die Zeit. Blutpumpe Dichtheit und Funktion sind abhängig von der Temperatur, damit die Anordnung der Pumpe in dem Inkubator können Dicht Komplikationen einzuführen. Sowohl verstärkte Präsenz von Luft innerhalb des Strömungskreislauf und den Verlust von Medien durch Pumpendichtung oder Funktionsstörungention könnte Variabilität der Zellumgebung zu erhöhen und führen zu ungenauen Ergebnissen. Verhinderung von Verunreinigung während des Experiments ist in allen Zellkultur wichtig. Abdichtung der Strömungskreislauf muss noch einmal betont werden, um Eintritt von Verunreinigungen sowie zu verhindern. Durchflussmedien bietet viele Nährstoffe und Zucker für das Wachstum von Mikroorganismen notwendig, so dass eine Reinigung der Schaltung unmittelbar nach dem Gebrauch erforderlich ist. Darüber hinaus wird eine undurchsichtige Pumpendeckel reduziert Wirksamkeit von UV-Strahlung in der Sterilisation des gesamten Pumpe. Dies, zusammen mit der Inkompatibilität der Acryl Kolben mit Ethanol, erfordert die vollständige Sterilisation der Schaltung unter Verwendung von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Verhinderung der Kontamination Wachstum, wenn das System nicht in Verwendung ist, die Verwendung von Sterilisationslösung und die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung alle Komplikationen können entweder indem Verunreinigungen oder Sterilisieren Zellkultur einzuführen. Einschränkungen dieser Technik gehören die Unfähigkeit, richtigely Modell der komplexen Strömungswelle in physiologische Durchblutung. Während das Strömungssystem bietet zwar eine gute Annäherung, können verschiedene Aspekte der komplexen Wellenform in physiologischer Strömungs gesehen nicht kontrolliert oder geändert werden. Auch Umkehrschubspannung in hin- und hergehende Strömung ist eine Komplikation in irgendeiner Arterienerkrankung angesehen und kann nicht durch diese Strömungssystem repliziert. Zusätzlich könnte Langzeitstudie von Zellantwort komplizierter und herausfordernd sein, was hauptsächlich auf die Leistung der Pumpe. Reduzieren der nachgeschalteten Widerstand ist wesentlich, um die Integrität des Strömungssystems und Pumpeffizienz aufrechtzuerhalten. Des Weiteren verwendet das obige System Glasträger und Polycarbonat-Membranen, die nicht physiologisch Modell besitzt das Gefäßsystem und keine mechanische Signalisierung einer arteriellen Dehnung oder Basalmembran Steifigkeit resultierende berücksichtigen. Zuvor hat eine Studie eine pulsierende System wiedergeben können pulsatilen Fluss mit Spritzenpumpen verwendet 1 2. Wirksamkeit des Systems in reproducing die hohe PI könnte durch Einschränkungen bei der Pumpendrehzahl und Dicht betroffen sein. Das Verfahren zur Dämpfungskammer ist in ihrer Anwendung zusätzlich einfacher, Pumpe-Programmierung erforderlich ist. Zukünftige Anwendungen des Strömungssystems wäre die mechanische Signalisierung infolge der arteriellen Dehnung durch den Einbau von elastischen Schläuchen, um die Strömungskammer und Schieber ersetzen können. Durch diese Verbesserung kann nicht übereinstimm Einhaltung und luminale Oberfläche Diskontinuitäten weiter untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Finanzierungsquellen, einschließlich der AHA (13GRNT16990019 zu WT) und NHLBI (HL097246 und HL119371 zu WT) zu quittieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
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